嵌合流行毒株G-H環基因重組口蹄疫病毒的拯救及其免疫原性分析

摘 要： 為了研究能有效免疫防控當前流行的O型3個拓撲型口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease virus， FMDV）的疫苗候選株，本研究利用FMDV反向遺傳操作技術，通過基因替換，構建同時含當前流行的O型三個拓撲型病毒株結構蛋白基因的重組全長克隆，轉染表達T7RNA聚合酶的細胞后拯救重組FMDV，分析結構蛋白基因的重構對病毒生物學特性的影響；拯救病毒制備滅活疫苗，免疫豬和牛，用體外中和試驗初步研究其作為O型FMD疫苗候選株的潛力。結果表明FMD流行毒株結構蛋白VP1 G-H環基因的替換沒有明顯影響重組病毒的噬斑表型和復制能力，但不同FMDV G-H環抗原表位對豬誘導機體產生交叉中和抗體水平影響較大，對牛誘導機體產生交叉中和抗體的影響較小，表明FMDV G-H抗原表位是豬免疫優勢的表位。本研究為未來FMDV疫苗的設計提供了重要參考。

關鍵詞： G-H環；重組口蹄疫病毒；拯救；免疫原性分析

中圖分類號： S852.659.6

文獻標志碼：A

文章編號：0366-6964（2024）11-5222-08

收稿日期：2024-01-02

基金項目：“十四五”國家重點研發計劃項目（2023YFD1802501）

作者簡介：李平花（1973-），女，甘肅武威人，研究員，博士，主要從事病毒分子生物學和口蹄疫疫苗研究，E-mail： lipinghua@caas.cn

*通信作者：劉在新，主要從事病毒分子生物學研究，E-mail： liuzaixin@caas.cn;盧曾軍，主要從事病毒生物學和免疫學，E-mail： luzengjun@caas.cn

Rescue and Immunogenicity Analysis of Recombinant Foot-and-Mouth Disease Virus with

the Chimera of G-H Loop Gene of the Epidemic Strain

LI" Pinghua1，2， HUANG" Shulun1，2， ZHANG" Keqiang1，2， LIU" Feng1，2， SUN" Pu1，2， LI" Dong1，2，

BAO" Huifang1，2， CAO" Yimei1，2， BAI" Xingwen1，2， MA" Xueqing1，2， LI" Kun1，2， YUAN" Hong1，2，

LIU" Zaixin1，2*， LU" Zengjun1，2*

（1.State Key Laboratory for Animal Disease Control and Prevention， College of Veterinary

Medicine， Lanzhou University， Lanzhou Veterinary Research Institute， Chinese Academy of

Agricultural Sciences， Lanzhou 730000，" China;

2.Gansu Province Research Center for Basic Disciplines of Pathogen Biology，

Lanzhou 730046，" China）

Abstract： In order to develop FMD vaccine candidate strain that could effectively prevent and control recently epidemic strains belonging to three topotypes of serotype O FMDV， we constructed recombinant full-length clone containing the structural protein genes belonging to three topotypes of type O FMDV by gene replacement based on FMDV reverse genetic manipulation technique. The recombinant FMDV was rescued after transfection the full-length plasmid into BSR/T7 cells expressing T7 RNA polymerase. The effect of gene reconstruction on the biological characteristics of the recombinant virus was analyzed， pigs and cattle were vaccinated with the vaccines prepared from the recombinant virus and parental virus， the potential of the recombinant virus as a vaccine candidate strain for type O FMD was preliminarily studied by in vitro neutralization test. The results showed that the replacement of G-H loop gene of structural protein VP1 of FMD epidemic strain did not significantly affect the plaque phenotype and replication ability of the recombinant virus， but different G-H has obvious effect on production the cross-neutralizing antibody in pigs， and has little effect on production the cross-neutralizing antibody in cattle， indicating that FMDV G-H loop is the immune dominance epitope for pigs. This study will provide important reference for the design of FMDV vaccine in future.

Key words： G-H loop; recombinant foot-and-mouth disease viruse; rescue; immunogenicity analysis

*Corresponding authors：" LIU Zaixin， E-mail： liuzaixin@caas.cn; LU Zengjun， E-mail： luzengjun@caas.cn

口蹄疫（foot-and-mouth disease， FMD）是豬、牛和羊等主要家畜易感染的一種烈性傳染病。該病的暴發和流行，嚴重危害家畜的生產力和畜產品質量，影響家畜及其產品的國際貿易，給發病地區的畜牧業造成巨大的經濟損失。如1997年我國臺灣地區暴發豬FMD，造成超過80 億美元的經濟損失［1］，2001 年英國暴發FMD，造成約237 億英鎊的經濟損失［2］。因此，世界各國仍十分重視對FMD的防控。

我國是FMD流行的國家，近年來主要流行A型和O型FMD，其中A型FMD趨于控制，而O型FMD依然嚴重危害我國畜牧養殖業。分析其病原——口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease virus， FMDV）的遺傳演化，發現近年流行的O型FMDV主要為三個拓撲型［中東-南亞型（ME-SA）、東南亞型（SEA）和古典中國型（Cathay）］中的四個譜系［PanAsia譜系（ME-SA）、Ind-2001譜系（ME-SA）、Mya-98譜系（SEA）和Cathay譜系］病毒株［3］。其中O/SEA/Mya-98譜系病毒株自2010年流行至今仍未消滅，是近年流行最嚴重、防控難度最大、且持續危害我國畜牧養殖業的主要病毒株。分析該譜系流行毒株的結構蛋白氨基酸序列，發現其VP1蛋白上出現了規律性氨基酸的變異，導致田間流行毒株和疫苗毒株抗原匹配性降低［3］，因此需要及時篩選抗原性匹配的疫苗候選株。

FMDV粒子由20 面體對稱的衣殼和一條單股正鏈RNA組成，病毒衣殼由各60分子的結構蛋白VP4、VP2、VP3和VP1組成，它們是病毒感染和疫苗免疫產生保護性抗體的主要免疫原［4］。FMDV基因在免疫壓力下高度易變，尤其是病毒粒子表面的抗原位點，從而使病毒能夠逃避宿主的免疫識別。O型FMDV表面至少含有5 個抗原位點，其中結構蛋白VP1的G-H環是FMDV誘導機體產生中和抗體最重要的抗原表位，在疫苗免疫保護方面發揮著非常重要的作用［4-5］。該環也是FMDV基因組中變異頻率最高的部位，其上一個或幾個氨基酸的突變常引起病毒抗原性的變異。如中東地區流行的A型FMDV結構蛋白VP1第149 位氨基酸（在G-H環內）的突變導致病毒抗原性的改變，使常用的A型FMD疫苗毒株與流行毒株抗原不匹配［6］。Baba等研究發現，Asia1型FMD流行株和疫苗毒株G-H環的不同，導致疫苗不能免疫保護動物免遭流行病毒株的攻擊［7］。

利用病毒反向遺傳操作技術構建能同時表達兩種以上病毒亞型抗原的嵌合病毒疫苗也是當前疫苗研究主要方向。為了研制能有效免疫防控我國當前流行的O型三個拓撲型FMDV的疫苗候選株，本研究以已建立的含兩個拓撲型FMDV（Cathay+ME-SA）結構蛋白基因的全長克隆為骨架，用當前流行的Mya-98譜系流行毒株結構蛋白VP1 G-H抗原表位基因（30個氨基酸）替換嵌合病毒的對等基因，構建含O型三個拓撲型FMDV結構蛋白主要免疫基因的重組FMDV，并制備疫苗免疫豬和牛，用體外中和試驗初步研究其作為O型FMD疫苗候選株的潛力。

1 材料與方法

1.1 細胞、質粒和病毒

BSR/T7細胞由德國Karl-Klaus Conzelmann 教授惠贈，BHK-21 細胞為宿主抗病毒感染與免疫生物學團隊保存；FMDV 疫苗株O/HN/93（Cathay拓撲型）全長感染性克隆的框架［8］上，嵌合疫苗毒株O/TUR/05/2009（ME-SA拓撲型）VP1 基因的全長質粒pOFS/TURVP1 和半長質粒pSK-Z123/TURVP1［8］ 為蘭州獸醫研究所宿主抗病毒感染與免疫生物學團隊構建保存。全長質粒pOFS/TURVP1 轉染拯救獲得的基因工程病毒rHN/TURVP1 為本團隊保存［8］。FMDV O/GXCX/CHA/2018（MH791316.1）、O/NXYCh/CHA/2018 （MH791315.1）、O/Tibet/99（AJ539138）和O/XJ/CHA/2017（MF461724.1）為國家口蹄疫參考實驗室分離保存。

1.2 主要試劑

限制性內切酶BglⅡ、SpeⅠ、NotⅠ、PstⅠ、高保真DNA聚合酶Taq、一步法（one-step）RT-PCR試劑盒、T4 DNA連接酶、DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒、DNA片段回收試劑盒、感受態細胞JM109均購自TaKaRa公司；細胞培養基、抗生素和胎牛血清購自Gibco公司；轉染試劑Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司；質粒提取試劑盒、DNA Ladder購自全式金生物科技有限公司；FITC標記的山羊抗鼠IgG抗體購自BOSTER生物工程有限公司；FMDV-3B單克隆抗體由研究團隊制備保存。

1.3 FMDV重組全長克隆的構建

以已構建的質粒pSK-Z123/TURVP1 為骨架，替換FMDV O/NXYCh/CHA/2018流行毒株G-H 環基因（長約30 個氨基酸）的半長質粒pSK-Z123/TURVP1/NXG-H 由金唯智股份有限公司合成。該質粒用SpeⅠ和BglⅡ酶切后將5 400 bp的基因片段插入用同樣酶消化的全長質粒pOFS/TURVP1 中，構建重組全長質粒pOFS/TURVP1/NXG-H。重組質粒用PstⅠ內切酶進行酶切鑒定，鑒定正確的質粒送金唯智股份有限公司進行測序驗證。FMDV 重組全長基因示意見圖1。

1.4 重組FMDV的拯救

測序正確的重組全長質粒pOFS/TURVP1/NXG-H 用NotⅠ酶線性化，并純化回收后作為轉染模板，用LipofectamineTM2000 介導轉染單層BSR/T7細胞（細胞培養在六孔板），具體步驟見操作說明書。轉染后的細胞置37℃ 5% CO2培養箱繼續培養。每日觀察轉染細胞出現致細胞病變效應（cytopathogenic effect， CPE）的情況，連續觀察2～4 d。當轉染細胞出現明顯的CPE時，收集細胞，反復凍融3 次后在BHK-21細胞上連續傳代備用。拯救的重組FMDV命名為rHN/TURVP1/NXG-H。

1.5 重組FMDV的鑒定

1.5.1 RT-PCR 和序列測定

收集轉染的細胞上清，提取細胞總RNA，用一步法RT-PCR 試劑盒和引物VP1-F（AGATAACACAGGGAAAGCC）和VP1-R（CTGATGGCCTTCACTCCAGT）擴增含VP1 結構蛋白的特定基因片段。基因片段純化回收后送金唯智股份有限公司進行序列測定，驗證重組病毒的正確性。

1.5.2 間接免疫熒光試驗

生長至70%～80%滿的BHK-21單層細胞（置12 孔板），分別接種親本病毒和重組病毒。5～8 h后用常規間接免疫熒光法檢測感染細胞是否有FMDV 特定蛋白的表達。

1.5.3 電鏡觀察

用貼壁BHK-21細胞分別增殖FMD親本病毒和重組病毒各200 mL，凍融2～3次后，12 000 r·min―1離心收集上清，加BEI滅活。滅活完成后12 000 r·min―1離心，收集病毒上清，4℃條件下35 000 r·min―1離心3 h，收集的沉淀用PBS（pH7.6）緩沖液重懸，磷酸鎢負染，電鏡觀察病毒粒子的形態。

1.6 重組病毒的生長特性

1.6.1 蝕斑試驗

將第6代親本病毒和重組病毒分別做10倍系列稀釋，然后將不同稀釋度病毒分別接種長滿的BHK-21 細胞（200 μL·孔―1，6孔板），用常規的噬斑試驗方法觀察病毒的蝕斑表型，并計算每個病毒的蝕斑形成單位（PFU·mL―1）。

1.6.2 一步生長曲線

將第6代重組病毒和親本病毒以2×106病毒劑量接種長滿的單層BHK-21 細胞（25 mL培養瓶），加5 mL MEM培養基，置于37℃ CO2培養箱繼續培養。接種后4、8、12、16和20 h收取樣品，反復凍融2次，在BHK-21單層細胞上（96孔板）用噬斑法測定病毒毒價（PFU·mL―1）（試驗進行2次重復），繪制一步生長曲線。

1.6.3 重組FMDV遺傳穩定性分析

將親本病毒和轉染上清接種長滿的BHK-21單層細胞（T25細胞瓶），待接種轉染上清的細胞95%～100%出現CPE時收獲細胞，反復凍融3次后繼續連續傳代，觀察第6代后病毒接種細胞致95%～100%以上細胞出現典型CPE的時間，并對第5、10代病毒進行 RT-PCR，檢測拯救的重組FMDV結構蛋白氨基酸的變化。

1.7 FMDV滅活疫苗的制備

將電鏡觀測試驗滅活的病毒抗原接種BHK-21細胞，接種72h后收集細胞反復凍融3次后，繼續在BHK-21細胞上連傳3～5次，進行滅活安全檢驗。檢驗合格后，蔗糖梯度離心法純化病毒，用液相色譜儀檢測病毒抗原的146S含量。ISA201佐劑置于37℃恒溫水浴鍋預熱，按抗原：佐劑體積比=46∶54的比例配制疫苗，置于4～8 ℃保存備用。

1.8 動物試驗

選取90日齡健康易感的豬12 頭和60日齡健康易感的牛14 頭（O型口蹄疫液相阻斷ELISA抗體效價＜1∶6，3ABC抗體陰性），隨機分為A組和B組，每組6 頭豬和7 頭牛。A組所有動物免疫接種rHN/TURVP1病毒疫苗，B組每頭動物免疫接種rHN/TURVP1/NXG-H病毒疫苗，免疫劑量為每頭2 mL（12 μg）。所有動物免疫28 d后采血，收集血清，―20℃保存備用。

1.9 病毒中和試驗

免疫28 d動物的血清，用微量病毒中和試驗分析免疫血清與我國當前流行的三個拓撲型的四個譜系FMDV株（O/GXCX/CHA/2018、O/HB/HK/99、O/XJ/CHA/2017和O/NXYCh/CHA/2018）的交叉反應性，具體步驟參考WOAH標準。當病毒回歸試驗、陽性、陰性、正常細胞對照，血清毒性對照全部成立時，統計試驗結果，用Karber法計算中和抗體效價。

2 結 果

2.1 FMDV重組全長質粒的構建

構建的重組全長質粒pOFS/TURVP1/NXG-H用PstⅠ內切酶進行酶切鑒定，電泳結果顯示切出與預期大小相符的目的條帶（591、3 282和7 200 bp）（見圖2）。酶切鑒定正確的質粒送金唯智股份有限公司進行序列測定，結果表明重組質粒為正確構建的質粒，含靶標基因的替換（圖略）。

2.2 重組病毒的拯救

線化的重組全長質粒pOFS/TURVP1/NXG-H轉染BSR/T7細胞56 h后，約70%細胞變大、變圓，而對照細胞無任何變化。隨著轉染時間的延長，出現CPE的細胞越來越多。轉染72 h后（圖略）收集轉染樣品，反復凍融后繼續在BHK-21細胞上連續傳代。

2.3 拯救病毒的鑒定

2.3.1 RT-PCR

轉染細胞上清RT-PCR和序列測定結果表明：重組病毒rHN/TURVP1/NXG-H含有預期的替換，說明試驗成功構建了目的基因替換的重組FMDV。兩個重組病毒G-H環氨基酸的差異見圖3。

2.3.2 免疫熒光檢測

用抗FMDV特異的3B單抗檢測重組病毒3B蛋白的表達，結果表明兩個病毒感染的BHK-21 細胞均能與FMDV 3B單抗反應，出現特異的綠色熒光；而對照細胞與3B單抗作用看不到任何可見熒光（見圖4），說明拯救的重組病毒為FMDV。

2.3.3 電鏡觀察

拯救的重組FMDV磷酸鎢染色后用電鏡觀察，結果顯示：重組病毒和親本病毒形態一樣，直徑約為25 nm、病毒粒子呈球形，與FMDV的形態完全一致（見圖5）。

2.4 重組病毒的生長特性

2.4.1 噬斑試驗

重組病毒和親本病毒的噬斑試驗結果表明2 個FMDV均可在BHK-21 細胞上形成大小混合的噬斑，且噬斑大小形態相似（見圖6A）。

2.4.2 一步生長曲線

病毒的生長動力學結果表明重組病毒和親本病毒具有相似的復制動力學，說明FMDV O/NXYCh/CHA/2018 G-H環的替換沒有明顯影響重組FMDV在BHK-21細胞上的復制能力（見圖6B）。

2.4.3 重組FMDV的遺傳穩定性分析

重組FMDV病毒在BHK-21細胞上連續傳代，感染細胞出現CPE的時間越來越短，傳到第6 代時趨于穩定，95%以上細胞出現CPE的時間約為12 h左右。對第5 代和第10 代重組病毒結構蛋白進行序列測定，結果表明拯救重組病毒傳至第10 代未引起任何堿基和氨基酸的突變，說明重組病毒遺傳穩定。

2.5 病毒中和試驗

中和試驗的結果表明：重組病毒疫苗免疫豬均產生了針對O/NXYCh/CHA/2018、O/XJ/CHA/2017和O/HB/HK/99病毒較低的、保護性的平均中和抗體（lg抗體滴度gt;1.65，WOAH規定lg中和抗體滴度≥1.65判為保護），而親本病毒疫苗免疫豬均產生了針對這3個病毒較高的、保護性的平均中和抗體（lg抗體滴度gt;2.10）（見圖7）；兩個病毒疫苗均不能誘導豬產生針對O/GXCX/CHA/2018病毒保護性的平均中和抗體（lg抗體滴度lt;1.65），但親本病毒疫苗誘導豬產生的針對O/GXCX/CHA/2018的平均中和抗體顯著（Plt;0.01）高于重組病毒的（見圖7）；而兩個疫苗免疫的牛均產生了針對4個試驗病毒保護性的平均中和抗體（lg抗體滴度gt;1.65）（見圖8）。這些結果表明流行株O/NXYCh/CHA/2018 G-H環的替換，明顯降低了重組病毒疫苗免疫豬血清交叉中和當前流行的O型FMDV的能力（Plt;0.01），但沒有明顯影響免疫牛血清交叉中和當前流行的O型FMDV的能力，表明FMDV結構蛋白VP1的G-H環是豬免疫優勢的表位。

3 討 論

FMDV滅活疫苗仍是目前FMD防控免疫效果最優的疫苗，它在預防、控制和凈化FMD方面發揮了非常重要的作用。但FMDV是RNA病毒，基因組高度易變，常出現抗原變異株，需要不時地篩選與流行毒株抗原高度匹配的疫苗毒株。但傳統的方法篩選FMD疫苗毒株費時、費力，而反向遺傳操作技術的發展為新型疫苗的研發提供了強大的工具，利用該技術人們可以對RNA病毒基因進行修飾和改造，獲得生產性能提高，抗原匹配，免疫應答能力增強的疫苗候選株。

FMDV結構蛋白VP1βG-βH環上有一個基因高變區（hyper variable，HV），它在FMDV免疫逃逸中起著非常重要的作用［9-13］。研究表明FMDV可以容忍這些區域氨基酸的突變，但突變會影響抗體與表位的結合以及中和抗體的產生［13-14］。研究也表明嵌合FMDV高度易變的G-H環抗原表位，能夠提高病毒的交叉反應性和疫苗的交叉保護能力，拓展疫苗的抗原譜［15-16］。另外，研究表明中和抗體是衡量FMD免疫保護最重要的指標之一，與動物的保護效力密切相關［17］，而體外病毒中和試驗是FMD疫苗株篩選的方法之一，它具有操作簡單，成本低廉，不需要昂貴的動物等優點，因此，在本研究中，作者利用FMDV反向遺傳操作技術，在已構建重組FMDV的骨架上，替換我國當前多發的O/SEA/Mya-98流行毒株G-H抗原表位，構建重組FMDV，制備疫苗免疫豬、牛，用體外病毒中和試驗初步研究重組FMDV作為O型疫苗候選株的潛力。中和試驗的結果表明兩個疫苗免疫的牛均能對O型FMD四個譜系流行毒產生保護性的平均中和抗體，而兩個疫苗免疫的豬均能對O/ME-SA/PanAsia、O/ME-SA/Ind-2001和O/SEA/Mya-98譜系病毒產生保護性的平均中和抗體，但均不能對O/Cathay病毒產生保護性的平均中和抗體，說明FMDV不同的G-H環抗原表位對豬誘導機體產生交叉中和抗體的影響較大，對牛誘導機體產生交叉中和抗體的影響較小，這與先前的報道一致：FMDV的中和抗原位點的免疫優勢性表位因種屬而不同［18］。

4 結 論

本研究表明FMDV 結構蛋白VP1上的 G-H環是豬免疫優勢的表位，這為未來FMDV疫苗的設計提供了重要參考。

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（編輯 白永平）