山羊痘病毒錨蛋白ORF140對NF-κB信號通路的調控作用

摘 要： NF-κB通路是病毒調控宿主免疫功能的一個重要靶點，在病毒感染致病的過程中發揮重要作用。研究證明，一些痘病毒編碼的錨蛋白可通過多種方式調控NF-κB通路，但山羊痘病毒編碼的錨蛋白對NF-κB通路有怎樣的調控作用尚未有研究報道。為了探究山羊痘病毒編碼的錨蛋白ORF140對NF-κB通路的調控作用，作者通過雙熒光素酶報告系統檢測山羊痘病毒錨蛋白ORF140對NF-κB通路的影響；采用間接免疫熒光檢測ORF140在HEK293T細胞中的定位；應用Western blot技術分別檢測在NF-κB通路被激活的不同時間點ORF140對NF-κB通路相關因子的影響。結果顯示：ORF140能夠抑制NF-κB通路；ORF140定位于細胞質中，且在NF-κB通路被激活的情況下也未發生核移位；ORF140能夠抑制NF-κB-p65的核移位與p-IκBα的降解。山羊痘病毒錨蛋白ORF140定位在細胞質中，通過抑制NF-κB-p65的核移位與p-IκBα的降解來下調NF-κB通路的活性。

關鍵詞： 山羊痘病毒；錨蛋白；NF-κB；ORF140

中圖分類號： S852.659.1

文獻標志碼：A

文章編號：0366-6964（2024）11-5191-09

收稿日期：2024-01-17

基金項目：國家自然科學基金項目（32260874）

作者簡介：馮秋媛（1999-），女，湖北隨州人，碩士生，主要從事動物疫病病原分子生物學研究，E-mail： fengqiuyuan0808@163.com

*通信作者：陳軼霞，主要從事動物重大疫病病原分子生物學研究，E-mail： chenyx69@126.com；景志忠，主要從事動物疫苗與分子免疫學研究，E-mail： zhizhongj@163.com

Regulation of the NF-κB Signaling Pathway by Goat Poxvirus Ankyin Protein ORF140

FENG" Qiuyuan1，2， YU" Hanwei1，2， YANG" Yunfeng1，2， ZHANG" Hui1，2， HANWU" Weiyi2，

SUN" Xintong2，

SHAO" Xiaolong1，2， LIU" Junlin1， CHEN" Guohua2， JING" Zhizhong2*， CHEN" Yixia1*

（1.College of Life Science and Engineering， Northwest Minzu University， Lanzhou 730030，

China;

2.State Key Laboratory for Animal Disease Control and Prevention， Key Laboratory of

Veterinary Public Health of Ministry of Agriculture， Lanzhou Veterinary Research Institute，

Chinese Academy of Agricultural Sciences， Lanzhou 730046，" China）

Abstract：" The NF-κB pathway is an important target for regulation of host immune function by viruses and plays an important role in the pathogenesis of viral infections. It has shown that the ankyrin protein encoded by some poxviruses regulates the NF-κB pathway in a variety of ways， but how the ankyrin protein encoded by goat poxvirus （GTPV） regulates the NF-κB pathway remains to be explored. In this paper， we aim to investigate the effects of the ankyrin protein ORF140 encoded by GTPV on the NF-κB pathway. The effects of ankyrin protein ORF140 on the NF-κB pathway were detected using dual luciferase reporter system， its localization in HEK293T cells was observed by indirect immunofluorescence and its effects on expression of the factors associated with the activated NF-κB pathway at different time points by Western blot. Results showed that ORF140 was able to inhibit the NF-κB pathway. It was localized in the cytoplasm and did not undergo nuclear translocation even when the NF-κB pathway was activated. ORF140 was able to inhibit the nuclear translocation of NF-κB-p65 and the degradation of p-IκBα. GTPV ORF140 localizes in the cytoplasm and downregulates NF-κB transcriptional activity by inhibiting the nuclear translocation of NF-κB-p65 and the degradation of p-IκBα.

Key words： goat poxvirus; ankyrin protein; NF-κB; ORF140

*Corresponding authors：" CHEN Yixia， E-mail： E-mail： chenyx69@126.com; JING Zhizhong， E-mail： zhizhongj@163.com

山羊痘病毒（goatpox virus，GTPV）是痘病毒科（Poxviridae）、脊索動物痘病毒亞科（Chordopoxrinae）、山羊痘病毒屬（Capripoxvirus）的成員，由147個開放閱讀框（open reading frame，ORF）組成。全基因組長度約為150 kb，包括中心編碼區（ORF24～123）和兩個側翼編碼區（ORF1～23、ORF 124～147）。其引起的山羊痘被世界動物衛生組織（WOAH）列為法定通報動物疫病。該病主要流行于非洲中部和北部、中東、印度次大陸、中亞和中國部分地區［1-3］。病畜常有發熱、全身呈現出膿皰樣病變并伴有淋巴結腫大，羔羊死亡率高達50%以上［4］，給養羊業造成重大損失，嚴重阻礙國際貿易的發展。

NF-κB屬于核轉錄因子家族，對免疫系統的調節起關鍵性的作用［5］。在哺乳動物細胞中，NF-κB蛋白家族包括五個成員，分別是NF-κB1（p50）、NF-κB2（p52）、RelA（p65）、RelB和c-Rel。這些蛋白都有一個特征性的Rel同源結構域（Rel homology domain，RHDs），不同成員可通過這個結構域相互形成二聚體或者與DNA結合。在缺乏外界刺激的條件下，胞質內的NF-κB二聚體的Rel結構域被抑制蛋白IκBs結合，呈非活性狀態。病毒感染機體后，上游蛋白（例如TNF受體-1）激活IκB激酶（IKK）復合物，催化IκBα兩個保守的絲氨酸殘基磷酸化，接著在SCF（Skpl-Cull-F-box，SCF）E3泛素連接酶復合物的催化下多泛素化而被蛋白酶體降解使NF-κB活化，隨后NF-κB進入細胞核與基因組DNA的特定位點結合，啟動抗病毒基因的表達［6-7］。痘病毒為了能保證自身在宿主細胞中正常復制，進化出多種獨特的對抗機體抗病毒免疫反應的機制，其中，NF-κB信號通路是痘病毒抑制和逃避宿主免疫應答的主要靶點［8-9］。

研究表明，痘病毒編碼的錨蛋白（ankyrin repeats，ANK）/F-box可以通過多種方式調控NF-κB通路［10-13］，包括拮抗PKR通路［14］、在細胞核中抑制NF-κB的功能［15］、直接影響NF-κB的活性［16］、抑制IκBα的降解［12，17］、阻止NF-κB的核移位［18］、阻斷IFN的信號傳導［19］等。GTPV編碼5個錨蛋白（ORF010、138、140、141.2、145）［20］，其對NF-κB信號通路有怎樣的調控作用尚未見報道。因此，本研究探討了GTPV ORF140在HEK293T細胞中的定位及其對NF-κB信號通路的調控作用，為探索山羊痘病毒編碼的錨蛋白在痘病毒感染過程中發揮的作用提供了線索。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞與質粒

HEK293T細胞、pcDNA3.1-3×FLAG-N載體由中國農業科學院蘭州獸醫研究所家畜疫病病原生物學國家重點實驗室保存和提供。pcDNA3.1-FLAG-ORF140重組質粒由武漢金開瑞生物工程有限公司優化合成。

1.1.2 主要試劑

質粒提取試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司。DNA Marker購自寶日醫生物技術（北京）有限公司。蛋白Marker、RIPA裂解液、Kpn Ⅰ和BamH Ⅰ快切酶、Lipofectamine 2000、TNF-α購自Thermo Fisher Scientific公司；胞質和胞核提取試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；兔抗IKKα抗體、兔抗IκBα抗體、兔抗磷酸化的IκBα （phosphorylated I-kappa B proteins α，p-IκBα）抗體、兔抗NF-κB-p65抗體、兔抗組蛋白H3（histone H3）抗體、山羊抗小鼠IgG Hamp;L（Alexa Fluor 594）和HRP標記的山羊抗兔IgG均購自Abcam公司；小鼠抗標簽（FLAG）抗體、兔抗β-tubulin抗體、小鼠抗β肌動蛋白（β-actin）抗體和HRP標記的山羊抗小鼠IgG購自Sigma-Aldrich公司。報告質粒pGL4.32［luc2P/NF-κB-RE/Hygro］、內參質粒pGL4.74［hRluc/TK］和雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自北京普洛麥格生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 pcDNA3.1-FLAG-ORF140重組質粒的雙酶切驗證及表達

在NCBI上搜索得到GTPV Pellor株錨蛋白ORF140基因序列。由武漢金開瑞優化合成重組質粒pcDNA3.1-FLAG-ORF140。雙酶切驗證：5 μL 10×FastDigest緩沖液，30 μL pcDNA3.1-FLAG-ORF140重組質粒，1 μL KpnⅠ，1 μL BamHⅠ，13 μL ddH2O。將配好的體系放入37℃水浴5 min后，加入10 μL 6×DNA上樣染料，取10 μL進行瓊脂凝膠電泳驗證雙酶切片段大小。

將生長良好的HEK293T細胞接種于6孔板，待細胞匯合至75%時，分別轉染pcDNA3.1-3×FLAG-N和pcDNA3.1-FLAG-ORF140各2.5 μg，轉染24 h后，用RIPA裂解液裂解細胞提取總蛋白。取上述蛋白樣品20 μg進行SDS-PAGE。4 ℃、250 mA轉膜1 h。5%脫脂牛奶室溫封閉2 h（稀釋液為1×TBST）。分別用小鼠抗FLAG抗體（1∶3 000）、小鼠抗β-actin抗體（1∶2 000），4 ℃搖床過夜孵育；TBST洗滌3次后，分別加入HRP標記的山羊抗小鼠IgG（1∶5 000）或HRP標記的山羊抗兔IgG（1∶10 000），室溫孵育1 h；TBST充分洗膜，滴加ECL發光顯色試劑盒的A與B液的混合液于Bio-Rad Western顯色儀曝光。

1.2.2 雙熒光素酶報告基因系統檢測ORF140對NF-κB通路的影響

將生長良好的HEK293T細胞接種于24孔板，分4組，每組設6個重復孔，待細胞匯合至75%時利用Lipofectamine 2000共轉染pcDNA3.1-FLAG-ORF140、報告質粒pGL4.32［luc2P/NF-κB-RE/Hygro］及內參質粒pGL4.74［hRluc/TK］。pcDNA3.1-3×FLAG-N、pcDNA3.1-FLAG-ORF140總量均為500 ng·孔-1，報告質粒pGL4.32［luc2P/NF-κB-RE/Hygro］為500 ng·孔-1，內參質粒pGL4.74［hRluc/TK］為50 ng·孔-1。pcDNA3.1-FLAG-ORF140設4個劑量梯度，分別為0、125、250、500 ng·孔-1，不足100 ng時用pcDNA3.1-3×FLAG-N空載體補足。轉染24 h后每組3個重復孔加入1 μL濃度為10 ng·μL-1的TNF-α溶液，使培養液中TNF-α的終濃度為20 ng·mL-1，另外3個重復孔加入相同體積的無血清DMEM基礎培養液。刺激細胞6 h后收獲細胞，通過雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒測定螢光素酶活性。

1.2.3 間接免疫熒光檢測ORF140蛋白在HEK293T細胞的定位

使用多聚賴氨酸在室溫包被20 mm的共聚焦皿30 min，干燥后將生長良好的HEK293T細胞接種于20 mm的共聚焦皿中，分3組，每組設3個重復，待共聚焦皿的細胞匯合至75%時，試驗組兩組利用Lipofectamine 2000轉染pcDNA3.1-FLAG-ORF140 2.5 μg；對照組轉染pcDNA3.1-3×FLAG-N 2.5 μg。轉染24 h后，取一組試驗組加入4 μL濃度為10 ng·μL-1的TNF-α溶液，使培養液中TNF-α的終濃度為20 ng·mL-1，另外兩組加入相同體積的無血清DMEM基礎培養液。刺激細胞6 h后，棄去原有培養基，吸棄細胞上清液，用4%多聚甲醛室溫固定15 min、0.1% Triton X-100室溫通透30 min、含10%山羊血清的PBS封閉液室溫封閉30 min。然后，加入小鼠抗FLAG單克隆抗體作為一抗，4 ℃放置過夜；再加入Alexa Fluor 594標記的山羊抗小鼠IgG抗體作為二抗，室溫孵育1 h；最后，加入DAPI對細胞核室溫染色5 min，置于激光共聚焦顯微鏡下觀察ORF140的定位情況。

1.2.4 ORF140對NF-κB通路關鍵因子的影響

將生長良好的HEK293T細胞接種于12孔板，待細胞匯合至75%時，分別轉染pcDNA3.1-3×FLAG-N和pcDNA3.1-FLAG-ORF140各2.5 μg，轉染24 h后，加入4 μL濃度為10 ng·μL-1的TNF-α溶液，使培養液中TNF-α的終濃度為20 ng·mL-1，繼續培養0、15、30、60 min后收集細胞，利用胞質胞核蛋白提取試劑盒，分別提取胞質蛋白和胞核蛋白。取上述蛋白樣品20 μg進行SDS-PAGE。4 ℃、250 mA轉膜1 h。5%脫脂牛奶室溫封閉2 h（稀釋液為1×TBST）。分別用兔抗IKKα抗體（1∶1 000）、兔抗IκBα抗體（1∶1 000）、兔抗p-IκBα抗體（1∶1 000）、兔抗NF-κB-p65抗體（1∶1 000）、兔抗histone H3抗體（1∶1 000）、兔抗β-tubulin抗體（1∶2 000）、小鼠抗β-actin抗體（1∶2 000），4 ℃搖床過夜孵育；TBST洗滌3次后，分別加入HRP標記的山羊抗小鼠IgG（1∶5 000）或HRP標記的山羊抗兔IgG（1∶10 000），室溫孵育1 h；TBST充分洗膜，滴加ECL發光顯色試劑盒的A與B液的混合液于Bio-Rad Western顯色儀曝光。

1.2.5 統計學分析

所有涉及統計學分析的數據至少重復3次，以“x±s”表示，用t檢驗分析數據平均值間的統計學差異。*. Plt;0.05；**. Plt;0.01；***. Plt;0.001；****. Plt;0.000 1。

2 結 果

2.1 ORF140蛋白在HEK293T細胞中的表達

通過質粒圖譜分析，pcDNA3.1-FLAG-ORF140重組質粒中ORF140蛋白基因大小為1 509 bp，其編碼蛋白分子大小為61.7 ku。將pcDNA3.1-FLAG-ORF140重組質粒通過KpnⅠ、BamH Ⅰ進行雙酶切鑒定，得到1 509 bp的目的條帶（圖1A），這說明pcDNA3.1-FLAG-ORF140重組質粒構建成功。將重組質粒轉染 HEK293T細胞24 h后，收集并裂解細胞，通過Western blot技術檢測ORF140蛋白的表達情況。結果顯示，檢測出一條約61.7 ku帶FLAG標簽的目的蛋白，表明重組質粒pcDNA3.1-FLAG-ORF140可在HEK293T細胞內表達（圖1B）。

2.2 ORF140蛋白對NF-κB轉錄活性的影響

為研究ORF140對NF-κB信號通路的調節作用，在HEK293T細胞中通過雙熒光素酶報告系統檢測ORF140的對NF-κB轉錄活性的影響。Western blot檢測結果顯示，隨著質粒轉染濃度的遞增，ORF140蛋白的表達量逐漸增加（圖2A）；雙熒光素酶報告系統顯示，pcDNA3.1-FLAG-ORF140對NF-κB轉錄活性具有顯著的抑制作用，且抑制作用隨ORF140表達量的增加有逐步增強的趨勢（圖2B）。

2.3 ORF140蛋白在HEK293T細胞中的定位

為了探究GTPV ORF140蛋白在TNF-α刺激或不刺激情況下的細胞定位，將pcDNA3.1-FLAG-ORF140質粒與pcDNA3.1-3×FLAG-N質粒分別轉染HEK293T細胞，24 h后用或不用TNF-α培養液刺激細胞6 h之后，通過間接免疫熒光試驗檢測ORF140的亞細胞定位。結果顯示，未刺激的細胞組中紅色熒光分布于細胞質中，未與細胞核重疊；刺激的細胞組中紅色熒光也分布于細胞質中，未與細胞核重疊（圖3），證明ORF140蛋白靶向定位于細胞質中，且在NF-κB通路被激活的情況下也未發生核移位。綜上所述，推測ORF140蛋白可能在細胞質中發揮作用從而下調NF-κB轉錄活性。

2.4 ORF140對NF-κB-p65核移位的影響

NF-κB-p65的核移位是NF-κB信號通路激活的重要標志。為探討ORF140抑制NF-κB信號通路活性的機制，通過Western blot技術分別檢測pcDNA3.1-3×FLAG-N轉染組與pcDNA3.1-FLAG-ORF140轉染組中，細胞質和細胞核中NF-κB-p65的蛋白表達量。結果顯示，TNF-α刺激30 min后，pcDNA3.1-FLAG-ORF140轉染組與pcDNA3.1-3×FLAG-N轉染組相比，其NF-κB-p65的核移位蛋白量相對減少，而滯留在細胞質中的量多于對照組（圖4），說明NF-κB-p65核移位受到抑制。

2.5 ORF140對IKKα磷酸化、IκBα磷酸化、p-IκBα降解的影響

NF-κB-p65核移位的前提是IKKα磷酸化、IκBα磷酸化與p-IKBα降解。為進一步探討ORF140抑制NF-κB活性的作用位點，通過Western blot技術分別檢測pcDNA3.1-3×FLAG-N轉染組與pcDNA3.1-FLAG-ORF140轉染組中IKKα蛋白量、IκBα蛋白量和p-IκBα蛋白量。結果顯示，pcDNA3.1-FLAG-ORF140轉染組中IKKα與IκBα的總蛋白量與pcDNA3.1-3×FLAG-N對照組一致（圖5B、C）；在TNF-α刺激15 min時，pcDNA3.1-FLAG-ORF140轉染組與pcDNA3.1-3×FLAG-N對照組相比，p-IKBα總蛋白量相對增加（圖5D），表明IKKα的磷酸化、IκBα的磷酸化均未受到影響，而p-IκBα的降解被抑制。

3 討 論

NF-κB通路是機體免疫系統重要的信號轉導調節系統，是病毒調控宿主免疫功能的一個重要靶點，在病毒感染致病的過程中起關鍵作用［21-22］。許多研究證明，各種痘病毒通過編碼大量的免疫調節蛋白作用于這一重要靶系統，應對機體的免疫清除和免疫反應［23］。其中錨蛋白是主要的免疫調控分子之一，但錨蛋白在感染過程中的確切作用尚不明確［24］。目前有關痘病毒錨蛋白抑制NF-κB信號通路的研究已有很多［25］，但山羊痘病毒編碼的錨蛋白對NF-κB通路有怎樣的調控作用尚未見報道。

通過生物信息學分析比對發現，GTPV ORF140與羊口瘡病毒（orf virus，ORFV）編碼的錨蛋白ORF008和ORF123的C末端都具有一個保守的F-box結構域，GTPV ORF140與ORFV ORF008的N末端都含有7個錨蛋白重復序列（ANK基序），而ORFV ORF123的N末端含有9個ANK基序，說明GTPV ORF140與ORFV ORF008和ORF123可能具有相似的功能。間接免疫熒光試驗證實GTPV ORF140定位于細胞質中（圖3），這與ORFV ORF008與ORF123的細胞定位相同［26-27］。

有研究證明ORFV編碼的錨蛋白ORF008、ORF123、ORF126、ORF128、ORF129都能夠抑制NF-κB信號通路，進而為病毒復制提供有利環境［28-29］。雙熒光素酶報告基因檢測系統結果顯示GTPV ORF140對NF-κB轉錄活性具有顯著的抑制作用，且該抑制作用具有劑量依賴性（圖2）。進一步研究發現GTPV ORF140能夠抑制NF-κB-p65的核移位（圖4）。IKKα磷酸化、IκBα磷酸化與p-IKBα降解是NF-κB-p65核移位的上游反應，故深入檢測了GTPV ORF140對IKKα磷酸化、IκBα磷酸化與p-IKBα降解的影響。結果顯示，GTPV ORF140能夠顯著抑制p-IκBα的降解，但IKKα與IκBα的磷酸化均未受到影響（圖5），故推測GTPV ORF140可能通過抑制p-IκBα的降解與NF-κB-p65的核移位參與調控NF-κB信號通路。病毒感染機體后，上游蛋白（如TNF受體-1）激活IKK復合物，活化的IKK復合物催化IκBα產生磷酸化，磷酸化的IκBα（p-IκBα）在SCF（Skpl-Cull-F-box，SCF）E3泛素連接酶復合物的催化下降解，釋放NF-κB-p65二聚體，隨后NF-κB-p65二聚體產生核移位，在細胞核中與基因組DNA的特定位點結合，從而啟動抗病毒基因的表達［6］。NF-κB-p65的核移位是NF-κB信號通路激活的重要標志。ORFV ORF008與ORF123可通過抑制p-IκBα的降解來抑制NF-κB-p65的入核，進而抑制NF-κB信號通路的活化［26-27］。這與本研究結果相似，進一步說明了GTPV ORF140可能通過抑制p-IκBα的降解與NF-κB-p65的核移位來下調NF-κB的轉錄活性。

在宿主細胞中，p-IκBα會被SCF E3泛素連接酶復合物識別發生泛素化降解，而SCF E3泛素連接酶復合物由含有RING結構域的蛋白Roc1，以及Cullin-1、Skp1和含有F-box結構域的底物銜接蛋白β-TrCP組成。Cullin-1作為分子支架，連接Roc1與Skp1，而Skp1可與底物銜接蛋白β-TrCP的F-box結構域互作從而形成E3泛素連接酶復合物［12］。已有研究證明鼠痘病毒（ectromelia virus，ECTV）編碼的錨蛋白EVM002、EVM005、EVM154和EVM165［12］，牛痘病毒（cowpox virus，CPXV）編碼的錨蛋白CP77［11］均可借助其F-box結構域與Skp1互作來調節SCF E3泛素連接酶復合物從而抑制p-IκBα的降解。本研究發現，GTPV ORF140也能夠抑制p-IκBα的降解（圖5D），鑒于GTPV ORF140與鼠痘病毒編碼的錨蛋白及CPXV CP77也具有相似的C端F-box結構域。因此，后續可進一步驗證GTPV ORF140是否也能通過其C端F-box結構域與Skp1互作來抑制p-IκBα的降解，從而影響NF-κB的轉錄活性。

4 結 論

本研究結果表明GTPV ORF140定位在細胞質中，可能通過阻斷p-IKBα降解與NF-κB-p65核移位來抑制NF-κB通路的活性，為闡明GTPV編碼的錨蛋白在痘病毒感染過程發揮的作用作出了新的解釋。

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（編輯 白永平）