育成期代謝能攝入量對蛋雞生殖器官發育、激素水平和卵巢基因表達的影響

摘 要： 旨在研究育成期代謝能（ME）攝入量對蛋雞生殖器官發育、激素水平和卵巢基因表達的影響。將720只6周齡海蘭褐蛋雞隨機分為3組，每組6個重復，每個重復40只雞。6～17周齡，各試驗組飼糧粗蛋白質水平分別為17.5%（6～12周齡）和15.5%（12～17周齡），ME水平分別為12.34、11.11（12.34×90%）和9.87（12.34×80%）MJ·kg-1（分別為對照組亦即自由采食組、90% ME限飼組和80% ME限飼組），其他營養素水平相同。對照組試驗雞自由采食，其他試驗組蛋雞按照對照組蛋雞采食量定量飼喂。試驗期為6～17周齡。結果表明：1）隨著育成期能量限飼強度增加，各試驗組蛋雞17周齡體重、體斜長和跖圍均顯著線性減少（Plt;0.001）。2）隨著育成期能量限飼強度增加，血清尿素氮（UN）和葡萄糖（GLU）水平均顯著線性減?。≒=0.040，P=0.044），但血漿雌二醇水平顯著線性增加（P=0.026）。3）對17周齡血液雌二醇水平差異最顯著的自由采食組（ALF17W）和80%能量限飼組（ERF17W）蛋雞卵巢基質部進行RNA-Seq分析，純凈序列匹配到雞參考基因組的比例均超過了94.61%，Q20和Q30的純凈序列含量分別高于97.38%和92.87%，兩組共篩選出1 299個差異基因，ERF17W中961個下調，338個上調。GO功能富集分析發現，差異表達的mRNAs參與調節細胞增殖、發育和生殖等48個顯著富集的GO條目，KEGG信號通路顯著富集在25個顯著富集的KEGG通路，其中cAMP信號通路、雌激素信號通路、類固醇激素生物合成和卵巢類固醇生成等是與能量代謝或生殖相關的通路。篩選到的cAMP反應元件結合蛋白（CREB）和類固醇生成急性調節蛋白（StAR）富集在cAMP信號通路，孕激素受體（PGR）、代謝型谷氨酸受體1（GRM 1）和細胞骨架蛋白角蛋白18（KRT 18）富集在雌激素信號通路。qRT-PCR結果顯示10個隨機選擇的差異表達基因的表達趨勢與 RNA-Seq結果一致。綜上可見，隨育成期ME攝入量減少，育成期末蛋雞體重、血清UN和GLU含量均顯著線性減小，但血漿雌二醇水平顯著線性增加，育成期ME攝入量可能通過調控卵巢組織StAR、CREB1、KRT18、PGR和GRM1等基因的表達，作用于cAMP信號通路和雌激素信號通路，以調控蛋雞能量代謝和雌激素生成。

關鍵詞： RNA-seq；育成期；代謝能攝入量；雌激素；卵巢；蛋雞

中圖分類號：S831.5

文獻標志碼：A

文章編號：0366-6964（2024）11-5085-16

收稿日期：2024-01-02

基金項目：江蘇省種業振興揭榜掛帥項目（JBGS［2021］104）；現代農業產業技術體系建設專項資金（CARS-40-K01）；江蘇現代農業產業技術體系建設項目（JATS［2023］069）

作者簡介：盧 建（1985-），男，山東濟寧人，副研究員，博士，主要從事蛋雞營養代謝與繁殖性能調控研究，E-mail：lujian1617@163.com

*通信作者：曲 亮，主要從事蛋雞遺傳育種研究，E-mail： liangquyz@126.com

Effects of Metabolizable Energy Intake during Rearing on Development of Reproductive

Organs， Hormone Level and Gene Expression in Ovary of Laying Hens

LU" Jian， JU" Xiaojun， WANG" Xingguo， MA" Meng， WANG" Qiang， LI" Yongfeng， DOU" Taocun，

HU" Yuping， GUO" Jun， SHAO" Dan， TONG" Haibing， QU" Liang*

（Jiangsu Institute of Poultry Sciences， Yangzhou 225125，" China）

Abstract：" This experiment was conducted to evaluate the effects of metabolizable energy （ME） intake during rearing on the growth and development of reproductive organ， hormone level and gene expression in ovary of laying hens. A total of 720 6-week-old Hyline-Brown laying hens were allocated equally to three groups with six replicates of 40 hens each， and were fed one of three diets that were nutritionally equal with the exception of ME levels. From 6 to 17 weeks of age， the crude protein （CP） levels in diet were 17.5% （6-12 weeks） and 15.5% （12-17 weeks）， respectively， and the ME levels in diet were 12.34， 11.11 （12.34×90%） and 9.87（12.34×80%） MJ·kg-1 （control group， also called ad libitum feeding group， 90% energy-restricted feeding group， and 80% energy-restricted feeding group）， respectively. The hens in control group were fed ad libitum， and the daily amount of feed in experimental groups was restricted to the absolute quantity of the diet consumed by hens in control group. The results showed as follows： 1） Body weight， body slope length and shank circumference of hens at 17 weeks of age decreased linearly （Plt;0.001） with increasing levels of energy restriction. 2） The serum UN and GLU content decreased linearly （P=0.040 and 0.044， respectively）， while the plasma oestradiol concentrations increased linearly （P=0.026）. 3）The ovary stroma of hens in the ad libitum feeding group （ALF17W） and 80% energy-restricted feeding group （ERF17W） with significant differences （Plt;0.05） in plasma oestradiol concentrations were used to screen the novel mRNA implemented by the RNA-seq. The proportion of pure reads matching to chicken reference genome was more than 94.61%， and the content of Q20 and Q30 was more than 97.38% and 92.87%， respectively. A total of 1 299 differential genes were screened in ALF17W and ERF17W， of which 961 were down-regulated and 338 were up-regulated in ERF17W. The GO functional enrichment analysis found that differentially expressed mRNAs were involved in 48 GO terms such as cell proliferation， development， and reproduction. The KEGG pathway were significantly enriched in 25 pathways， among these pathways， the cAMP signaling pathway， estrogen signaling pathway， steroid hormone biosynthesis and ovarian steroidogenesis pathway were related to energy metabolism or reproduction. The screened cAMP response element-binding protein （CREB） and steroid-producing acute regulatory protein （StAR） are enriched in the cAMP signaling pathway， and progesterone receptor （PGR）， metabotropic glutamate receptor 1 （GRM1） and cytoskeletal keratin （KRT18） are enriched in the estrogen signaling pathway， they may be the potential target genes of ME intake regulating estrogen production in laying hens. The qRT-PCR results showed that the expression trends of 10 randomly selected differentially expressed genes were consistent with the RNA-Seq results. The above results showed that the body weight， serum UN and GLU decreased linearly with the decrease of ME intake during the rearing period， but plasma oestradiol level increased linearly. It is suggested that ME intake during the rearing period may regulate the expression of StAR， CREB1， KRT18， PGR and GRM1 genes in ovarian tissues， and act on the cAMP and estrogen signaling pathways to regulate the production of estrogen in laying hens.

Key words： RNA-seq; rearing period; ME intake; estrogen; ovary; laying hens

*Corresponding author： QU Liang，E-mail： liangquyz@126.com

育成期和開產前階段是蛋雞體型、肌肉和生殖器官等發育的主要階段［1］，開產時（性成熟）體重、群體均勻度和生殖器官發育狀況是影響蛋雞整個飼養期的產蛋性能的主要因素［2］。育成期代謝能（ME）攝入量直接影響家禽體重、體組成等體成熟指標［3］，進而影響生殖器官發育和性成熟［4］。因此，系統研究育成期ME攝入量對蛋雞生長發育、生殖器官發育、雌激素水平和卵巢基因表達的影響具有重要意義。有關育成期能量限飼對蛋雞脂質代謝、生殖器官發育、激素水平和卵巢差異基因等影響的研究報道相對較少。在肉種雞上，限飼技術被用于控制肉種雞體重、改善群體均勻度、減少異常排卵、提升產蛋性能［5-6］。在蛋雞上，限飼多集中在研究其對開產日齡和產蛋性能的影響［7］。本團隊前期研究發現，自由采食狀況下育成期飼糧ME水平顯著影響育成期末蛋雞體重、卵巢基質和小黃卵泡等發育，但對開產時蛋雞生殖器官發育狀況無顯著影響［8］。在地方特色蛋雞上的研究發現，育成期適度限制ME攝入量能夠延遲如皋黃雞18、20、22和24周齡的生殖器官發育和性成熟，但ME限飼改善了性成熟過程中群體均勻度，增加了產蛋期平均蛋重和蛋重超過40g的蛋數，對產蛋初期（21周齡）體重、18～52周齡的產蛋性能、52周齡的受精率和孵化率無不良影響［9］。在海蘭褐蛋雞上的研究也發現，育成期適度限制ME攝入量能夠延遲生殖器官發育和性成熟，但限飼減小了個體開產日齡和個體產蛋數的變異系數，增加了20～72周齡蛋雞日只蛋重、產蛋數和蛋重超過60 g的蛋數［10］?？梢?，這種通過減少育成期ME攝入量延遲生殖器官發育的方式可能增加了生殖器官的發育時間，使生殖器官發育更加充分，進而改善個體產蛋的均勻度和產蛋性能。然而，通過減少育成期ME攝入量調控生殖器官發育時，是否引起了蛋雞雌激素生成的變化，以及卵巢基質部的基因表達量是否有變化，這些調控機制仍不清楚。因此，本試驗以海蘭褐蛋雞為研究對象，通過等量飼喂不同ME水平飼糧控制育成期（6～17周齡）蛋雞的ME攝入量，研究其對蛋雞體重、體尺、血液生化指標和激素水平的影響，并基于轉錄組測序技術研究育成期ME攝入量調控蛋雞激素水平的關鍵基因和信號通路，為科學應用蛋雞育成期精準飼喂技術提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

試驗選用體況良好、體重接近的6周齡海蘭褐母雞720只，平均體重為376.8 g±43.3 g。

1.2 試驗設計

將720只母雞隨機分為3組，每組6個重復，每個重復40只，各試驗組蛋雞體重無顯著差異。育成期試驗飼糧粗蛋白質（CP）水平分別為17.5%（6～12周齡）及15.5%（12～17周齡），ME水平分別為12.34、11.11（12.34×90%）和9.87（12.34×80%）MJ·kg-1（分別為對照組、90%能量限飼組和80%能量限飼組），其他營養素水平相同。6～17周齡，對照組試驗雞自由采食，其它試驗組蛋雞按照對照組蛋雞采食量定量飼喂。

1.3 試驗飼糧與飼養管理

參照《海蘭褐飼養管理手冊》（HY-LINE INTERNATIONAL，2022版）配制試驗飼糧，飼糧組成及營養水平見表1。試驗雞在中國農業科學院家禽研究所試驗雞舍飼養，采用《海蘭褐飼養管理手冊》推薦的光照程序。試驗雞三層個體階梯籠飼養，自由飲水。各重復間在料槽上插入擋板，防止試驗雞采食其它重復蛋雞試驗飼糧。

1.4 測定指標及方法

1.4.1 體重測定

每天記錄雞只健康狀況。試驗期第6和17周齡末，禁食12 h后對每只試驗雞稱重。以重復為單位統計試驗雞體重，并計算各重復體重變異系數（coefficient of variation，CV）作為群體均勻度評價指標。

CV=（標準差/平均體重）×100%

1.4.2 體尺測定

17周齡末，測定所有試驗雞個體體斜長、跖長和跖圍，體斜長、跖長和跖圍分別由專人測定，測定方法參考《家禽生產性能名詞術語和度量計算方法》（中華人民共和國農業行業標準NY/T 823—2020）。體斜長為肩關節至同側坐骨結節間的距離，用皮尺沿體表測定；跖長為跖骨上關節至第三四趾間的直線距離，用電子數顯卡尺測定；跖圍為跖中部的周長，先用棉線繞跖骨中部1周，然后用直尺測定棉線長度。

1.4.3 血液生化指標和激素水平測定

第17周齡末，隨機從每重復選取2只雞翅靜脈采血，血樣分別置于促凝管和EDTA抗凝管，離心后收集上清（血清、血漿）保存待測。

采用全自動生化分析儀（Uni-Cel DxC 800 Sychron，Beckman Coulter，美國）測定血清葡萄糖（GLU）、尿素氮（UN）、總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、游離脂肪酸（UREA）含量、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）。采用酶聯免疫檢測試劑盒（ELISA）檢測血漿中雌二醇和孕酮的含量，試劑盒購于南京奧青生物技術有限公司。

1.4.4 肝生化指標測定

試驗雞采血后頸部放血致死。分離肝組織，滅菌生理鹽水沖洗，統一位置取樣，置于液氮中，后轉移至-70 ℃超低溫冰箱保存。測樣時，樣品融化后保持4 ℃，加入一定量的 PBS（pH為 7.4），將樣品充分勻漿，離心后收集上清。采用試劑盒測定肝組織TC、TG、UREA、HDL和LDL含量，試劑盒購自南京奧青生物技術有限公司。

1.4.5 生殖器官發育測定

分離生殖器官，測量輸卵管長度，并計算其與體重的比值；稱量輸卵管、卵巢基質、排卵前卵泡（直徑gt;8 mm）、小黃卵泡（直徑4～8 mm）和大白卵泡（直徑2～4 mm）等臟器重量并計算各器官與體重的比值，并統計排卵前卵泡、小黃卵泡、大白卵泡數量。

1.4.6 轉錄組測序

分離卵巢基質部后，各試驗組分別取4個樣品，置于液氮中，后轉移至-70 ℃超低溫冰箱保存。根據血液雌激素水平測定結果，選取血液雌二醇水平差異最顯著的自由采食組（ALF17W）和80%ME限飼組（ERF17W）蛋雞的樣品，用于轉錄組分析和RNA相對表達量檢測。

采用TRIzol法提取卵巢基質部組織RNA，用Nanodrop-2000微量分光光度計檢測RNA濃度和純度，檢測合格后，合成雙鏈cDNA，進行PCR擴增并再次使用AMPure XP beads純化PCR產物，最終獲得文庫，Illumina HiSeqTM 4000平臺上機測序。

1.4.7 測序數據分析

使用fastp對原始數據進行質控，過濾低質量數據后得到純凈序列。使用bowtie 2程序將高質量的純凈序列與雞核糖體序列比對，評估核糖體RNA的去除效果。使用Tophat 2程序將去除核糖體RNA后的純凈序列與雞參考基因組（版本：Ensembl_release100）比對，根據比對結果進一步評估測序數據質量，將比對上的序列進行后續分析。采用FPKM作為衡量基因表達水平的指標。使用edgeR軟件對mRNA的表達量進行差異分析，利用P值與差異倍數（fold change）來篩選差異表達基因，篩選條件為Plt;0.05且FCgt;2.0。

使用OmicShare軟件對靶基因進行注釋和分類。采用超幾何分布對差異表達 mRNA的靶基因進行基因本體論（gene ontology，GO）功能和京都基因與基因組百科全書（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）信號通路富集分析。顯著條件為Plt;0.05。

1.4.8 測序結果qRT-PCR驗證

從差異表達基因中隨機選擇10個參與能量代謝或雌激素生成的基因進行qRT-PCR驗證。根據GenBank的基因序列，利用primer premier 5軟件設計引物，各引物序列見表2。以卵巢基質部總RNA為模板，使用反轉錄試劑盒將提取出的RNA反轉錄為cDNA。熒光定量PCR采用SYBR Green Ι法，參照ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix（Q411-02）試劑盒說明書進行。以GAPDH基因作為內參基因進行數據的標準化處理。每次反應均設空白樣品為陰性對照，每個樣品設置3個重復。定量的結果采用2－ΔΔCt法進行處理，分析自由采食組、能量限飼組卵巢基質mRNAs相對表達量。將80%能量限飼組的表達分析設為參照組，ΔΔCt=ΔCt（自由采食組）-ΔCt（80%能量限飼組）。

1.5 統計分析

表型數據采用SPSS 15.0軟件中的單因子方差分析（one-way ANOVA）檢測組間差異顯著性。以重復為試驗數據單元。差異顯著時，用Duncan氏法進行多重比較。ME攝入量的劑量效應用正交多項式中的線性和二次多項式進行比較。Plt;0.05表示差異顯著。

采用edgeR軟件對mRNA的表達量進行差異分析，利用P值與FC來篩選差異表達基因，Plt;0.05且FCgt;2.0表示差異顯著。采用超幾何分布對差異表達 mRNA的靶基因進行GO功能和KEGG信號通路富集分析，Plt;0.05表示差異顯著。

2 結 果

2.1 育成期ME攝入量對6～17周齡蛋雞生長性能的影響

由表3可知，隨著育成期能量限飼強度增加，各試驗組蛋雞17周齡體重、體斜長和跖圍均顯著線性減少（Plt;0.001），17周齡跖長呈先增加后減小的二次曲線趨勢（P=0.051）。

2.2 育成期ME攝入量對17周齡蛋雞血液和肝組織生化指標的影響

由表4可知，隨著育成期能量限飼強度增加，血清GLU和UN含量均顯著線性減小（P=0.040，P=0.044）。育成期ME攝入量對血清TC、TG、UREA、HDL、LDL水平均無顯著影響（Pgt;0.05）。

由表5可知，育成期ME攝入量對肝組織TC、TG、UREA、HDL和LDL水平均無顯著影響（Pgt;0.05）。

2.3 育成期ME攝入量對17周齡蛋雞生殖器官發育和激素水平的影響

由表6可知，各試驗組蛋雞17周齡等級卵泡主要為大白卵泡和少量小黃卵泡，未見排卵前卵泡，各試驗組蛋雞大白卵泡和小黃卵泡的數量、重量及指數相比較均不顯著（Pgt;0.05），各試驗組蛋雞輸卵管長度、長度體重比、重量及指數相比較差異均不顯著（Pgt;0.05），但卵巢基質部重量和指數均隨能量限飼強度增加呈先增加后減小的二次曲線（P= 0.012，P=0.024）。

由圖1可知，血漿雌二醇水平隨著育成期能量限飼強度增加顯著線性增加（P=0.026），育成期能量限飼對血漿孕酮水平無顯著影響（Pgt;0.05）。

2.4 卵巢基質部轉錄組測序質量分析

由表7可知，對8個cDNA文庫測序共獲得了607 413 360條序列和605 275 266條高質量的純凈序列，純凈序列在原始序列中占比高于99.62%，說明低質量序列較少，測序效果較好，平均GC含量為48.45%，堿基分布符合理論分布比例；原始序列平均堿基數為11.39 Gb，純凈序列平均堿基數為11.30 Gb，即99.22％的原始序列達到質控標準。Q20和Q30的純凈序列含量分別高于97.38%和92.87%，表明測序數據結果可靠，可進一步分析。將純凈序列與雞核糖體序列比對，99.76%以上的純凈序列未比對到核糖體上，去除比對上的序列后可進行后續轉錄組分析。

2.5 參考基因組比對分析

將各樣品純凈序列去重后的唯一序列與雞參考基因組對比（表8），純凈序列匹配到雞參考基因組的比例均超過了94.61%，4.77%～5.39%的reads未匹配到基因組的任何位置，92.65%～93.31%的純凈序列匹配到唯一基因組位置，1.87%～2.01%的純凈序列匹配到多個基因組位點。

2.6 基因表達分析

由圖2可知，17周齡8個樣本共檢測出18 699個表達的基因，其中ALF17W組蛋雞卵巢基質部檢測到18 432個基因，ERF17W組檢測到18 239個基因，ALF17W組和ERF17W組同時檢測出17 972個基因，單獨檢到的基因數分別為460和267個。

2.7 差異表達基因篩選

由圖3可知，ALF17W與ERF17W共篩選出1 299個差異基因，其中ERF17W組338個上調，961個下調。對差異表達基因進行聚類分析，根據差異基因表達量計算樣品間的距離和樣品間的相關性，同一組的四個樣品聚在同一簇中。

2.8 差異表達基因功能分析

2.8.1 GO功能富集分析

對ALF17W組和ERF17W組差異表達基因進行GO功能富集分析，發現48個顯著富集的GO條目（Plt;0.05），主要富集在生物調節（Biological regulation）、多細胞生物過程（Multicellular organismal process）、細胞增殖（Cell proliferation）、發育（Development）、生殖（Reproduction）等條目（圖4），其中與能量代謝或繁殖性能相關的基因有cAMP反應元件結合蛋白（CREB）、類固醇生成急性調節蛋白（StAR）、孕激素受體（PGR）、代謝型谷氨酸受體1（GRM 1）和細胞骨架蛋白角蛋白（KRT18）等5個候選基因。

2.8.2 KEGG信號通路富集分析

對ALF17W組和ERF17W組差異表達基因進行KEGG信號通路富集分析（圖5），發現25個顯著富集的KEGG通路（Plt;0.05），其中富集最為顯著的前20個信號通路主要包括ECM受體相互作用（ECM-receptor "interaction）、cAMP信號通路（cAMP signaling pathway）、雌激素信號通路（Estrogen signaling pathway）等（表9），這些通路與能量代謝或繁殖性能相關，可能是育成期ME攝入量調控蛋雞雌激素生成的潛在通路。

2.9 差異表達基因qRT-PCR驗證

為驗證測序結果的準確性，從ALF17W與ERF17W組測序結果中分別隨機選取10個參與能量代謝或雌激素生成的差異表達的mRNAs（ADIPOQ、APOA1、CD36、COL3A1、CREB1、FABP5、MGST2、PLTP、RAC2和StAR），進行qRT-PCR驗證。如圖6所示，qRT-PCR結果與測序結果高度一致，說明轉錄組分析獲得的差異表達基因是準確的。

3 討 論

3.1 育成期ME攝入量對蛋雞體重、體重CV和體尺的影響

6～17周齡，各組試驗雞等量飼喂，除ME水平外，各組試驗飼糧其它營養素水平均相同，因此，各組試驗雞其它營養素攝入量均相同，各試驗組處理差異實際上是6～17周齡試驗雞ME攝入量的差異。本試驗中，隨著育成期ME攝入量的減少，試驗雞17周齡體重、體斜長、跖圍均顯著線性減小，表明ME限飼組蛋雞的ME攝入量顯著影響了蛋雞的生長，延遲了蛋雞的體成熟。有關育成期ME攝入量對蛋雞生長發育影響的研究報道相對較少，對蛋雞體尺的影響研究未見報道，在肉雞上有研究表明，與自由采食組肉雞相比，限飼期結束時限飼組肉雞體重顯著下降，但這種差異在轉換為自由采食1周后消失［11］。Butzen等［12］研究發現，與自由采食組相比，8～16日齡限飼20%組肉雞16日齡體重顯著下降，但限飼對35日齡的肉雞體重無顯著影響。Urdaneta-Rincon和Leeson［13］研究發現，14至17、20、23、26或29日齡，限飼10%均能顯著影響肉雞公雞35日齡體重，但對42和49日齡體重無顯著影響。Novel等［14］研究發現，與自由采食組相比，14～21日齡限飼50%組肉雞公、母雞42日齡體重均顯著下降，但14～21日齡限飼25% 對35日齡體重無顯著影響。Lu等［4］研究育成期ME限飼及預產期轉換成自由采食對如皋黃雞后備母雞生長發育影響時也發現，8～18周齡能量限飼顯著影響18周齡蛋雞體重，但轉換成預產料自由采食3周后，體重與未限飼組蛋雞相比較差異不顯著。以上研究均說明限飼會影響限飼期末家禽的生長發育，這種影響可能持續到轉換為自由采食后，影響的周期可能與蛋雞品種和限飼強度（限飼量和限飼周期）密切相關。本研究中，試驗雞17周齡體重、體斜長和跖圍均顯著減小，本試驗選用的試驗動物為海蘭褐蛋雞，限飼周期為6～17周齡，限飼量分別為自由采食組的90%和80%，這些試驗因素與以上研究均不相同。

3.2 育成期ME攝入量對蛋雞血液和肝組織生化指標的影響

本試驗中，隨育成期ME攝入量的減少，試驗雞17周齡血清GLU和UN含量均顯著線性減小。GLU是能量代謝的最終產物，說明6～17周齡ME限飼造成ME攝入量的減少，進而其代謝產物（血液GLU）顯著降低。血液UN是反應機體對飼糧粗蛋白質利用效率的指標，本研究中血液UN含量降低表明限飼組蛋雞提高了機體對飼糧CP的利用效率［15］，本試驗中限飼組蛋雞ME攝入量可能太低，導致細胞能量儲備不足，細胞加快氨基酸分解，通過轉氨基作用為機體供能。有關限飼對蛋雞血液和肝臟生化指標的研究未見報道，但自由采食情況下，有研究表明飼糧ME水平顯著影響蛋雞血清TG、UN、HDL等水平，但研究結果并不一致［15］。這可能與試驗雞品種、日齡、飼糧組成和ME設置梯度等不同有關。本試驗中，ME限飼組蛋雞的ME攝入量不能滿足機體生長需要，因此血液中能量代謝產物顯著降低，進一步的，機體可能提高粗蛋白質的利用效率，增加粗蛋白質轉氨基作用進行能量補充。

3.3 育成期ME攝入量對蛋雞生殖器官發育和激素水平的影響

育成期ME攝入量可用于調控性成熟時間及卵泡和輸卵管等生殖器官的發育速度［10］。將6周齡～開產能量攝入量限制到自由采食的2/3，可使春季飼養的白來航蛋雞性成熟延遲3周［7］。7～15周齡和7周齡～開產限飼均能延遲肉種雞（Hybro G）開產日齡［16］。8～18周齡86%能量限飼延遲了如皋黃雞18、20、22和24周齡的生殖器官發育，對26和28周齡無顯著影響，試驗雞開產日齡、5%產蛋率日齡和50%產蛋率日齡分別被延遲了4.2、8.9和5.5 d［4］。本試驗中，試驗雞17周齡等級卵泡主要為大白卵泡和少量小黃卵泡，未見排卵前卵泡，各試驗組蛋雞卵泡和輸卵管發育指標均差異不顯著，僅卵巢基質部重量和指數隨能量限飼強度增加呈先增加后減小的二次曲線。說明17周齡時，蛋雞生殖器官仍處于快速發育時期，育成期ME攝入量對生殖器官發育的影響可能并未完全顯現出來。理論上，育成期至開產，蛋雞體重首先開始快速增加，先達到體成熟，增重開始減慢，輸卵管和卵巢等生殖器官開始快速發育［17］，逐漸達到性成熟。

但是，本研究表明，隨著育成期ME攝入量的減少，17周齡蛋雞血液雌二醇水平顯著線性增加，說明限飼組蛋雞可能通過生理調節分泌了更多的雌二醇激素，以促進生殖器官發育，且限飼組蛋雞雌激素分泌的顯著增加發生在體重仍顯著小于對照組的時間點（17周齡）。為初步探明育成期ME攝入量調控雌二醇分泌的機制，本試驗進一步研究了血液雌二醇水平差異顯著組蛋雞卵巢基質部的差異表達基因和信號通路。

3.4 育成期ME攝入量對蛋雞卵巢基因表達的影響

對能量限飼后（17周齡）卵巢基質部組織進行轉錄組分析，ALF17W與ERF17W共篩選出1 299個差異基因，其中ERF17W組338個上調，961個下調，對差異表達基因進行聚類分析發現，同一組四個樣品的差異表達基因聚在同一簇中，說明本研究樣本采集準確可靠。對差異表達基因進行GO功能富集分析，發現48個顯著富集的GO條目，主要富集在生物調節、多細胞生物過程、細胞增殖、發育、生殖等條目，其中StAR、CREB1、KRT18、PGR、GRM1等基因在上述多個GO條目中富集，說明它們是較為重要的GO條目和差異基因。通過KEGG信號通路富集分析，發現25個顯著富集的KEGG通路，主要包括ECM受體相互作用、cAMP信號通路、類固醇激素生物合成、催產素信號通路、松弛素信號通路、雌激素信號通路等，其中cAMP信號通路、膽固醇代謝通路、類固醇激素生物合成通路和雌激素信號通路引起我們極大關注，這些通路與能量代謝或繁殖密切相關，說明育成期ME攝入量調控蛋雞雌激素變化的差異表達基因可能與這幾個信號通路有關。

蛋雞性成熟是由多個基因和通路共同調控的復雜過程，動物卵巢產生可用的卵母細胞取決于促性腺激素對卵泡發育、顆粒細胞成熟、排卵及黃體化的調節作用，cAMP信號通路可以調控促性腺激素對顆粒細胞與膜細胞功能進行調節［18］。卵巢類固醇激素包括雄激素、雌激素、孕激素等［19］，是一類四環脂肪烴化合物，主要由膜細胞和顆粒細胞分泌而來，是蛋雞性成熟過程的重要表型指標，對生殖器官發育和性成熟具有重要的調控作用［20］，而膽固醇是卵巢類固醇激素生成的主要前體物質。性成熟過程中，蛋雞對雌激素的敏感度比較高，提高營養素攝入能夠促進雌激素分泌，雌激素進一步促進肝脂質合成，脂質的合成為卵泡中卵黃的合成提供基礎，最終促進卵泡生長［21］。

本試驗篩選的差異基因StAR、CREB1等富集在cAMP信號通路，KRT18、PGR、GRM1等富集在雌激素信號通路。在卵泡發育過程中，卵母細胞的發育和減數分裂等過程都需要大量的能量［22］，其中能量代謝相關的信號通路cAMP-PKA參與生殖激素的合成和卵泡的發育：cAMP反應元件結合蛋白CREB通過cAMP-PKA途徑磷酸化，與 cAMP 反應元件（CRE）結合，進而調控與膜細胞和顆粒細胞增殖分化相關基因的轉錄，促進卵泡發育［23］；磷酸化的ERK也可以調節細胞周期蛋白cyclinD2和類固醇生成急性調節蛋白StAR的表達，StAR將膽固醇從線粒體外膜轉運到內膜，通過正向和負向調節因子影響卵巢雌激素的生成以及膜細胞和顆粒細胞的增殖分化［24］。CREB家族包括CREB1、CREM和ATF1等，在哺乳動物中，CREB是細胞能量平衡的關鍵感受器，研究表明，CREB和CREB轉錄激活因子（CRTC2）能夠在轉錄水平上整合由能量和激素調節的細胞信號通路［25］，且在糖異生和內質網應激過程中發揮重要作用［26］，低能引起細胞內cAMP濃度升高，促進核內CRTC2表達和活化并與CREB結合，激活下游基因轉錄［27］。StAR是一類可以通過激素進行誘導的線粒體蛋白，主要存在類固醇激素合成的過程中［28］。類固醇激素合成細胞中的促性腺激素通過激活G蛋白和腺苷酸環化酶，提高細胞內cAMP水平，活化蛋白激酶A（PKA），活化的PKA進入細胞核磷酸化CREB等轉錄蛋白［29］，磷酸化的CREB結合到StAR上的CREB結合區，作為轉錄因子激活StAR，刺激StAR基因表達，StAR蛋白能夠將線粒體外膜的膽固醇遞送到內膜，由CYP11A將不溶性膽固醇裂解為可溶性的P5，進而生成類固醇激素［30］。KRT18可用作滋養外胚層分化的標志物［31］，在卵巢中，卵泡的選擇和成熟以及排卵直接由附近的免疫細胞調節，KRT18參與免疫防御過程的基因在卵丘-卵母細胞復合體培養物中上調，可作為卵丘-卵母細胞復合體生長和發育以及顆粒細胞和卵丘細胞增殖的有用分子標記［32］。PGR在性激素的生物合成通路中具有重要的作用，與繁殖性狀密切相關［33］，在能量限制情況下低表達［34］，發情期高表達，且與孕酮水平密切相關［35］。GRM1基因多態性可能是控制哺乳動物季節性繁殖及產仔數的潛在分子標記［36］。因此，本研究中，預測CREB1、StAR、KRT18、PGR、GRM1等基因可能是育成期ME攝入量調控蛋雞生殖器官發育和雌激素生成的關鍵候選基因。但是目前育成期ME攝入量調控家禽生殖器官發育和雌激素生成的研究在分子層面上較少，還不夠清晰，需要深入探究其作用機制。

4 結 論

4.1 隨育成期ME攝入量減少，育成期末蛋雞體重、血清UN和GLU含量均顯著線性減小，但血漿雌二醇水平顯著線性增加。

4.2 減少育成期ME攝入量可能通過調控蛋雞卵巢組織StAR、CREB1、KRT18、PGR和GRM1等基因的表達，作用于cAMP信號通路和雌激素信號通路，以調控蛋雞能量代謝和雌激素生成。

4.3 建議6～17周齡蛋雞采用9.87 MJ·kg-1代謝能水平飼糧定量飼喂，以促進育成期末蛋雞雌激素生成。

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（編輯 范子娟）