敵草快誘導肉雞氧化損傷模型的建立及其分子機制研究

摘 要： 旨在建立敵草快誘導的肉雞氧化損傷模型，并初步揭示其分子機制。將160只1日齡肉雞隨機分為4組，對照組（C）、低劑量組（T1）、中劑量組（T2）和高劑量組（T3）組，每組4個重復，每個重復10只。在第16日齡（第一階段）時，每個重復抽取5只雞，第37日齡（第二階段）時抽取剩余5只雞，稱取肉雞體重，計算每組平均體重，腹腔注射敵草快。T1、T2和T3組分別腹腔注射5、10、20 mg·kg－1的敵草快，對照組注射相應劑量的生理鹽水。兩次注射后的當天和第5天，每個重復抽取2只，采血并取樣。結果表明：兩次注射敵草快后，與對照組相比，1）試驗組肉雞精神沉郁、飲食減少，T3組注射后6 h有2只雞出現死亡，注射后72 h和96 h試驗組肉雞體重均極顯著降低（Plt;0.01）；2）T2和T3組血清中二胺氧化酶（DAO）、谷丙轉氨酶（ALT）和谷草轉氨酶（AST）活性均極顯著（Plt;0.01）升高；3）T2和T3組血清中谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性均極顯著降低（Plt;0.01），丙二醛（MDA）水平均極顯著升高（Plt;0.01），第二階段T3組血清中超氧化物歧化酶（SOD）活性顯著降低（Plt;0.05）；4）試驗組各組血清中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白細胞介素-6（IL-6）含量均極顯著升高（Plt;0.01）；5）試驗組出現炎性細胞浸潤，部分肝細胞空泡樣變，細胞質疏松明顯，且各腸段絨毛脫落較為嚴重；組織學評分顯示，與對照組相比，T2組與T3組肝臟和小腸評分均極顯著升高（Plt;0.01），除第二階段十二指腸評分外，T1組與對照組相比無顯著差異；6）各試驗組肉雞肝臟和空腸中ZO-1和OCLDN mRNA表達量均極顯著降低（Plt;0.01）；7）肝臟中T2組HO-1 mRNA表達量顯著低于T1組（Plt;0.05）；空腸中T2組和T3組Nrf2和HO-1 mRNA表達量較T1組均極顯著降低（Plt;0.01）。綜上所述，本研究成功建立敵草快誘導的肉雞氧化損傷模型，且以10 mg·kg-1的注射劑量為建立氧化損傷模型最為適宜，同時發現敵草快可能通過Nrf2/HO-1信號通路來誘導炎癥相關因子生成且抑制抗氧化酶的表達，引起肉雞腸道屏障損傷，從而引起肉雞炎癥反應。

關鍵詞： 敵草快；氧化損傷；Nrf2/HO-1信號通路；炎癥反應

中圖分類號：S858.31

"文獻標志碼：A

文章編號：0366-6964（2024）11-5101-13

收稿日期：2024-01-25

基金項目：天津市“131”創新型人才團隊（20180338）

作者簡介：胡 月（1999-），女，內蒙古呼倫貝爾人，碩士生，主要從事動物性食品生產與安全研究，E-mail： 734853801@qq.com

*通信作者：李海花，主要從事動物營養與免疫研究，E-mail： lihaihuaok@126.com；喬家運，主要從事畜禽健康養殖研究，E-mail： qiaojy1979@126.com

Establishment and Molecular Mechanism Study of Diquat Induced Oxidative Damage Model in Broilers Chickens

HU" Yue1， YI" Ting1， QIAO" Jiayun2*， LI" Yupeng3，4，5， LI" Haihua1*

（1.Tianjin Key Laboratory of Agricultural Animal Breeding and Healthy Husbandry，

College of Animal Science and Veterinary Medicine， Tianjin Agricultural University，

Tianjin 300384，" China; 2.Tianjin Key Laboratory of Conservation and Utilization of

Animal Diversity， College of Life Sciences， Tianjin Normal University， Tianjin 300387，" China;

3.Institute of Animal Science and Veterinary， Tianjin Academy of

Agricultural Sciences， Tianjin 300381， China;

4.Tianjin Key Laboratory of

Animal Molecular Breeding and Biotechnology， Tianjin 300381，" China;

5.Tianjin

Engineering Research Center of Animal Healthy Farming， Tianjin 300381，" China）

Abstract：" The aim of this study was to establish a model of oxidative damage induced by diquat in broilers and to preliminarily reveal its molecular mechanism. A total of 160 1-day-old broilers were randomly divided into four groups： control group （C）， low-dose group （T1）， medium-dose group （T2） and high-dose group （T3）， 4 replicates per group， 10 replicates each. Five chickens were sampled in each replicate at the 16th（the first stage）， and the remaining five chickens were sampled at 37th （the second stage） day of age， broilers were weighed， the average body weight of each group was calculated， and diquat was injected intraperitoneally. The T1， T2 and T3 groups were intraperitoneally injected with 5， 10， and 20 mg·kg-1 of diquat， respectively， and the control group was injected with the corresponding dose of normal saline. The day and the fifth day after the two injections， two broilers were randomly taken from each replicate and blood collection and sampling were conducted. The results showed that after two injections of diquat， compared with the control group， 1） The broilers in the experimental groups were depressed and drank less water and eaten less， 2 broilers in the T3 group died at 6 h after each injection， and the body weight of broilers in the experimental groups were extremely significant reduced at 72 h and 96 h after each injection （Plt;0.01）; 2） The serum activity of diamine oxidase （DAO）， alanine aminotransferase （ALT） and aspartate aminotransferase （AST） in the T2 and T3 groups were extremely significant increased （Plt;0.01）; 3） The serum activity of glutathione peroxidase （GSH-Px） in the T2 and T3 groups were extremely significant decreased （Plt;0.01）， and the serum levels of malondialdehyde （MDA） were extremely significant increased （Plt;0.01）. The serum activity of superoxide dismutase （SOD） in the T3 group after the second infection was significantly decreased （Plt;0.05）; 4） The serum contents of tumor necrosis factor-α （TNF-α） and interleukin-6 （IL-6） in each experimental group were extremely significant increased （Plt;0.01）; 5） In the experimental groups， inflammatory cell infiltration was present， some hepatocytes were vacuolated， cytoplasmic was obvious laxity， and the villi loss of each intestinal segment was serious; Histological scores showed that the liver and small intestine scores in both the T2 and T3 groups were extremely significant higher than control group（Plt;0.01），

and except the histological score of duodenum at the second stage， there was no significant difference between the T1 group and the control group; 6） The mRNA expressions of ZO-1 and OCLDN in the liver and jejunum of broilers in each experimental group were extremely significant decreased（Plt;0.01）; 7） The mRNA expression of HO-1 in the liver of T2 group was significantly lower than T1 group （Plt;0.05）; The mRNA expressions of Nrf2 and HO-1 in jejunum of T2 and T3 groups were extremely significant lower than T1 group（Plt;0.01）. In summary， this study successfully established a model of oxidative damage induced by diquat in broilers， and the injection dose of 10 mg·kg-1 was the most appropriate to establish the oxidative damage model， and it was found that diquat may induce the production of inflammation-related factors and inhibit the expression of antioxidant enzymes through the Nrf2/HO-1 signaling pathway， causing intestinal barrier damage in broilers， thereby causing inflammatory response in broilers.

Key words： diquat; oxidative damage;" Nrf2/HO-1 signaling pathway; inflammatory response

*Corresponding authors：" LI Haihua， E-mail： lihaihuaok@126.com; QIAO Jiayun， E-mail： qiaojy1979@126.com

在養雞過程中，常常會遇到外界環境刺激、病原體、霉菌毒素、重金屬等因素［1］帶來的氧化應激。此時，動物體內就會產生過量的活性氧（ROS）和活性氮（RNS），導致體內氧化程度超出抗氧化物的清除能力，氧化失衡會造成細胞膜的完整性受到破壞、組織器官受損，進而引發疾病、影響動物正常代謝和生長。在高密度、集約化飼養的環境下，肉雞生產中出現的生產性能下降、產品品質降低、發病率升高及免疫機能下降等都與氧化應激有關［2］。為降低應激對肉雞產業造成的影響，一些抗氧化飼料添加劑已經普遍用于肉雞生產中。盡管目前已有建立蛋雞氧化損傷模型的報道［3］，由于不同品種對應激源的敏感性不同，很難用于評價抗氧化飼料添加劑在肉雞上的功效。因此，建立一個穩定的肉雞氧化應激模型，其重要性不言而喻。

敵草快（diquat，DQ）是一種在構建氧化損傷模型時常用的應激源，它在氧分子存在下很容易轉化為自由基，從而產生高活性超氧陰離子和其他氧化還原產物如過氧化氫（H2O2），啟動下游的靶基因隨后通過擾亂氧化劑和抗氧化過程之間的平衡而造成細胞蛋白、脂質、核酸等大分子損傷［4］。此外，DQ還會級聯炎癥反應，破壞信號通路，例如，抑制核因子-E2相關因子2（Nrf2）轉移到細胞核中，下調下游的抗氧化酶如SOD、GSH-Px、血紅素加氧酶-1（HO-1）的表達及轉錄，最終導致組織損傷。已有研究表明，DQ可以降低斷奶仔豬的生長性能，損害抗氧化能力，引起肝臟和腸道功能障礙，導致全身炎癥反應，并破壞腸道屏障完整性［5］。然而，有關DQ引致氧化損傷的分子機制尚不是十分清楚。因此，本研究以敵草快為應激源，建立引致肉雞氧化損傷的動物模型，并在模型成功建立的基礎上，探究敵草快對肉雞腸道屏障功能的影響，以及通過Nrf2/HO-1信號通路探討其氧化損傷的分子機制。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

160只1日齡817雜交肉雞，自然光照下，雞舍溫度控制在33 ℃，逐漸下降恒定至23 ℃，每日按標準飼喂基礎日糧，試驗期間自由采食和飲水，試驗期為42 d。隨機分為4組，分別為對照組（C）、低劑量組（T1）、中劑量組（T2）和高劑量組（T3），每個組4個重復，每個重復10只?；谌怆u生長階段，分別在第16日齡（第一階段）時每個重復抽取5只雞，第37日齡（第二階段）時抽取剩余5只雞，稱取肉雞體重，計算每組平均體重，腹腔注射敵草快（購自上海農藥研究所有限公司）。敵草快的注射劑量參考王曼等［6］方法并有所改進，T1組為5 mg·kg－1，T2組為10 mg·kg－1，T3組為20 mg·kg－1，對照組注射相應劑量的生理鹽水。

1.2 臨床觀察與體重稱量

在第16日齡（第一階段）和37日齡（第二階段）注射敵草快后，觀察肉雞精神狀況、糞便等臨床表現，并在注射后5 d稱量每只肉雞體重。

1.3 樣品采集

兩次注射后的當天和第5天，每個重復隨機抽取2只肉雞，進行頸靜脈采血并分離血清，置于-80 ℃保存，用于血清相關指標的測定。解剖肉雞并采集腸道和肝組織樣品，將組織分別置于4%多聚甲醛和-80 ℃中保存，用于組織切片試驗和實時熒光定量PCR檢測。

1.4 測定指標與方法

1.4.1 血清中生化、氧化損傷及炎性指標含量的測定

使用酶聯免疫吸附（ELISA）試劑盒（購自美國BD公司）檢測DAO、TNF-α和IL-6的含量，使用試劑盒（購自南京建成生物工程研究所）檢測ALT、AST、SOD、GSH-Px和MDA的含量。血清樣品按照試劑盒操作說明進行檢測。

1.4.2 肉雞肝和小腸組織切片的制作與觀察

參考吳悅等［7］組織切片方法，將4%多聚甲醛內的肉雞的肝和小腸過夜脫水、石臘包埋，并以5 μm厚進行切片，蘇木素-伊紅染色后，中性樹膠封固，使用Revolve正倒置一體顯微鏡觀察切片。參考Pang等［8］評分方法對肝細胞腫脹程度、肝細胞空泡樣變的范圍、肝細胞壞死程度進行評分，參考Ferrocino等［9］評分方法對十二指腸、空腸和回腸的腸絨毛脫落情況、腸上皮細胞腫脹和變性程度、腸黏膜下層水腫程度等病理變化程度進行評分，評分標準見表1。

1.4.3 熒光定量PCR檢測肝和空腸內關鍵緊密連接蛋白mRNA的轉錄水平

按照試劑盒說明書對肉雞組織進行RNA提取、RNA反轉錄和實時熒光定量PCR反應體系。參照劉雪姣等［10］的方法，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）為內參基因，通過2-△△Ct方法計算ZO-1和OCLDN基因的相對表達。引物序列參考文獻［11］，引物均由生工生物工程科技（北京）股份有限公司合成，引物信息見表2。所使用的熒光定量PCR試劑盒均購自美國GeneCopoeia公司。

1.4.4 熒光定量PCR檢測肝和空腸內Nrf2/HO-1信號通路中關鍵蛋白mRNA的轉錄水平

肝和空腸中Nrf2和HO-1基因的相對表達分析方法同操作步驟同“1.4.3”所述。根據NCBI數據庫中肉雞Nrf2、HO-1和GAPDH的mRNA序列，利用Primer Premier 6.0軟件設計引物，引物均由生工生物工程科技（北京）股份有限公司合成，引物信息見表2。

1.5 數據統計與分析

利用Excel對試驗數據進行整理，通過SPSS 20.0軟件進行獨立樣本t檢驗分析，使用GraphPad Prism 9.0進行繪圖。P≤0.05為差異顯著，Plt;0.01為差異極顯著，Pgt;0.05為無顯著差異。

2 結 果

2.1 肉雞的臨床表現及體重變化

在試驗期間，對照組肉雞體態活潑、呼吸平穩、糞便性狀及飲水進食均正常。注射敵草快48 h后，試驗組均出現精神沉郁、呆臥少動、呼吸淺快、飲水進食減少、糞便不成形等現象，至注射后72 h，出現掉毛、眼部輕度充血、偶見眼鼻部血性分泌物，且注射劑量越高，上述臨床表現越明顯。隨著攻毒時間延長，至96 h后，肉雞精神狀態、食欲、行為活動等逐漸緩解。兩次攻毒后對照組和試驗組的臨床表現基本相似。觀察不同攻毒劑量肉雞21 d和42 d的存活情況發現，T3組均在注射敵草快6 h后，出現2只肉雞死亡，其余組各時間點均無死亡。

兩次攻毒敵草快后肉雞體重變化情況見圖1。與對照組相比，試驗組在兩次注射敵草快后均出現不同程度的體重下降。在注射敵草快后0、24和48 h時，各組之間體重無顯著差異。在注射后72、96和120 h時，試驗組各組體重均極顯著低于對照組（Plt;0.01），其中，在注射后72 h時，T3組體重極顯著低于T1組（Plt;0.01）；在注射后96 h時，T3組體重極顯著（Plt;0.01）低于T1和T2組；在注射后120 h時，T3組體重極顯著低于T1和T2組（Plt;0.01），但在第一次注射時，T3和T2組體重無顯著差異。試驗組攻毒至96 h后，體重均逐步回升，但仍低于正常水平。

2.2 敵草快對肉雞血清中生化指標的影響

注射當天對各組肉雞血清及組織檢測均無顯著差異，故數據未顯示，下同。

敵草快對肉雞血清生化指標的影響結果見圖2。與對照組相比，第一次注射敵草快后T1組血清中DAO（Plt;0.01）和第二次注射敵草快后T1組血清ALT和AST的活性極顯著升高（Plt;0.01），而兩次注射敵草快后T2和T3組血清中DAO、ALT和AST的活性均極顯著升高（Plt;0.01，圖2A～2F）。

2.3 敵草快對肉雞血清中氧化損傷指標的影響

第一階段注射敵草快對肉雞血清氧化損傷指標的影響，結果如圖3A～3C所示。與對照組相比，各試驗組血清中SOD活性無顯著差異（圖3A）；T2和T3組GSH-Px活性極顯著低于對照組（Plt;0.01），且T3組極顯著低于T1組（Plt;0.01，圖3B）；T2和T3組MDA水平均極顯著高于對照組（Plt;0.01），且T2和T3組MDA水平均極顯著高于T1組（Plt;0.01，圖3C）。

第二階段注射敵草快對肉雞血清氧化損傷指標的影響，結果如圖3D～3F所示。與對照組相比，各試驗組SOD和GSH-Px活性均降低，其中，T3組SOD活性顯著低于對照組（Plt;0.05），T2和T3組GSH-Px活性均極顯著低于對照組（Plt;0.01，圖3D、3E）；T2和T3組MDA水平均極顯著高于對照組（Plt;0.01），且T3組中MDA水平極顯著高于T1組（Plt;0.01，圖3F）。

2.4 敵草快對肉雞血清中炎性指標的影響

敵草快對肉雞血清炎性指標的影響結果見圖4。兩次注射敵草快后，各試驗組血清中TNF-α含量均極顯著高于對照組（Plt;0.01，圖4A、4C），且T3組極顯著高于T1組（Plt;0.05）；與對照組相比，各試驗組血清中IL-6含量均極顯著升高（Plt;0.01），且各試驗組之間無顯著差異（圖4B、4D）。

2.5 肉雞組織切片觀察

第一階段和第二階段注射敵草快肉雞組織切片觀察結果分別見圖5和圖6。兩次注射敵草快后，肝組織的變化情況是：與對照組相比，T1組均為結構組織松散，少量炎性細胞浸潤；T2組炎性細胞增多，部分肝細胞空泡樣變，肝竇輕度擴張；T3組肝細胞點狀壞死，炎性細胞增多，組織結構松散嚴重。小腸組織的變化情況是：對照組各段小腸腸絨毛排列整齊，少有炎性細胞浸潤；T1組均出現少量炎性細胞，部分絨毛脫落，空腸固有層出現病理水腫；T2組均為炎性細胞增多，絨毛脫落較為嚴重且部分隱窩丟失，空腸和回腸出現固有層病理水腫；T3組均為絨毛壞死脫落嚴重，大量炎性細胞浸潤且出現長絨毛水腫，十二指腸固有層出現病理水腫。

采用組織學評分分析敵草快對肝和小腸組織結構影響，結果如圖7所示。兩次注射敵草快后，與對照組相比，T1組肝臟和小腸各段評分均無顯著差異（圖7A和7B），但在第二階段注射后，T1組十二指腸評分極顯著高于對照組（Plt;0.01，圖7B）；與對照組相比，T2和T3組肝和小腸各段評分均極顯著（Plt;0.01）升高，但T3和T2組相比無顯著差異。

綜合組織切片觀察及組織學評分結果，在后續試驗中選用肝和空腸進行研究。

2.6 敵草快對肉雞肝和空腸緊密連接蛋白mRNA表達的影響

敵草快對肉雞肝和空腸緊密連接蛋白mRNA表達分析見圖8。兩次注射敵草快后，與對照組相比，各試驗組肉雞肝和空腸中ZO-1和OCLDN mRNA表達量均極顯著降低（Plt;0.01），其中，T2組和T3組尤為明顯，但在第二階段注射后，T2組肝和空腸中OCLDN mRNA表達量與T1組相比無顯著差異，T3組極顯著低于T1組（Plt;0.01），且與T2組無顯著差異（圖8C和8D）。

2.7 敵草快對肉雞肝和空腸Nrf2/HO-1信號通路中關鍵蛋白mRNA表達的影響

敵草快對肉雞肝臟和空腸Nrf2/HO-1信號通路中關鍵蛋白mRNA表達分析見圖9。兩次注射敵草快后，與對照組相比，肝和空腸中各試驗組Nrf2和HO-1 mRNA表達量均極顯著降低（Plt;0.01），其中，T2組肝中HO-1 mRNA表達量顯著（Plt;0.05）低于T1組，T3組極顯著（Plt;0.01）"" 或顯著（Plt;0.05）低于T1和T2組（圖9A和9C）；空腸中T2和T3組Nrf2和HO-1 mRNA表達量較T1組均極顯著降低（Plt;0.01），T2和T3組Nrf2 mRNA表達量無顯著差異（圖9B和9D）。

3 討 論

腸道不僅是營養物質消化吸收的主要場所，也是人體最大的免疫器官，完整的腸道結構是免疫防御的基礎。DAO是具有高度活性的細胞結構酶，在動物小腸黏膜上層絨毛中，DAO不僅參與核酸和蛋白質的合成，還調控腸黏膜細胞增殖。當血清中DAO水平升高，表明腸道黏膜屏障功能衰竭或細胞壞死，因此，DAO活性或含量常用于反映腸道屏障功能［12］。在本研究中，與對照組相比，T2和T3組DAO含量極顯著升高，表明注射敵草快對肉雞腸道產生了負面影響，一定程度上對腸道屏障功能造成了損傷。此外，腸屏障功能受損、肝炎癥反應和肝氧化應激都與肝損傷的產生有著復雜的聯系［13］。當肝細胞受到損傷時，存在于肝細胞漿內的ALT和肝細胞線粒體中的AST會釋放到血液中，即血清中的ALT與AST水平會增加。有研究表明，小鼠在受到氧化應激時，血清中ALT與AST含量會顯著升高［14］。與前人研究一致，在本試驗中，T2和T3組血清中ALT和AST含量與對照組相比極顯著升高，而T1組在第一階段注射后血清中ALT和AST含量含量相較于對照組和T2組無顯著差異，這說明注射不同劑量敵草快會導致肉雞受到不同程度的應激，進而導致機體代謝異常。

在畜禽生產中，當機體氧化應激使動物處于亞健康狀態時，體內過多的氧自由基會對細胞脂質、蛋白質和DNA造成不可逆的損害，進而破壞組織器官黏膜屏障，使機體功能損傷，容易引起疾病的發生，最終導致畜禽生產性能、繁殖性能、畜產品品質降低等現象，嚴重影響生產經濟效益。SOD和GSH-Px在抗氧化防御系統中起著至關重要的作用。SOD和GSH-Px可以有效清除體內過多的自由基，減少脂質過氧化，防止自由基對機體造成損害，維持體內氧化平衡。MDA是氧化損傷的標志物，是脂質過氧化的結果，可導致DNA重組和細胞凋亡［15］。研究表明，動物發生氧化損傷反應，其血清或組織中抗氧化酶活性或表達量顯著降低，SOD和GSH-Px含量降低，MDA水平顯著升高，而組織形態結構變化、生長性能等指標可用于說明機體氧化損傷程度［16］。本研究中，腹腔注射敵草快不同程度的降低了肉雞血清中SOD和GSH-Px含量，并促使MDA水平的升高，尤其T2與T3組GSH-Px含量相較于對照組極顯著降低，且MDA水平極顯著升高，這與前人研究一致。此外，結合肉雞臨床表現、體重和生化相關指標和組織病理觀察結果可知，在注射敵草快后，肉雞體重下降，血清生化指標升高，腸道組織形態受損，顯示氧化還原失衡且超過了機體自身的調節能力，使機體發生了氧化損傷反應，即肉雞氧化損傷模型建立成功。

動物在被不同的刺激劑激活后，會表達過量的炎癥介質，如一氧化氮（NO），以及TNF-α、IL-1β和IL-6等促炎性細胞因子［17］。當機體內TNF-α過量產生或釋放時，可引發炎癥信號通路的激活，抑制OCLDN和ZO-1表達，誘發腸道和肝臟等組織損傷［18-19］。此外，TNF-α可作用于多種細胞，使機體釋放大量的IL-6，從而激發一系列炎癥反應。Tacke和Weiskirchen［20］發現，IL-6通過上調高脂飲食喂養小鼠中脂肪生成基因的表達，可導致肝臟脂肪炎癥和脂肪變性。因此，TNF-α和IL-6作為促炎因子常被用于評價畜禽的炎癥和感染反應［21］。有研究表明，利用敵草快誘導的氧化應激，會引起斷奶仔豬血清中TNF-α和IL-6含量呈增長趨勢［22］。與上述研究相似，本研究發現，注射敵草快會誘導肉雞產生炎癥反應，且T2與T3組血清中TNF-α和IL-6含量均極顯著升高，說明肉雞的免疫系統被激活，導致促炎性細胞因子過量產生，加劇了肉雞的炎性反應。此外，結合組織病理觀察結果可知，利用敵草快攻毒肉雞可導致肝細胞受損加重肝臟損傷，以及破壞腸道組織形態結構，進而影響腸道屏障功能。

緊密連接蛋白由OCLDN、CLAUDIN和ZO-1等多種蛋白組成，這些蛋白可調節相鄰細胞中水、離子和大分子的胞外通透性，還可作為屏障來限制分子和離子的通過，從而防止某些炎癥性疾病的發生，加強細胞間連接，避免細胞損傷。OCLDN具有維持緊密連接穩定性以及小腸通透性的作用；ZO-1可維持上皮細胞極性和腸道屏障通透性，并且決定了細胞間聚合的位置，調節基因表達和細胞增殖［23］。緊密連接蛋白的減少，降低了腸上皮的硬度，提高了腸屏障的通透性，從而增加了腸道炎癥的發生風險［24］。此外，肝中緊密連接蛋白與肝細胞和膽管細胞結合，并參與膽汁分泌、流動和代謝相關的生理功能。因此，OCLDN和ZO-1在蛋白水平和基因水平上的表達情況常被用于評價肝的損傷以及腸機械屏障功能的完整性［25］。本試驗中，注射敵草快顯著降低了肉雞肝臟和空腸中緊密連接蛋白的表達量，特別是T2與T3組與對照組相比，肝臟和空腸中ZO-1和OCLDN mRNA含量均極顯著降低，但在第42日齡時，T2組肝和空腸中OCLDN mRNA表達量T1組相比無顯著差異，而T3組極顯著低于T1組。結合以上指標的結果可知，敵草快導致肉雞發生氧化損傷是影響肝和腸道屏障損傷的一個重要原因，提示與其它試驗組相比，兩個階段均以注射劑量為10 mg·kg－1的敵草快用于建立肉雞氧化損傷模型較為穩定且最為適宜。

機體內正常的代謝遭受外源刺激時會源源不斷地產生ROS，而ROS升高能夠使細胞質中的Keap1失活，導致細胞中的Nrf2清除受阻，積累的Nrf2異位到細胞核中，促進HO-1的產生，誘導細胞自噬，發揮抗氧化作用，并增加抗氧化蛋白的表達，減少炎癥和氧化損傷［26］。研究表明，Nrf2/HO-1信號通路是體內最重要的抗氧化防御機制之一［27］。Nrf2是抗氧化系統中的關鍵調節因子，調節細胞內氧化還原穩態、炎癥反應和其他生物過程［28］。HO-1是機體內主要的抗氧化蛋白，可以促進血紅素的降解以及膽綠素的生成，并清除氧化還原失衡所積累的自由基，從而發揮抗氧化作用［29］。此外，Nrf2可抑制NF-κB、TNF-α、IL-6和其他促炎性細胞因子的表達，并發揮抗炎作用［26］。有研究發現，當肝細胞產生大量ROS時，GSH抗氧化系統被激活，泛素化的Nrf2進入細胞核受到抑制，HO-1減少，進而導致肝功能損傷［30］。并且，炎性細胞因子和趨化因子可通過抗氧化應激信號失活和炎癥信號通路激活導致腸道氧化應激和腸道屏障損傷，而Nrf2/HO-1信號通路是腸炎介導的氧化應激和炎癥的關鍵調節因子［31］。還有研究表明，激活Nrf2/HO-1信號通路可有效改善動物肝臟和腸道中的抗氧化能力［32-33］。在本試驗中，隨著敵草快濃度的增加，肉雞肝臟和空腸中Nrf2和HO-1 mRNA表達量相對幅度的顯著降低，推測敵草快可能是通過Nrf2/HO-1信號通路導致機體抗氧化能力降低，引起肉雞氧化損傷。

4 結 論

本試驗成功建立敵草快誘導的肉雞氧化損傷模型，且以注射劑量為10 mg·kg－1的敵草快建立肉雞氧化損傷模型最為適宜。同時發現，敵草快可能通過抑制Nrf2和HO-1的mRNA表達量，從而促進炎性細胞因子TNF-α和IL-6的生成增多，引起腸道屏障損傷，導致肉雞出現炎癥反應。

參考文獻（References）：

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（編輯 范子娟）