流式病毒檢測法的應用進展

摘 要： 流式病毒檢測法（flow virometry，FVM）是一種利用流式細胞儀檢測單個病毒顆粒及其特征的前沿技術。通過FVM，可以精確測量樣本中完整病毒顆粒的濃度、表面靶抗原的豐富度以及相對直徑等關鍵參數，進而實現對單個病毒顆粒的高效分析和表征。隨著儀器設備、熒光染料和標記策略的不斷發展和優化，FVM得到了廣泛的應用和研究。該方法不僅被用于實現對單個病毒顆粒的精確分析，還被用于細胞外泌體和微囊泡的檢測。本文總結了FVM的發展歷程以及病毒等微顆粒的常用標記方法和應用領域，旨在為FVM在病毒學、免疫學、生物醫學等研究領域的進一步應用提供參考和借鑒。

關鍵詞： 流式病毒檢測法；流式細胞術；病毒和外泌體標記

中圖分類號：R392-33;S859.797

文獻標志碼：A

文章編號：0366-6964（2024）11-4840-12

收稿日期：2023-12-11

基金項目：“十四五”國家重點研發計劃（2021YFD1801105）；國家自然科學基金（32373026）；中央高校基本科研業務費（2662023DKPY004）

作者簡介：卿 霆（2000-），女，云南大理人，碩士生，主要從事畜禽獲得性免疫研究，E-mail：beining@webmail.hzau.edu.cn

*通信作者：司有輝，主要從事畜禽獲得性免疫研究，E-mail：youhui@mail.hzau.edu.cn；王秀羽，主要從事畜禽獲得性免疫研究，E-mail：Jony_WXYu@webmail.hzau.edu.cn

Application Progress in Flow Virometry

QING" Ting， OUYANG" Hehao， PAN" Qicong， ZHU" Bibo， YE" Jing， CAO" Shengbo， WANG" Xiuyu*， SI" Youhui*

（National Key Laboratory of Agricultural Microbiology， Huazhong Agricultural University，

Wuhan 430070，" China）

Abstract：" Flow virometry （FVM） represents a cutting-edge technological approach leveraging flow cytometry for the precise detection and analysis of individual virus particles and their unique characteristics. This innovative method offers a novel means of detecting， quantifying， and characterizing individual virus particles. FVM enables the determination of various parameters including the concentration of intact virus particles， the abundance of specific target antigens present on the virus surface， and the relative diameter of the viruses. Within the field of technique， FVM extends beyond virus analysis， allowing for the effective detection and characterization of exosomes and microvesicles originating from cells. With the continuous development and optimization of instruments， fluorescent dyes and labeling strategies， FVM has been widely used and studied. This paper summarizes the development history of FVM， as well as the common labeling methods and application fields of viruses and other microparticles， aiming to provide reference for the further application of FVM in virology， immunology， biomedics and other research fields.

Key words： flow virometry; flow cytometry; virus and exosome labeling

*Corresponding authors：" SI Youhui， E-mail： youhui@mail.hzau.edu.cn; WANG Xiuyu， E-mail： Jony_WXYu@webmail.hzau.edu.cn

流式細胞術（flow cytometry，FCM）是基于流式細胞儀，通過檢測散射或偶聯的熒光信號從而快速、準確、客觀、高通量地獲得懸浮微粒的一系列重要生物物理、生物化學相關特征性參量的技術［1］。其用途包括檢測單細胞、細胞群或細胞上的抗原［2］，通過使用分辨率更高、精確校正過的流式細胞儀，并將微粒進行有效標記，流式細胞術領域的最新進展已經允許表征尺寸在100～1 000 nm的微粒，這些微粒可以是源自細胞的外泌體和微囊泡，也可以是小細菌或病毒［3］。因此，衍生出了運用于單個病毒顆粒的定量分析和表征的流式細胞術，稱為流式病毒檢測法（flow virometry， FVM）。該方法于2013年由Arakelyan等［4］學者首次提出并命名，他們的研究也揭開了流式細胞術運用于病毒表征的序幕。與傳統的流式細胞染色程序類似，FVM通過目前可行的方法對病毒進行熒光標記，然后利用流式細胞儀檢測其發出的散射光或者熒光，進而對目標病毒進行可視化分析，直觀地展示病毒顆粒的特征和表面抗原分布，實現對單個病毒顆粒的精確分析。

1 FVM的簡介

FCM能快速、準確、客觀、高通量地獲得懸浮微粒的一系列重要特征性參量，如數量、大小、表面抗原組成等［5］，其主要原理是激光束擊中在定向流體中移動的懸浮顆粒，流式細胞儀會發出光散射和熒光信號，以這兩種光學信號分析出顆粒的一系列參數［6］。這一技術的產生和應用，極大地促進了微生物學、免疫學等的發展。當單個顆粒被流式細胞儀的激光源照射時，設備可以采集到三種光信號，前向散射光（FSC）、側向散射光（SSC）和熒光信號。前向散射光與顆粒大小成比例，側向散射光與顆粒的形狀以及顆粒內部的復雜性相關，熒光信號來源包括：1）顆粒中固有的熒光蛋白或熒光分子（如核黃素、細胞色素等）；2）通過基因工程構建的熒光蛋白［7-8］；3）與微粒表面抗原特異連接的熒光抗體［5］；4）對顆粒成分進行染色的熒光染料［9-13］。早期的流式細胞儀對檢測樣品的大小和類型有嚴格的要求，由于病毒顆粒大小通常在設備檢測閾值之下，且設備分辨率低、精度不高、背景噪聲干擾強、染料特異性和效果差等原因，無法檢測到病毒顆粒的相關特征參數。隨著FCM研究的深入，高分辨率流式細胞儀的開發［14］、高效染色技術以及染料的研發、磁性納米顆粒和中等微球等支架的應用［4，15］，使得FCM應用于病毒表征成為可能，并在表征病毒的基礎上，實現對外泌體、微囊泡等的檢測。

2 FVM的應用領域

2.1 FVM應用于病毒顆粒檢測

1979年Hercher等［14］設計了特制的流式細胞儀，能夠根據光的散射譜從背景噪聲或呼腸孤病毒（60～80 nm）種群中清晰地檢測到T2噬菌體（60 nm頭部和120 nm尾部）。1998年，Marie等［10］使用新型核酸染料SYBR Green-I標記海洋噬菌體并運用流式細胞儀進行定量分析。隨著各項技術的進步，流式細胞儀檢測病毒的范圍從較大的DNA病毒進一步擴展到桿狀病毒科、皰疹病毒科、藻狀病毒科、小核糖病毒科、逆轉錄病毒科和虹吸病毒科等不同科屬病毒［16］。2013年，Arakelyan等［4］首次命名了流式病毒檢測法，他們使用該技術對培養的HIV-1病毒顆粒上兩種抗原分布情況進行了研究，實現病毒種群中顆粒異質性水平的檢測。2014年Martínez等［17］基于FVM的原理，通過熒光激活分選和全基因組擴展，集群了水樣中離散的病毒顆粒從而生成了富含dsDNA的病毒組。隨著FVM的改進，越來越多研究人員使用該方法對各類病毒進行分選、集群［4，12，15，18-19］，并將其運用到臨床實踐中（第3節詳述）。2017年Arakelyan等［18］使用 15 nm 的磁性納米顆粒 （MNP）與識別革登病毒表面抗原的抗體偶聯對革登病毒進行免疫捕獲，并將捕獲的病毒粒子與熒光抗體一起孵育，然后使用常規流式細胞儀進行分析，該研究提供了使用FVM來研究單個登革病毒粒子（DENV）的成熟示范。2017年Khalil等［20］使用流式細胞儀對培養的變形蟲上清液進行高通量分選，成功分離出具有活性的巨型病毒。小鼠白血病病毒 （MLV）作為逆轉錄病毒的研究模型，對人類研究HIV具有重要意義，但人類對MLV的一些生物學信息仍然知之甚少，主要原因是樣品中存在可溶性病毒蛋白、有缺陷的病毒和細胞外囊泡的干擾，導致試驗中研究人員難以對樣本中的完整MLV顆粒總數進行計數。2020年，Renner等［21］以病毒包膜糖蛋白（Env）和單分散光的散射特性作為完整病毒顆粒的鑒別參數，通過FVM分析了Moloney MLV（M-MLV）顆粒含有的病毒RNA基因組對，從而計算出完整病毒顆粒的感染率，該研究為廣泛研究的原型逆轉錄病毒（MLV）的特征提供了新的見解。2019年COVID-19爆發后，為了快速對群體進行篩查，科學家們紛紛嘗試使用FVM對臨床樣品進行高通量、快速分選。2020年Soni等［22］將采集的鼻拭子和咽拭子與特定的一抗孵育再用二抗與之作用從而使用FVM實現了對SARS-CoV-2的定性檢測。2022年，Hussain等［23］開發出小型流式病毒檢測設備，能夠從患者唾液中直接快速且靈敏地檢測SARS-CoV-2。2022年，Abraham和Wood［24］利用FMV的優勢，使用重組寨卡包膜（E）蛋白開發了一種檢測寨卡病毒的方法，基于E蛋白的FVM能夠檢測來自寨卡病毒感染患者、寨卡病毒感染小鼠和重組寨卡E蛋白免疫小鼠的抗寨卡E蛋白的抗體。這是第一個可用于寨卡病毒檢測的基于FVM的診斷方法，其快速的檢測時間和較高的精確度可用于提高寨卡病毒檢測的準確性，彌補了ELISA和RT-PCR不能滿足高通量篩選、不適合在病毒爆發期間對大量樣本進行緊急篩選的缺點。2023年，在FVM的基礎上，Samman等［25］開發了一種新型的磁性納米顆粒——MICaFVi，該納米顆粒能夠高通量且特異性地捕獲SARS-CoV-2。經過數十年的發展，FVM已經能夠實現對多種病毒顆粒的特異性、高通量分選和表面抗原分析，極大地促進了病毒學研究。

2.2 FVM應用于外泌體和微囊泡檢測

外泌體和微囊泡是源自細胞的含有多種細胞成分的脂質膜性囊泡［26］。研究表明，外泌體和囊泡廣泛參與機體諸多病理過程，如炎癥和腫瘤，參與許多病毒的復制和感染過程，如：HIV、HBV、HCV、SARS-CoV-2等［27］，同時還能影響機體的免疫應答。

2011年，Nolte-‘T Hoen等［28］運用流式細胞儀定量分析了源自細胞的微囊泡，并實現囊泡表面特異性蛋白的定性以及由不同方式激活的樹突狀細胞（DCs）產生的囊泡的分群。2012年van der Vlist 等［29］基于FVM原理，從混合樣本中識別出不同的囊泡亞群并分析了囊泡亞群的動態變化。接下來，科研工作者們運用更精密的流式細胞儀和更優越的標記方法實現了從血液、尿液等樣品中檢測納米級囊泡［30-31］。2017年，Arakelyan等［18］用FVM檢測登革病毒顆粒及釋放到血液中的囊泡，嘗試從病毒外泌體和微囊泡中分離病毒顆粒。新冠疫情爆發后，科研工作者發現外泌體疫苗在啟動機體產生抵抗SARS-CoV-2的免疫保護發揮良好效應［27］，但由于外泌體和微囊泡的直徑與病毒顆粒相當［32］，而且多分離自血漿、組織液、腦脊液、細胞液等含有復雜成分的液體中，所以想要特異性地分離外泌體和微囊泡還需要排除這些液體中原有成分的干擾，分離難度巨大。目前，科研工作者正在探索參考FVM的標準以期實現外泌體等微顆粒的快速、高通量的分選。

2.3 FVM應用于其他檢測

2019年Szczotka等［33］將PNA/FITC端粒探針與牛淋巴細胞和 1301 細胞系雜交，然后通過FVM進行檢測，該研究表明，牛白血病病毒（BLV）感染牛的端粒熒光強度顯著低于健康牛，BLV陽性牛細胞的相對端粒長度（RTL）值（31.63±12.62）低于對照組的38.43±4.03，該研究展示了FVM可以通過測量端粒長度來間接檢測牛的BLV感染。2020年Burnie等［34］通過流式細胞儀的光散射和熒光信號實現了對HIV-1假病毒顆粒的檢測和表面抗原的表征，定量了假病毒囊膜中的三種細胞蛋白（整合素α4β7、CD14和CD162/PSGL-1），表明除了α81β4、CD7和CD14/PSGL-162之外，還可以在HIV假病毒粒子的表面同時檢測到其他兩種抗原。研究人員還將FVM應用在了疫苗質量的監測中［35-36］。2021年，為探究活疫苗生產和使用過程中病毒顆粒的畸形率，Ricci等［37］運用FVM快速且高通量地監測了默沙東埃博拉病毒疫苗（ERVEBO）中病毒粒子的畸形率，并得出疫苗效力與病毒畸形率的相關性，為活病毒疫苗生產過程中的質量監控提供了新方法。2022年，Prout等［38］應用FVM來監控由表達SARS-CoV-2 S蛋白的重組病毒載體生產的COVID-19候選疫苗。2023年Safford等［39］使用優化的FVM檢測水樣品中的T4噬菌體和其他病毒以增強水質監測。隨著研究的深入，流式病毒檢測法應用在了越來越多的領域，展示了其廣泛的應用范圍和獨特的發展前景。

3 流式病毒檢測中的標記方法及具體應用

熒光標記物可直接偶聯或通過化學反應實現對病毒等微粒的熒光標記，直接偶聯主要是親生物組分（核酸、脂類、蛋白）的染料或量子點（QDs）通過吸附的方式實現對病毒的熒光標記［9-14，40-42］，化學反應需要熒光標記物與病毒等微粒表面抗原蛋白的-NH2或-COOH發生化學反應從而實現標記［43-44］。近年來，生物正交反應在病毒等微粒組分的功能化修飾中發揮巨大作用，進而推動了病毒熒光標記的發展。Hao等［42］使用攜帶環炔的量子點偶聯疊氮分子修飾過的痘病毒，該研究以生物正交反應實現了病毒的熒光標記。

由于病毒等微粒結構的特殊性，直接標記法無法標記病毒的內部組分，而且熒光標記物對病毒的化學修飾會對其感染力造成一定影響，因此，為進一步研究病毒的感染力，近年來基于生物代謝過程的標記方法開始展現其在病毒標記方面的優勢［45-50］。

3.1 傳統的熒光染料染色

DAPI（4′，6-二脒基-2-苯基吲哚）是第一種應用于病毒顆粒染色的特異性熒光染料［40］，與DNA具有較強的結合能力。1998年，Marie等［10］使用新型SYBR Green-I核酸染料標記海洋噬菌體并運用流式細胞儀進行定量分析，結果表明SYBR Green-I核酸染料具有良好的染色特性，運用流式細胞儀能直接對天然海水樣品進行快速檢測，且結果較落射熒光顯微鏡（Epi-Fluorescent Microscope，EFM）略高。隨著研究的深入，流式細胞儀分辨率的提高和新一代熒光染色劑的出現顯著提高了FVM的檢測范圍和靈敏度。2000年，Chen等［11］證明用流式細胞儀對海洋病毒進行計數時，使用SYBR Gold核酸熒光染料發出的熒光強度比SYBR Green-I高兩倍，且穩定性更好。2012年，Loret等［12］應用流式細胞術通過核酸熒光染料Syto-13標記單純皰疹病毒Ⅰ型的基因組，然后在病毒復制過程中對核衣殼的中間產物進行分類。這是流式細胞術用于純化細胞內病毒的成熟中間體的首次報道，為研究病毒的衣殼組裝、成熟和排出開辟了新的途徑。

除了核酸染料（Syto-11、Hoechst 33342［12］、YOYO-1［9］等）外，還有蛋白質熒光染料，如異硫氰酸熒光素（FITC）［51］等，親脂性膜熒光染料，如：Dil［52］、DiD［53］、DiO［54］等。越來越多熒光染料的出現，顯著提高了FVM的適用性。但直接使用熒光染料標記病毒等微粒存在諸多問題［55-56］：1）很多熒光染料不穩定會在短時間內淬滅，不利于耗時長的試驗程序；2）熒光染料標記效率不定，部分染料標記效果差；3）熒光染料染色后，可能會使結果的背景噪聲強；4）大部分熒光染料有毒性，不利于后續病毒顆粒傳染性的研究；5）大部分熒光染料致癌，對人體健康有害。

3.2 通過偶聯支架的標記

直接使用流式細胞儀檢測病毒顆粒受到諸多物理因素的限制［14］，特別是一些直徑小于100 nm的RNA病毒，它們遠超出商用流式細胞儀的光散射檢測范圍，而且由于基因組過小，使用熒光染料染色效果也不理想［16］，所以可以通過在病毒上偶聯微球等磁性納米顆粒支架來克服這一困難。借助微球等磁性納米顆粒上的特異光學信號（如散射光或者熒光信號）來實現病毒顆粒的分類。2005年，Yan等［15］使用與抗體偶聯的微球捕獲并通過流式細胞儀區分甲型流感病毒和乙型流感病毒。2013年Arakelyan等［4］在流式病毒檢測法中利用磁性納米顆粒來捕獲HIV-1。2015年Arakelyan等［18］又用該方法捕獲了登革病毒。這種偶聯支架的方式不僅可以應用于病毒的定量，還可以對病毒表面的組分進行檢測。隨著研究的深入，越來越多的熒光染料偶聯納米材料應用于細胞或病毒成像［57］、抗原分析。2020年Sanjaya等［19］使用磁性和熒光納米顆粒成功測定登革熱病毒抗原NS1的濃度，該研究以夾心免疫測定形式將抗體與磁性和熒光納米顆粒偶聯，當NS1存在于樣品中時，這些納米顆粒形成簇，并且簇的形成與抗原的濃度成正比以此來確定NS1的濃度。

3.3 基于免疫學原理的抗原抗體特異性標記

運用抗原抗體特異性結合的能力，可以顯著提高病毒等顆粒的標記效果并對病毒進行免疫表型分析。抗體具有特異性標記單個蛋白或蛋白修飾的能力，可以作為標記目標顆粒上蛋白分子的一種工具。2014年Landowsik等［58］首次使用抗體直接標記尼帕病毒的糖蛋白，并用流式細胞儀進行定量檢測。還有科研人員使用單克隆抗體、非中和抗體標記病毒［9］。相較于其他標記方法，將熒光團等偶聯到抗體上形成的熒光抗體［59］具有特異性強、操作方便、分辨率高等優點，成為FVM中最常用的標記病毒方法。此外，科研工作者還使用熒光抗體和羥基化的中等微球共標記病毒［15］，或使用熒光抗體和磁性納米顆粒共標記病毒［4］。

3.4 熒光團偶聯化合物的熒光探針或特殊分子偶聯化合物的分子探針標記

將熒光團或特殊分子與適當化合物偶聯，可形成用于標記病毒的熒光探針或分子探針，這種標記方法具有靈敏度高、時空分辨率高、樣品制劑損傷小等優點。常見的熒光團有PE、APC、PercP、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 647、SiR、量子點（QDs）等，不同的熒光團有不同的激發波長和發射波長，可以根據檢測需求對發射光源進行調整。常見的特殊分子有疊氮基、生物素（將在“3.6”、“3.8”中詳述）、標簽［50，60-64］等，常見用于偶聯的化合物有抗體、納米材料四聚乙二醇（PEG4）［41-42］和聚馬來酸十六醇酯（PMAH）［41］、二氟環辛（DIFO）、二苯并環辛炔（DBCO）［42，65］等。當靶向病毒組分的熒光探針或分子探針成功標記病毒后，可以通過流式細胞儀的熒光通道或者光散射通道對其進行分析。

QDs是一種新型半導體納米材料，由化學周期表中IIB族和VIA族元素組成，磷光性質比傳統染料更優越，即QDs具有更高的光穩定性，更寬且連續分布的激發光譜、更窄且對稱的發射峰［66］。1998年量子點首次應用于生物成像，通過特殊方法反應可以將量子點標記到病毒上［41-42，64，67-68］實現病毒標記。借助QDs，科研工作者實現了水皰性口炎病毒（VSV）表面糖類的標記［69］、乙型腦炎病毒的追蹤［70］、人腸病毒71型（EV71）的標記及其受體研究［71］。

在研究過程中，為了提高病毒標記的效果，2015年，Lu等［13］將噻唑橙（TO）和苯乙烯化合物（C61）偶聯發明了一種新型熒光探針Styryl-TO，成功標記了活細胞中的單鏈DNA和RNA，TO是一種高熒光產量的染料，可以作為一個平臺去偶聯其他分子以開發針對不同核酸的熒光探針［72-74］，所以在病毒標記中這種新型化合物有其廣泛的使用價值。

3.5 基因工程標記

將熒光蛋白（fluorescent protein，FP）的DNA序列構建到病毒蛋白的ORF中從而實現FP對病毒的熒光標記［7-8，75-76］。理論上，這是最有效的熒光標記技術，因為可以在病毒不同組分上構建不同顏色的熒光蛋白以實現同步標記，而且減少了熒光染料對病毒結構和感染性的影響。但是基因工程標記病毒操作繁瑣、工作量大，而且熒光蛋白尺寸大，限制了該方法的應用。此外，該技術只能用于病毒蛋白標記而不適用于其他組分。

3.6 生物正交標記

2003年卡羅琳娜·貝爾托西提出生物正交反應（Bioorthogonal reaction））的概念，這是指一類可以跟隨細胞或病毒等微粒代謝（如病毒復制、出芽）過程，并且在不干擾原有生化反應條件的情況下進行的化學反應［77］。首先需要在宿主細胞培養基中加入攜帶特定反應基團（例如：疊氮、炔烴、醛基、烯烴）的物質，標記宿主細胞，然后隨著病毒在宿主細胞中的侵染過程，完成病毒組分的標記，最后加入含有對應基團的探針以此實現對目標物質的熒光標記。該反應已被廣泛地應用于細胞、病毒等的生物大分子的功能化修飾［47，50，65，78-81］。所以基于生物正交反應，對病毒組分進行疊氮、酮基等標記，然后用熒光團或量子點等標記的磷化氫化合物探針、炔基探針、肼基探針等可以實現對病毒的直接標記或代謝標記。當前研究中，有幾個生物正交反應被證明可以有效標記細胞、病毒等顆粒，如醛酮和酰肼反應［46］、Diels-Alder反應［81］、Staudinger Ligation［82-83］、CuAAC［47，80］、SPAAC［41-42，48，51，80，84］。

3.6.1 醛酮和酰肼反應

醛酮和酰肼的反應是最早被研究的生物正交反應之一，該反應可用于標記糖蛋白［45］，將酮基化合物直接或者代謝標記到細胞等顆粒上，然后用熒光標記的肼基探針實現細胞的熒光標記。Mahal等［46］首次提出利用寡聚糖生物合成途徑標記細胞，N-乙酰-甘露胺可以在細胞中被轉化為唾液酸然后并入細胞表面成為酮基化的寡聚糖。在生理條件下，這種酮基化的糖蛋白可以被熒光肼基探針標記，因此可用酮基標記細胞表面的糖蛋白，然后在囊膜病毒出芽過程中實現病毒酮基化，最后用流式細胞術檢測出熒光肼基探針標記過的病毒。但該反應對pH敏感，并且在生理條件下反應速率較慢，所以逐漸被其他生物正交反應取代。

3.6.2 Diels-Alder反應

1950年的諾貝爾化學獎頒發給了狄爾斯-阿爾德反應（Diels-Alder cycloaddition，即D-A反應），該反應是通過［4+2］環加成反應連接雙烯體物質和親雙烯體物質。逆電子需求的D-A反應（IEDDA）是當前研究中發現的最快的生物正交反應［85-86］。Devaraj等［81］使用該反應標記細胞表面蛋白。有學者以非天然糖代謝為基礎，在宿主細胞膜的糖蛋白上引入環丙烯基團，然后利用IEDDA反應使環丙烯基團與四嗪修飾的熒光探針相互作用，實現了活細胞表面糖蛋白的特異性標記［87］。Huang等［88］利用該反應在牛痘病毒和脊髓灰質炎病毒代謝過程中將5-乙烯基-2′-脫氧尿苷（VdU）摻入病毒基因組，然后用Cy5-Tz實現標記。

3.6.3 施陶丁格偶聯反應

1919年，Staudinger提出Staudinger偶聯反應，這是疊氮基團和膦基酯發生的反應［89］。2003年Lemieux等［82］發明了一種含氟香豆素膦染料，并用Staudinger Ligation反應與疊氮化物連接，成功實現蛋白質標記。此后該反應被廣泛應用于生物標記［89］。還有研究者將哺乳動物細胞與過乙酰化疊氮甘露胺（Ac4ManNAz）共孵育，使細胞在其自身的唾液酸合成途徑中利用Ac4ManNAz合成疊氮乙酰唾液酸（SiaNAz），后者取代唾液酸并入細胞表面，然后使用膦熒光探針實現細胞表面糖蛋白標記［83］。2017年Sundhoro等［90］創新性地發明了多氟苯基疊氮（PFAA），它與芳香膦的反應比傳統的Staudinger Ligation反應快1 940倍。研究人員將PFAA連接到乙酰化的甘露糖、半乳糖中設計成探針，成功實現細胞表面的高效率標記。因此可以考慮在病毒出芽過程中用該方法實現病毒標記。

3.6.4 CuAAC

卡爾·巴里·夏普萊斯發現的由銅離子催化疊氮基團和末端炔烴之間進行的點擊化學反應（Click reaction）被諸多實驗室嘗試用于生物分子的標記和研究［91］，這是一種效率更高的生物標記方法。該反應首次于2003年成功應用于豇豆花葉病毒外表面蛋白質標記［92］。2008年，Jao和 Salic［47］將5′-乙炔基-2′脫氧鳥苷（EdU）和5′-乙基尿苷（EU）利用CuAAC反應與熒光疊氮化合物（Alexa594 azide）反應成功標記細胞DNA和RNA，該方法有望在病毒復制時實現標記。該反應雖然速度快、化學區域選擇性高，但銅離子對生物分子的毒性作用也限制了該反應在生物標記方面的應用。近年來科研工作者們基于CuAAC反應開展了諸多研究，不斷擴大其適用領域［93］。

3.6.5 SPAAC

2004年，Agard等［51］提出了“無銅點擊化學（copper free click chemistry）”反應，即張力促進的疊氮-炔基環加成反應（SPAAC）。該反應標記細胞、病毒等微粒，反應特異性強，而且不存在銅離子的生物毒性［80］，科研人員用該方法實現了細胞表面的糖蛋白標記［51］和脂類的熒光標記［94］。2012年我國學者用疊氮化合物azide-PEG4-NHS孵育流感病毒，然后利用SPAAC反應成功實現用DBCO-QDs標記流感病毒［42］。Rubino等［79］首次證明，非囊膜病毒可以使用疊氮糖代謝標記纖維蛋白，在該研究中，研究者使用疊氮丙氨酸（Aha）或O-乙酰氨基葡萄糖（O-GlcNAc）這兩種含有疊氮官能團的化合物孵育腺病毒，然后用含有熒光TAMRA的炔探針成功實現標記。還有學者先將DBCO-PEG4-NHS引入桿狀病毒表面，將未結合的DBCO用凝膠過濾去除后，再加入N3-PMAH-QDs成功實現標記［41］。

2015年，Zhao等［48］通過蛋白質糖基化過程將疊氮糖Ac4ManNA和Ac4GalNAz結合到宿主細胞糖蛋白中，在麻疹病毒出芽過程中實現疊氮標記，之后通過SPAAC反應實現熒光標記，研究還發現，修飾后的麻疹病毒大小、異質性、TCID50基本無變化。2017年Pan等［65］發展出一種活體內原位標記、示蹤流感病毒的新技術，該技術通過病毒細胞脂類代謝將膽堿衍生物——疊氮乙酰膽堿（AE-Cho）的疊氮基修飾到病毒囊膜上，然后用DBCO-熒光探針實現標記。在后續研究中，有資料表明可以用疊氮高丙氨酸標記牛痘病毒和脊髓灰質炎病毒蛋白質［88］，用乙烯脫氧尿苷標記痘病毒DNA［95］。近年來新型環辛炔類似物，例如DIFO、BARAC、BCN的出現，使得SPAAC反應的速率和標記物與目標分子的生物相容性得到不同程度的提升。

3.7 分子光開關標記

分子開關泛指結構上組織化了的具有“開/關”功能的化學體系［96］。非放射性核酸熒光分子開關因其具有方便、快速、靈敏度高和安全等特點而備受關注。DNA分子光開關釕（Ⅱ）吡啶配合物熱力學穩定，具有獨特的DNA結合能力［97］，DNA分子光開關釕（Ⅱ）吡啶配合物特指一類在水溶液中不發光或微弱發光，在加入DNA后發光強度顯著增強的金屬配合物［98］。該配合物（［Ru（phen）2（dppz）］2+）于1990年由Barton合成，其激發波長為400 nm，發射波長為600 nm。2012年Zhou等［76］使用［Ru（phen）2（dppz）］2+成功標記桿狀病毒和宿主細胞基因組，研究結果還表明，使用該方法標記后不影響子代病毒的產生。2013年，Huang等［88］使用［Ru（phen）2（dppz）］2+成功標記牛痘病毒基因組。2023年，Wang等［99］合成了一種新的釕（II）多吡啶配合物——［Ru（dmb）2dppz- idzo］2+ （dmb=4，4′ -二甲基-2，2′ -聯吡啶，dppz-idzo=dppz-咪唑酮），研究發現該化合物可以作為雙鏈RNA的熒光探針，并顯著提高RNA雙鏈的穩定性，所以在雙鏈RNA病毒的研究中可以考慮使用該配合物進行標記。

3.8 生物素和鏈霉親和素系統標記

生物素-親和素系統（Biotin-Avidin-System， BAS）是70年代發展起來的一種新型生物反應放大系統，該方法已經成為定位觀察、抗體定性等研究的新技術［100］。鏈霉親和素較親和素更容易與細胞表面的多糖、脂質等發生非特異性親和反應。2008年Joo等［64］先使用15-氨基酸生物素受體肽（AP）連接囊膜病毒，然后加入生物素連接酶、生物素和ATP特異地修飾了AP標簽，將生物素引入病毒表面，之后利用生物素和鏈霉親和素之間的高反應性，將鏈霉親和素-QDs標記到病毒上并用共聚焦顯微鏡進行分析。Huang等［50］將生物素修飾的磷脂酰乙醇胺（phosphatidyl ethanolamine，PE）引入細胞，借助病毒囊膜的形成需要從宿主細胞膜獲取磷脂成分的生物學特點，實現了病毒囊膜的生物素化及熒光標記。2016年Wen等［101］使用該系統實現桿狀病毒囊膜標記，同年又實現甲型流感病毒囊膜標記［102］，2018年Huang等［54］用該系統實現天壇株牛痘病毒（VACV-TT）囊膜標記。在研究過程中也有研究人員用基因工程將生物素受體肽與病衣殼蛋白結合，然后用生物素與鏈霉親和素相互作用直接實現標記［86-87］。上述研究表明，BAS幾乎可以與研究成功的各種標記物結合，基于BAS的微顆粒標記方法具有十分廣闊的應用前景。

4 總結與展望

在人類與病毒斗爭的中，病毒遺傳進化的快速演變給人類的防治工作帶來了巨大的挑戰。傳統的ELISA、Western blot、PCR等方法無法在單個病毒顆粒水平上展開分析，也無法評估病毒顆粒之間的異質性。FVM作為一種快速、靈敏且高通量的技術，為科研人員提供了樣本中病毒顆粒、外泌體、微囊泡等的物理性質信息［103］，此外，熒光強度還為人們提供了靶抗原的豐富度。近年來，得益于更加靈敏的分析設備、更具特異性的試劑以及數據和方法的標準化［104-105］，FVM在表征病毒、外泌體等的種類、分辨率、特異性、高效性上取得了顯著的進步。然而，FVM仍然存在一些弊端和挑戰，如病毒、外泌體、微囊泡等的體積大多數情況下處于商業流式細胞儀檢測的極限或閾值之下［106］，而且由于它們的表面積較細胞小約1 000到10 000倍，所以表面弱表達的抗原可能難以被儀器所檢測［107］。目前還沒有絕對的流式設備、標記方法和分選策略可以做到高效地、特異性地分離所有微顆粒。因此，在進行研究時，需要認真考慮試驗設置、病毒標記方法、數據處理和分析方法等因素，選擇最合適的試驗方法和技術以最大限度地提高效率和特異性。

在病毒標記方法的探索中，傳統的染色劑標記核酸、蛋白質、脂質等的方法存在染色劑有毒性、熒光不穩定、需要純化病毒樣品等問題［11］。借助免疫學原理運用熒光偶聯抗體標記病毒的方法具有特異性強、效率高以及對病毒損傷小的優點，是流式病毒檢測中最常見的標記病毒方法之一［4，9］。在過去的十年里，生物正交方法在病毒標記上表現出了顯著的優越性。借助學科交叉，生物正交的各種化學試劑被開發，并被用來活體病毒示蹤以揭示病毒感染機制［65］。生物正交方法已成為目前標記研究微顆粒的優秀方法之一。研究人員可以利用生物正交反應實現病毒等微顆粒的標記，并根據試驗目標，借助熒光顯微鏡、共聚焦顯微鏡、流式細胞儀等設備實現定量和表征。此外，生物素和鏈霉親和素這一生物反應放大系統因其靈敏度高、特異性和穩定性好、普適性強也成為很多研究人員標記病毒等微粒的選擇。除了以上方法，還有很多標記細胞等微粒的方法同樣可以被嘗試用來標記病毒等微粒。相信在未來，隨著流式細胞儀的持續改進以及病毒標記技術的不斷提高，FVM將會在病毒等微粒的定量和表征上展示其巨大的潛力。

參考文獻（References）：

［1］ 王 蕾，羅帝洲，鄧紫璇，等.流式細胞術在農業研究領域中的應用［J］.廣東農業科學，2022，49（11）：66-73.

WANG L，LUO D Z，DENG Z X，et al.Application of flow cytometry in agricultural research［J］.Guangdong Agricultural Sciences，2022，49（11）：66-73.（in Chinese）

［2］ RIESEBERG M，KASPER C，REARDON K F，et al.Flow cytometry in biotechnology［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2001，56（3-4）：350-360.

［3］ ZAMORA J L R，AGUILAR H C.Flow virometry as a tool to study viruses［J］.Methods，2018，134-135：87-97.

［4］ ARAKELYAN A，FITZGERALD W，MARGOLIS L，et al.Nanoparticle-based flow virometry for the analysis of individual virions［J］.J Clin Invest，2013，123（9）：3716-3727.

［5］ FLYNN J，GORRY P.Flow cytometry analysis to identify human CD8+ T cells［M］//SANEKO S.In Vitro Differentiation of T-Cells.New York：Humana，2019：1-13.

［6］ MANOHAR S M，SHAH P，NAIR A.Flow cytometry：principles，applications and recent advances［J］.Bioanalysis，2021，13（3）：181-198.

［7］ KLINGEN Y，CONZELMANN K K，FINKE S.Double-labeled rabies virus：live tracking of enveloped virus transport［J］.J Virol，2008，82（1）：237-245.

［8］ SUGIMOTO K，UEMA M，SAGARA H，et al.Simultaneous tracking of capsid，tegument，and envelope protein localization in living cells infected with triply fluorescent herpes simplex virus 1［J］.J Virol，2008，82（11）：5198-5211.

［9］ GAUDIN R，BARTENEVA N S.Sorting of small infectious virus particles by flow virometry reveals distinct infectivity profiles［J］.Nat Commun，2015，6（1）：6022.

［10］ MARIE D，BRUSSAARD C P D，THYRHAUG R，et al.Enumeration of marine viruses in culture and natural samples by flow cytometry［J］.Appl Environ Microbiol，1999，65（1）：45-52.

［11］ CHEN F，LU J R，BINDER B J，et al.Application of digital image analysis and flow cytometry to enumerate marine viruses stained with SYBR gold［J］.Appl Environ Microbiol，2001，67（2）：539-545.

［12］ LORET S，EL BILALI N，LIPP R.Analysis of herpes simplex virus type I nuclear particles by flow cytometry［J］.Cytometry A，2012，81A（11）：950-959.

［13］ LU Y J，DENG Q，HU D P，et al.A molecular fluorescent dye for specific staining and imaging of RNA in live cells：a novel ligand integration from classical thiazole orange and styryl compounds［J］.Chem Commun （Camb），2015，51（83）：15241-15244.

［14］ HERCHER M，MUELLER W，SHAPIRO H M.Detection and discrimination of individual viruses by flow cytometry［J］.J Histochem Cytochem，1979，27（1）：350-352.

［15］ YAN X M，ZHONG W W，TANG A J，et al.Multiplexed flow cytometric immunoassay for influenza virus detection and differentiation［J］.Anal Chem，2005，77（23）：7673-7678.

［16］ BRUSSAARD C P D，MARIE D，BRATBAK G.Flow cytometric detection of viruses［J］.J Virol Methods，2000，85（1-2）：175-182.

［17］ MARTNEZ J M，SWAN B K，WILSON W H.Marine viruses，a genetic reservoir revealed by targeted viromics［J］.ISME J，2014，8（5）：1079-1088.

［18］ ARAKELYAN A，FITZGERALD W，ZICARI S，et al.Flow virometry to analyze antigenic spectra of virions and extracellular vesicles［J］.J Vis Exp，2017（119）：55020.

［19］ SANJAYA K C，RANZONI A，HUNG J，et al.Flow-cytometry detection of fluorescent magnetic nanoparticle clusters increases sensitivity of dengue immunoassay［J］.Anal Chim Acta，2020，1107：85-91.

［20］ KHALIL J Y B，LANGLOIS T，ANDREANI J，et al.Flow cytometry sorting to separate viable giant viruses from amoeba co-culture supernatants［J］.Front Cell Infect Microbiol，2017，6：202.

［21］ RENNER T M，TANG V A，BURGER D，et al.Intact viral particle counts measured by flow virometry provide insight into the infectivity and genome packaging efficiency of moloney murine leukemia virus［J］.J Virol，2020，94（2）：e01600-19.

［22］ SONI N，PAI P，KRISHNA KUMAR G R，et al.A flow virometry process proposed for detection of SARS-CoV-2 and large-scale screening of COVID-19 cases［J］.Future Virol，2020，15（8）：525-532.

［23］ HUSSAIN R，ONGARO A E，DE LA CONCEPCIN M L R，et al.Small form factor flow virometer for SARS-CoV-2［J］.Biomed Opt Express，2022，13（3）：1609-1619.

［24］ ABRAHAM S，WOOD S.Development of flow cytometry-based Zika virus detection assay［J］.Acta Virol，2022，66（3）：275-280.

［25］ SAMMAN N，EL-BOUBBOU K，AL-MUHALHIL K，et al.MICaFVi：a novel magnetic immuno-capture flow virometry nano-based diagnostic tool for detection of coronaviruses［J］.Biosensors （Basel），2023，13（5）：553.

［26］ LAI J J，CHAU Z L，CHEN S Y，et al.Exosome processing and characterization approaches for research and technology development［J］.Adv Sci （Weinh），2022，9（15）：2103222.

［27］ PENG Y Q，YANG Y X，LI Y Y，et al.Exosome and virus infection［J］.Front Immunol，2023，14：1154217.

［28］ NOLTE-‘T HOEN E N M，VAN DER VLIST E J，AALBERTS M，et al.Quantitative and qualitative flow cytometric analysis of nanosized cell-derived membrane vesicles［J］.Nanomedicine：Nanotechnol，Biol Med，2012，8（5）：712-720.

［29］ VAN DER VLIST E J，NOLTE-‘T HOEN E N M，STOORVOGEL W，et al.Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry［J］.Nat Protoc，2012，7（7）：1311-1326.

［30］ VAN DER POL E，VAN GEMERT M J C，STURK A，et al.Single vs.swarm detection of microparticles and exosomes by flow cytometry［J］.J Thromb Haemost，2012，10（5）：919-930.

［31］ ARRAUD N，LINARES R，TAN S，et al.Extracellular vesicles from blood plasma：determination of their morphology，size，phenotype and concentration［J］.J Thromb Haemost，2014，12（5）：614-627.

［32］ GARDINER C，DI VIZIO D，SAHOO S，et al.Techniques used for the isolation and characterization of extracellular vesicles：results of a worldwide survey［J］.J Extracell Vesicles，2016，5（1）：32945.

［33］ SZCZOTKA M，KOCKI J，IWAN E，et al.Determination of telomere length and telomerase activity in cattle infected with bovine leukaemia virus （BLV）［J］.Pol J Vet Sci，2019，22（2）：391-403.

［34］ BURNIE J，TANG V A，WELSH J A，et al.Flow virometry quantification of host proteins on the surface of HIV-1 pseudovirus particles［J］.Viruses，2020，12（11）：1296.

［35］ ZICARI S，ARAKELYAN A，FITZGERALD W，et al.Evaluation of the maturation of individual Dengue virions with flow virometry［J］.Virology，2016，488：20-27.

［36］ ZHANG Z P，WANG D S，YAO Y Y，et al.Characterization of T-cell subsets in response to foot-and-mouth disease bivalent inactivated vaccine in Chinese Holstein cows［J］.Microbiol Spectr，2023，11（6）：e0102923.

［37］ RICCI G，MINSKER K，KAPISH A，et al.Flow virometry for process monitoring of live virus vaccines-lessons learned from ERVEBO［J］.Sci Rep，2021，11（1）：7432.

［38］ PROUT A，RUSTANDI R R，TUBBS C，et al.Functional profiling of Covid 19 vaccine candidate by flow virometry［J］.Vaccine，2022，40（37）：5529-5536.

［39］ SAFFORD H R，JOHNSON M M，BISCHEL H N.Flow virometry for water-quality assessment：protocol optimization for a model virus and automation of data analysis［J］.npj Clean Water，2023，6（1）：28.

［40］ SIEBURTH J M，JOHNSON P W，HARGRAVES P E.Ultrastructure and ecology of aureococcus ANOPHAGEFERENS gen. ET SP. NOV. （CHRYSOPHYCEAE）：the dominant PICOPLANKTER during a bloom in narragansett bay，Rhode Island，summer 1985［J］.J Phycol，1988，24（3）：416-425.

［41］ ZHANG P F，LIU S H，GAO D Y，et al.Click-functionalized compact quantum dots protected by multidentate-imidazole ligands：conjugation-ready nanotags for living-virus labeling and imaging［J］.J Am Chem Soc，2012，134（20）：8388-8391.

［42］ HAO J，HUANG L L，ZHANG R，et al.A mild and reliable method to label enveloped virus with quantum dots by copper-free click chemistry［J］.Anal Chem，2012，84（19）：8364-8370.

［43］ GEORGI A，MOTTOLA-HARTSHORN C，WARNER A，et al.Detection of individual fluorescently labeled reovirions in living cells［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，1990，87（17）：6579-6583.

［44］ LEOPOLD P L，FERRIS B，GRINBERG I，et al.Fluorescent virions：dynamic tracking of the pathway of adenoviral gene transfer vectors in living cells［J］.Hum Gene Ther，1998，9（3）：367-378.

［45］ LANG K，CHIN J W.Cellular incorporation of unnatural amino acids and bioorthogonal labeling of proteins［J］.Chem Rev，2014，114（9）：4764-4806.

［46］ MAHAL L K，YAREMA K J，BERTOZZI C R.Engineering chemical reactivity on cell surfaces through oligosaccharide biosynthesis［J］.Science，1997，276（5315）：1125-1128.

［47］ JAO C Y，SALIC A.Exploring RNA transcription and turnover in vivo by using click chemistry［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2008，105（41）：15779-15784.

［48］ ZHAO X，CAI L，ADOGLA E A，et al.Labeling of enveloped virus via metabolic incorporation of azido sugars［J］.Bioconjug Chem，2015，26（9）：1868-1872.

［49］ LINK A J，MOCK M L，TIRRELL D A.Non-canonical amino acids in protein engineering［J］.Curr Opin Biotechnol，2003，14（6）：603-609.

［50］ HUANG B H，LIN Y，ZHANG Z L，et al.Surface labeling of enveloped viruses assisted by host cells［J］.ACS Chem Biol，2012，7（4）：683-688.

［51］ AGARD N J，PRESCHER J A，BERTOZZI C R.A strain-promoted［3+ 2］ azide- alkyne cycloaddition for covalent modification of biomolecules in living systems［J］.J Am Chem Soc，2004，126（46）：15046-15047.

［52］ YEKTAEIAN N，MEHRABANI D，SEPASKHAH M，et al.Lipophilic tracer Dil and fluorescence labeling of acridine orange used for Leishmania major tracing in the fibroblast cells［J］.Heliyon，2019，5（12）：e03073.

［53］ VAN DER SCHAAR H M，RUST M J，CHEN C，et al.Dissecting the cell entry pathway of dengue virus by single-particle tracking in living cells［J］.PLoS Pathog，2008，4（12）：e1000244.

［54］ HUANG L L，WU L L，LI X，et al.Labeling and single-particle-tracking-based entry mechanism study of vaccinia virus from the Tiantan strain［J］.Anal Chem，2018，90（5）：3452-3459.

［55］ DEHGHANI M，GABORSKI T R.Fluorescent labeling of extracellular vesicles［J］.Methods Enzymol，2020，645：15-42.

［56］ KULKEAW K.Progress and challenges in the use of fluorescence-based flow cytometric assays for anti-malarial drug susceptibility tests［J］.Malar J，2021，20（1）：57.

［57］ SVECHKAREV D，MOHS A M.Organic fluorescent dye-based nanomaterials：advances in the rational design for imaging and sensing applications［J］.Curr Med Chem，2019，26（21）：4042-4064.

［58］ LANDOWSKI M，DABUNDO J，LIU Q，et al.Nipah virion entry kinetics，composition，and conformational changes determined by enzymatic virus-like particles and new flow virometry tools［J］.J Virol，2014，88（24）：14197-14206.

［59］ IM K，MARENINOV S，DIAZ M F P，et al.An introduction to performing immunofluorescence staining［M］//YONG W H.Biobanking.New York：Humana Press，2019：299-311.

［60］ SUN S Z，YAN J J，XIA C，et al.Visualizing hepatitis B virus with biarsenical labelling in living cells［J］.Liver Int，2014，34（10）：1532-1542.

［61］ LIU A A，ZHANG Z F，SUN E Z，et al.Simultaneous visualization of parental and progeny viruses by a capsid-specific HaloTag labeling strategy［J］.ACS Nano，2016，10（1）：1147-1155.

［62］ ZHENG L L，LI C M，ZHEN S J，et al.His-tag based in situ labelling of progeny viruses for real-time single virus tracking in living cells［J］.Nanoscale，2016，8（44）：18635-18639.

［63］ KE X L，ZHANG Y，ZHENG F L，et al.SpyCatcher-SpyTag mediated in situ labelling of progeny baculovirus with quantum dots for tracking viral infection in living cells［J］.Chem Commun （Camb），2018，54（10）：1189-1192.

［64］ JOO K I，LEI Y N，LEE C L，et al.Site-specific labeling of enveloped viruses with quantum dots for single virus tracking［J］.ACS Nano，2008，2（8）：1553-1562.

［65］ PAN H，LI W J，YAO X J，et al.In situ bioorthogonal metabolic labeling for fluorescence imaging of virus infection in vivo［J］.Small，2017，13（17）：1604036.

［66］ YAO Y S，CHEN Z F，ZHANG T，et al.Adverse reproductive and developmental consequences of quantum dots［J］.Environ Res，2022，213：113666.

［67］ WEN L，ZHENG Z H，LIU A A，et al.Tracking single baculovirus retrograde transportation in host cell via quantum dot-labeling of virus internal component［J］.J Nanobiotechnol，2017，15（1）：37.

［68］ LI Q，LI W，YIN W，et al.Single-particle tracking of human immunodeficiency virus type 1 productive entry into human primary macrophages［J］.ACS Nano，2017，11（4）：3890-3903.

［69］ HUANG L L，JIN Y J，ZHAO D X，et al.A fast and biocompatible living virus labeling method based on sialic acid-phenylboronic acid recognition system［J］.Anal Bioanal Chem，2014，406（11）：2687-2693.

［70］ ZHANG L J，WANG S B，XIA L，et al.Lipid-specific labeling of enveloped viruses with quantum dots for single-virus tracking［J］.mBio，2020，11（3）：e00135-20.

［71］ KE X L，LI C J，LUO D，et al.Metabolic labeling of enterovirus 71 with quantum dots for the study of virus receptor usage［J］.J Nanobiotechnol，2021，19（1）：295.

［72］ HE M M，SATO Y，NISHIZAWA S.Classical thiazole orange and its regioisomer as fluorogenic probes for nucleolar RNA imaging in living cells［J］.Analyst，2023，148（3）：636-642.

［73］ BAINS J K，QURESHI N S，CEYLAN B，et al.Cell-free transcription-translation system：a dual read-out assay to characterize riboswitch function［J］.Nucleic Acids Res，2023，51（15）：e82.

［74］ KUBA M，KHOROSHYY P，LEPK M，et al.Real-time imaging of nascent DNA in live cells by monitoring the fluorescence lifetime of DNA-incorporated thiazole orange-modified nucleotides［J］.Angew Chem，2023，135（38）：e202307548.

［75］ GEADA M M，GALINDO I，LORENZO M M，et al.Movements of vaccinia virus intracellular enveloped virions with GFP tagged to the F13L envelope protein［J］.J Gen Virol，2001，82（11）：2747-2760.

［76］ ZHOU P，ZHENG Z H，LU W，et al.Multicolor labeling of living-virus particles in live cells［J］.Angew Chem Int Ed，2012，51（3）：670-674.

［77］ KALIA J，RAINES R T.Advances in bioconjugation［J］.Curr Org Chem，2010，14（2）：138-147.

［78］ BANERJEE P S，OSTAPCHUK P，HEARING P，et al.Chemoselective attachment of small molecule effector functionality to human adenoviruses facilitates gene delivery to cancer cells［J］.J Am Chem Soc，2010，132（39）：13615-13617.

［79］ RUBINO F A，OUM Y H，RAJARAM L，et al.Chemoselective modification of viral surfaces via bioorthogonal click chemistry［J］.J Vis Exp，2012（66）：e4246.

［80］ BEST M D.Click chemistry and bioorthogonal reactions：unprecedented selectivity in the labeling of biological molecules［J］.Biochemistry，2009，48（28）：6571-6584.

［81］ DEVARAJ N K，WEISSLEDER R，HILDERBRAND S A.Tetrazine-based cycloadditions：application to pretargeted live cell imaging［J］.Bioconjug Chem，2008，19（12）：2297-2299.

［82］ LEMIEUX G A，DE GRAFFENRIED C L，BERTOZZI C R.A fluorogenic dye activated by the staudinger ligation［J］.J Am Chem Soc，2003，125（16）：4708-4709.

［83］ KHN M，BREINBAUER R.The Staudinger ligation—a gift to chemical biology［J］.Angew Chem Int Ed，2004，43（24）：3106-3116.

［84］ BASKIN J M，PRESCHER J R，LAUGHLIN S T，et al.Copper-free click chemistry for dynamic in vivo imaging［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2007，104（43）：16793-16797.

［85］ HANDULA M，CHEN K T，SEIMBILLE Y.IEDDA：an attractive bioorthogonal reaction for biomedical applications［J］.Molecules，2021，26（15）：4640.

［86］ BLACKMAN M L，ROYZEN M，FOX J M.Tetrazine ligation：fast bioconjugation based on inverse-electron-demand Diels- Alder reactivity［J］.J Am Chem Soc，2008，130（41）：13518-13519.

［87］ XIONG D C，ZHU J J，HAN M J，et al.Rapid probing of sialylated glycoproteins in vitro and in vivo via metabolic oligosaccharide engineering of a minimal cyclopropene reporter［J］.Org Biomol Chem，2015，13（13）：3911-3917.

［88］ HUANG L L，LIU K J，ZHANG Q M，et al.Integrating two efficient and specific bioorthogonal ligation reactions with natural metabolic incorporation in one cell for virus dual labeling［J］.Anal Chem，2017，89（21）：11620-11627.

［89］ BEDNAREK C，WEHL I，JUNG N，et al.The Staudinger ligation［J］.Chem Rev，2020，120（10）：4301-4354.

［90］ SUNDHORO M，JEON S，PARK J，et al.Perfluoroaryl azide Staudinger reaction：a fast and bioorthogonal reaction［J］.Angew Chem Int Ed，2017，56（40）：12117-12121.

［91］ LI L，ZHANG Z Y.Development and applications of the copper-catalyzed azide-alkyne cycloaddition （CuAAC） as a bioorthogonal reaction［J］.Molecules，2016，21（10）：1393.

［92］ WANG Q，CHAN T R，HILGRAF R，et al.Bioconjugation by copper （I）-catalyzed azide-alkyne［3+2］ cycloaddition［J］.J Am Chem Soc，2003，125（11）：3192-3193.

［93］ SINGH D K.CuAAC-inspired synthesis of 1，2，3-triazole-bridged porphyrin conjugates：an overview［J］.Beilstein J Org Chem，2023，19：349-379.

［94］ HABERKANT P，RAIJMAKERS R，WILDWATER M，et al.In vivo profiling and visualization of cellular protein-lipid interactions using bifunctional fatty acids［J］.Angew Chem Int Ed，2013，52（14）：4033-4038.

［95］ 黃利利.基于生物代謝與生物正交反應的病毒熒光標記新方法［D］.北京：北京理工大學，2017.

HUANG L L.Virus labeling via biological metabolism and bioorthogonal chemistry［D］.Beijing：Beijing Institute of Technology，2017.（in Chinese）

［96］ 李 俊，鄭康成.DNA分子光開關釕配合物［Ru（phen）2（dppz）］2+的研究進展［J］.化學試劑，2010，32（6）：507-512.

LI J，ZHENG K C.Study on the progress of DNA molecular light switch ruthenium complex ［Ru（phen）2（dppz）］2+［J］.Chemical Reagents，2010，32（6）：507-512.（in Chinese）

［97］ DI PIETRO M L，LA GANGA G，NASTASI F，et al.Ru （II）-dppz derivatives and their interactions with DNA：thirty years and counting［J］.Appl Sci，2021，11（7）：3038.

［98］ MERINO E J，DAVIS M L，BARTON J K.Common mitochondrial DNA mutations generated through DNA-mediated charge transport［J］.Biochemistry，2009，48（4）：660-666.

［99］ WANG H，LIU X H，TAN L F.Binding properties of a molecular “light switch” ruthenium（II） polypyridyl complex toward double- and triple-helical forms of RNA［J］.Int J Biol Macromol，2023，242：124710.

［100］ WILCHEK M，BAYER E A.The avidin-biotin complex in immunology［J］.Immunol Today，1984，5（2）：39-43.

［101］ WEN L，LIN Y，ZHANG Z L，et al.Intracellular self-assembly based multi-labeling of key viral components：envelope，capsid and nucleic acids［J］.Biomaterials，2016，99：24-33.

［102］ SUN E Z，LIU A A，ZHANG Z L，et al.Real-time dissection of distinct dynamin-dependent endocytic routes of influenza a virus by quantum dot-based single-virus tracking［J］.ACS Nano，2017，11（5）：4395-4406.

［103］ MALTSEVA M，LANGLOIS M A.Influence of GlycoGag on the incorporation of host membrane proteins into the envelope of the moloney murine leukemia virus［J］.Front Virol，2021，1：747253.

［104］ THRY C，WITWER K W，AIKAWA E，et al.Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 （MISEV2018）：a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines［J］.J Extracell Vesicles，2018，7（1）：1535750.

［105］ TIAN Y，GONG M F，HU Y Y，et al.Quality and efficiency assessment of six extracellular vesicle isolation methods by nano-flow cytometry［J］.J Extracell Vesicles，2020，9（1）：1697028.

［106］ LIPP R.Flow virometry：a powerful tool to functionally characterize viruses［J］.J Virol，2018，92（3）：e01765-17.

［107］ MALTSEVA M，LANGLOIS M A.Flow virometry for characterizing the size，concentration，and surface antigens of viruses［J］.Curr Protoc，2022，2（2）：e368.

（編輯 范子娟）