利用CRISPR/Cas9技術創制番茄青枯病抗性基因Slmlo1/6突變體

摘 要： "青枯病是番茄（Solanum lycopersicum）生產中的一種毀滅性土傳病害，致病菌生理小種復雜、易變異，而MLO基因隱性突變mlo具有廣譜抗性，前期研究表明Slmlo1/6可能參與番茄青枯病抗性反應。為進一步研究番茄Slmlo1/6青枯病抗性基因功能，該文利用CRISPR/Cas9技術創制Slmlo1/6基因突變材料，并進行表型鑒定。結果表明：（1）設計SlMLO1/6靶點序列gRNA，并與U6啟動子組裝，再將含高效靶點的U6-gRNA1/6片段通過Bsa I酶切連入CRISPR載體pBGK，構建形成雙基因融合敲除載體pBGK-SlMLO1/6。重組質粒經轉化大腸桿菌（Escherichia coli）感受態DH5α和平板培養，挑選陽性單克隆。驗證正確后，再經根癌農桿菌（Agobacterium tumefaciens） GV3101介導的遺傳轉化和潮霉素抗性篩選，最終獲得9株番茄編輯苗。（2） 靶點區測序顯示，植株M2和M8分別缺失177 bp和7 bp的SlMLO1片段，M7缺失12 bp的SlMLO6片段，M9發生SlMLO6單堿基T插入，總計4株單基因純合突變體，其他均為雜合型突變。（3）RT-qPCR分析表明，與野生型相比，突變株SlMLO1/6基因表達水平顯著下降，尤其是M2、M7和M8。（4）表型鑒定表明，SlMLO1/6可能是番茄青枯病易感基因。綜上，該文成功構建了MLO基因編輯載體并實現了番茄轉化，純合突變體獲得了青枯病抗性。氨基酸丟失和移碼突變可能是Slmlo1/6抗性功能轉變的主要原因。該研究結果為番茄抗青枯病基因功能研究和抗病育種應用提供了理論參考和遺傳工程材料。

關鍵詞： 番茄， Slmlo1/6， 基因編輯， 遺傳轉化， 突變體

中圖分類號： "Q943"文獻標識碼： "A

文章編號： "1000-3142（2024）12-2163-09

Bacterial wilt resistance gene Slmlo1/6 mutants in tomato created by CRISPR/Cas9 technology

SHI Jianlei1， 2， XIONG Zili1， SU Shiwen1， FU Cunnian1， ZAI Wenshan1*

（ 1. Southern Zhejiang Key Laboratory of Crop Breeding， Wenzhou Vocational College of Science and Technology， Wenzhou 325006，

Zhejiang， China; 2. College of Agriculture， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou 350002， China ）

Abstract： "Bacterial wilt is a devastating soil-borne disease in tomato （Solanum lycopersicum） production. The pathogenic species are complex and tend to have a variation， while mlo caused by the recessive mutation of MLO genes has a broad-spectrum resistance. The previous study suggested that Slmlo1/6 may be involved in the resistance response to bacterial wilt in tomato. In order to further study the gene function of Slmlo1/6 in tomato bacterial wilt resistance， the genetic mutant plants were created by CRISPR/Cas9 technology and their phenotypes were identified followed. The results were as follows： （1） gRNA sequences of SlMLO1/6 were designed and assembled with the U6 promoters， then U6-gRNA1/6 fragments containing highly effective targets were ligated to CRISPR vector of pBGK via restriction enzyme Bsa I digestion， to construct the two-gene fusion knockout vector of pBGK-SlMLO1/6. The recombinant plasmid of pBGK-SlMLO1/6 was transformed into Escherichia coli DH5α competent cells and positive monoclonal clones were selected via plate cultivation. Using Agrobacterium tumefaciens GV3101 strains-mediated genetic transformation and resistance screening to hygromycin， a total of nine edited tomato plants were obtained with sequencing validation. （2） Target region sequencing showed that M2 and M8 plants had the 177 bp and 7 bp deletion of SlMLO1， respectively， M7 had the 12 bp deletion of SlMLO6， and M9 had a single base T insertion of SlMLO6. Except for four single gene homozygous mutants above， the other mutations were heterozygous. （3） RT-qPCR showed that compared with the wild type plant， SlMLO1/6 gene expression of the mutants was significantly decreased， especially M2， M7， and M8 plants. （4） Phenotypic identification indicated that SlMLO1/6 might be tomato bacterial wilt susceptibility genes. In conclusion， the knockout vector is successfully constructed for resistance MLO genes and tomato transformation is also achieved， homozygous mutants acquire resistance to bacterial wilt. Amino acid deletion and frameshift mutation may be the crucial reasons for the gene function change of Slmlo1/6 in resistance. The results provide a theoretical reference and genetic engineering materials for the gene function study in resistance to bacterial wilt and disease resistance breeding application of" tomato.

Key words： tomato， Slmlo1/6， gene editing， genetic transformation， mutant

作為植物基因功能研究和作物遺傳改良的有力工具，規律成簇間隔短回文重復序列及其相關系統（clustered regularly interspaced short palindromic repeat/CRISPR-associated 9， CRISPR/Cas9）是目前應用最廣的一項基因編輯技術，主要由單導RNA （single guide RNA， sgRNA）和Cas9組成（Mali et al.， 2013）。sgRNA通過識別目的基因前間區鄰近基序（protospacer aceradjacent motif， PAM），引導Cas9對靶序列進行切割，產生雙鏈斷裂，修復過程中引起靶點突變，進而產生表型變異。

MLO （mildew resistance locus O）是一類最早在大麥（Hordeum vulgare）中發現并克隆的白粉病易感基因（Buschges et al.， 1997），其隱性突變mlo對白粉菌的幾乎所有生理小種都具有高效和持久抗性（Reinstdler et al.， 2010）。此后，在多種高等植物中相繼發現其同源基因，突變同樣具有白粉病抗性（Kusch amp; Panstruga， 2017）。利用基因編輯技術，多個mlo被證明是白粉病抗性基因，如番茄（Solanum lycopersicum） Slmlo1、辣椒（Capsicum annuum） Camlo1/2、茄子（Solanum melongena） Smmlo1、煙草（Nicotiana tabacum） Ntmlo1和黃瓜（Cucumis sativus） Csmlo1等（Zheng et al.， 2013; Appiano et al.， 2015; Nie et al.， 2015; Bracuto et al.， 2017）。除白粉病以外，mlo也參與假單胞菌、黃單胞菌、卵菌、尖孢鐮刀菌、炭疽菌和稻瘟病菌等多種病原體引起的植物病害反應（Kim amp; Hwang， 2012; Kim et al.， 2014; Acevedo-Garcia et al.， 2017）。

番茄是全球范圍內重要的蔬菜作物，也是一種理想的基因編輯作物，但在生產中頻繁遭受各種逆境脅迫。作為最重要的植物病原細菌之一，青枯菌（Ralstonia solanacearum）引起的青枯病對番茄危害尤為嚴重，因此建立快速高效的抗病品種選育方法勢在必行。前期研究發現，SlMLO1/6均含有7個跨膜結構域，定位于原生質膜，SlMLO1含1個鈣調素結合區（calmodulin binding domain， CaMBD） （Shi et al.， 2020）。同時，SlMLO1是已知的白粉病易感基因，SlMLO6與辣椒感青枯病基因CaMLO6同源（Bai et al.， 2008; Yang et al.， 2020）。RT-qPCR顯示兩者均能在轉錄水平上響應番茄青枯病害（Shi et al.， 2020）。本研究以番茄青枯病抗性突變體創制為對象，依托植物廣譜抗性因子mlo和番茄遺傳轉化體系，基于已有MLO生物信息學和基因定量表達研究，采用CRISPR/Cas9基因編輯技術，通過構建SlMLO1/6基因敲除載體并轉化番茄，擬探討以下問題：（1）番茄中MLO的精準敲除和純合突變體的創制；（2）靶點突變類型和突變前后目的基因的表達變化；（3）突變株的青枯病抗性表型。旨在為抗青枯病基因功能研究和品種改良提供理論基礎和遺傳工程材料。

1 材料與方法

1.1 材料試劑

供試番茄（Solanum lycopersicum） Ailsa Craig （AC），是分子功能研究的模式品種。CRISPR系統pBGK購自百格基因科技（江蘇）有限公司。大腸桿菌（Escherichia coli） DH5α和根癌農桿菌（Agobacterium tumefaciens） GV3101為本實驗室保存。

Trizol總RNA提取試劑盒、凝膠回收試劑盒、熒光定量染料SYBR Premix Ex Taq等購自生工生物工程（上海）股份有限公司；PCR Master Mix、DNA Marker、T4 DNA連接酶（Ligase）、T4多聚核苷酸激酶（PNK）等購自寶生物工程（大連）有限公司；限制性核酸內切酶Bsa I和Sph I購自TaKaRa公司；卡那霉素和潮霉素購自鼎國生物公司。培養基組分等所需生化試劑均為國產分析純。PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 試驗方法

1.2.1 靶點設計與載體構建 利用在線工具CRISPR-P2.0 （http：//cbi.hzau.edu.cn/CRISPR2/）于目的基因第1和第3外顯子處設計2個CRISPR靶位點，選取高效靶點設計引物（表1）。將gRNA靶點序列復性形成Oligo二聚體后，連接至經Bsa I酶切的CRISPR載體pBGK。反應體系如下：gRNA-U6片段1 μL、Oligo二聚體0.3 μL、T4 ligase 0.3 μL和T4 PNK 0.1 μL 23 ℃反應1 h后，加T4 ligase 0.3 μL、ddH2O 4 μL和pBGK 1 μL 23 ℃連接反應1 h。取5 μL上述反應液，加入20 μL大腸桿菌DH5α感受態細胞，混合后冰浴靜置30 min；輕輕取出，42 ℃熱激35 s，立即置于冰上2 min；加入100 μL LB，37 ℃振蕩培養1 h；取60 μL菌液涂布于含50 μg·mL-1卡那霉素的LB平板上，37 ℃倒置培養過夜。挑選陽性單克隆送樣測序。測序引物SR：CTGCAGAATTGGCGCACGCGCTACG。

1.2.2 根癌農桿菌介導的遺傳轉化 利用凍融法轉入根癌農桿菌GV3101，經鑒定正確的單菌落用葉盤法轉化番茄AC （簡興等， 2015）。主要操作如下：1/2 MS培養基播種番茄無菌種子，待子葉展開第一片真葉還未出現時，剪取子葉進行預培養，根癌農桿菌侵染后共培養，轉至潮霉素分化選擇培養基，經3次繼代培養后，將減去愈傷組織的芽轉至生根培養基培養，待幼苗長至合適大小煉苗移栽。

1.2.3 轉化株靶點擴增與測序 提取轉化單株幼嫩葉片基因組DNA。根據目的基因序列設計引物（表1），對靶點區進行PCR檢測。將擴增目的條

帶進行純化和測序，結合測序峰圖及序列比對分析突變類型。PCR擴增體系：1 μL DNA，2 μL 10×PCR buffer，0.4 μL dNTP Mixture，正反向引物各0.2 μL，0.2 μL Taq酶，加ddH2O補充至20 μL。擴增條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個循環；72 ℃延伸10 min。

1.2.4 目的基因RT-qPCR檢測 取樣4～6葉期番茄幼苗嫩葉，錫箔紙包裹置于液氮中，2次生物學重復。提取野生型和突變株RNA并反轉錄成cDNA。以Slactin和SlRPL2為內參基因，利用Primer Premier 5.0軟件設計定量引物（表1）。RT-qPCR反應體系包括2 μL cDNA， 0.4 μL PCR primer， 10 μL SYBR， 7.2 μL ddH2O。擴增程序為95 ℃ 3 min; 95 ℃ 5 s， 60 ℃ 30 s， 45個循環，整體反應在StepOne Plus型熒光定量PCR儀（ABI， USA）中進行，采用2-ΔΔCt法計算基因相對表達量。

1.2.5 苗期青枯病接種鑒定 番茄幼苗長至4～6片真葉時，剪傷部分根系，用濃度OD600=1.0的青枯菌液浸根20 min，30 ℃條件下培養，第3天觀察植株抗性表型。

2 結果與分析

2.1 融合載體的構建與轉化

SlMLO1靶點1序列為CCACAGCAATTGCCCACGTAGGG，靶點2序列為ATGGCATCCTTGTATGGCAAAGG；SlMLO6靶點1序列為ACACCAACTTGGGCTGTGGCTGG，靶點2序列為CAAAGGAGGAGGAACACCGTAGG，靶點長20 bp （圖1）。對應的脫靶位點數分別為5/31和26/33，因此雙基因均選用第1靶點。融合載體命名為pBGK-SlMLO1/6，含U6啟動子驅動表達的雙基因靶點gRNA克隆盒、35S啟動子驅動表達的Cas9酶基因和潮霉素（HYG）篩選標記基因（圖2）。回收Sph I酶切后的產物，經0.8%瓊脂糖凝膠電泳分別得到5 500 bp和10 000 bp左右的兩個條帶（圖3），與重組質粒15 386 bp大小相符，測序與設計靶點相同，表明2個靶點gRNA元件插入載體。隨后，融合載體經根癌農桿菌介導的番茄遺傳轉化（圖4）和PCR測序（圖5），最終獲得9個編輯單株（M1、M2、M3、M4、M6、M7、M8、M9、M10）。

2.2 編輯株靶點序列突變型

測序結果表明，編輯植株M1為SlMLO6雜合突變體；M2和M8分別缺失1個大小為177 bp （包括起始密碼子，翻譯MEATPTWAIAVVCFILLAIS）和7 bp （GGGCAAT，翻譯WAI）的SlMLO1基因片段，而SlMLO6為雜合型突變；M3和M10為SlMLO1雜合突變體；M4和M6均為雙基因雜合突變體；M7缺失1個大小為12 bp （CAACTTGGGCTG，翻譯PTWAV）的SlMLO6基因片段，而SlMLO1為雜合型突變；M9基因SlMLO6位置382～383間插入了1個單堿基T （翻譯V），而SlMLO1為雜合型突變（圖5）。

2.3 目的基因定量表達分析

基因定量表達結果表明，兩個內參下，與野生型（WT）相比，純合突變株M2和M8 SlMLO1表達水平均極顯著（Plt;0.01）下降，前者表達水平更低但兩者差異不顯著（圖6：A，C）。以Slactin為內參，純合突變株M7和M9 SlMLO6表達水平均極顯著（Plt;0.01）下降，前者表達水平更低且兩者差異顯著（圖6：B）；以SlRPL2為內參，M7和M9 SlMLO6表達水平均比野生型低，但顯著性水平不同，前者為極顯著（Plt;0.01）而后者為顯著（Plt;0.05）突變用位置、類型（缺失或插入）和堿基的組合表示，WT和M分別代表野生型和突變體。

（圖6：D）。整體而言，Slactin更適合用作內參基因，M2、M7和M8突變效果更為明顯。

2.4 編輯株青枯病抗性表型

基于基因測序和定量表達結果，對敲除效果明顯的3個純合單株M2、M7和M8進行青枯病抗性表型鑒定。發現接種青枯菌后，植株長勢明顯優于野生型（WT）番茄，觀察期內基本未出現病癥（圖7），說明SlMLO1/6可能參與番茄青枯病負調控。

3 討論與結論

青枯菌具有廣泛的環境和生態適應性。目前，利用正向遺傳學僅在擬南芥中克隆到一個抗青枯病基因RRS1 （Deslandes et al.， 1998），相關基因鑒定、功能研究及生產應用還非常有限。因此，廣譜抗性挖掘和感病基因失活成為研究熱點。與其他基因功能研究技術相比，基因編輯具有克隆策略相對簡單、可多靶點敲除、脫靶率較低、適用范圍廣等優點（Ma et al.， 2015）。利用CRISPR/Cas9基因編輯技術定向敲除不利基因，能實現目標性狀的遺傳改良。并且，通過后代遺傳分離可以獲得不含載體元件的突變株系。mlo代表了一類由寄主基因突變控制的廣譜抗性新機制，能夠參與多種生物和非生物脅迫響應（Nguyen et al.， 2016）。基于此，本研究利用CRISPR/Cas9系統成功構建了SlMLO1/6基因編輯載體，經轉化番茄和測序鑒定，獲得9株突變體，約50%為純合突變株。

Slmlo1/6突變體不同位點編輯效果和類型不同，純合突變包括片段缺失和單堿基插入，說明二倍體植物基因編輯多產生簡單突變（Ma et al.， 2015）。M2和M8 SlMLO1編碼蛋白分別丟失了20個和3個氨基酸且發生移碼突變；M7 SlMLO6丟失了5個氨基酸但新增了1個亮氨酸，下游序列不變；M9 SlMLO6密碼子GTG突變為GTT，兩者均翻譯纈氨酸，但后續氨基酸移碼突變，推測基因功能轉變主要源自氨基酸丟失和移碼突變。蒲艷等（2018）研究表明，多個活性U6啟動子可驅動多個sgRNA，造成染色體大片段缺失。同時，穩定轉化植株中以堿基缺失和插入為主，可能是sgRNA和Cas9可持續表達，靶點產生的堿基替換被繼續編輯。非同源末端連接（non-homologous end joining， NHEJ）修復過程中容易發生錯誤，使DNA斷裂位置產生小片段缺失或插入；而同源重組（homologous recombination， HR）可實現基因的定點修復或插入（Hsu et al.， 2014）。本研究中，雙基因靶點編輯支持上述穩定轉化突變結論，并且可能以NHEJ修復為主。定量分析表明，純合突變體靶基因表達水平下降且SlMLO1較SlMLO6效果更加明顯，但雜合株需分離純化。M1 SlMLO1、M3和M10 SlMLO6未發生突變，可能與脫靶效應有關。

MLO借助乳突作用負調控植物抗性及葉肉細胞死亡，通過協助病原菌侵染抑制防御反應（Kim et al.， 2002a）。同時，MLO可通過結合鈣調素（calmodulin， CaM）提高自身功能活性以降低植物抗病力（Kim et al.， 2002b）。本課題組前期研究表明SlMLO1含有CaMBD，推測其通過結合CaM促進番茄感病。辣椒CaMLO6通過與CaWRKY40互作負調控青枯病抗性（Yang et al.， 2020）。鑒于番茄和辣椒的親緣關系，推測SlMLO6具有相似功能。抗性表型初步鑒定說明SlMLO1/6可能是青枯病易感基因。但是，青枯病抗性遺傳復雜，受多基因控制。由于脫靶效應的存在，因此非目的基因（編碼區和非編碼區）打靶如何影響編輯效果和植株表型需進一步通過全基因組或脫靶位點測序進行評估。同時，MLO家族基因是否存在功能冗余和多等位基因效應，也需進一步驗證。總之，需從表型、理化和分子水平對不同品種番茄Slmlo1/6突變體及其后代進行綜合鑒定，以獲得純合穩定有生產應用價值的育種材料。

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（責任編輯 李 莉 王登惠）

基金項目： "浙江省農業新品種選育重大科技專項子課題（2021C02065）； 浙江省基礎公益研究計劃（LTGN23C020002）； 溫州市農業新品種選育協作組項目（ZX2024002-2）。

第一作者： 史建磊（1982—），博士，副教授，主要從事作物遺傳育種與生物技術研究，（E-mail） sjlhebau@163.com。

*通信作者： "宰文珊，碩士，研究員，研究方向為蔬菜遺傳育種，（E-mail） 273493129@qq.com。