玉米巖藻糖基轉移酶基因SPINDLY的克隆及表達分析

摘 要：" SPINDLY（SPY）是植物中特有的巖藻糖基轉移酶，其介導的O-巖藻糖基化修飾作用在維持細胞內穩態和調控植物生長發育等過程中發揮了重要作用。為探究玉米（Zea mays）巖藻糖基轉移酶基因（ZmSPY）的功能，該研究采用生物信息學方法對ZmSPY蛋白的保守結構域、氨基酸序列以及理化性質等進行分析，并從玉米根系組織中克隆該基因，構建GFP融合蛋白表達載體，分析其蛋白質亞細胞定位，同時通過外源激素處理分析ZmSPY對不同激素［赤霉素（GA）、吲哚乙酸（IAA）、6-氨芐基嘌呤（6BA）、脫落酸（ABA）］的應答。結果表明：（1） ZmSPY蛋白歸屬于TPR和SPY超家族，主要由TPR結構域以及催化結構域構成。（2） SPYs高度保守，ZmSPY與高粱（Sorghum bicolor） SbSPY的序列同源性最高。（3） ZmSPY 編碼序列（coding sequence，CDS）區為2 736 bp，編碼911個氨基酸，所編碼蛋白為親水蛋白，無跨膜結構域，二級、三級結構以α-螺旋和無規卷曲為主，并含有33個糖基化位點。（4） 亞細胞定位研究顯示，ZmSPY主要定位于細胞核。（5） ZmSPY表達水平受GA、IAA、6BA、ABA等外源激素信號調控，并呈現出不同程度的響應。該研究結果為玉米SPY的功能探究提供了數據支撐，也為植物中O-巖藻糖基化修飾的相關研究提供了理論參考。

關鍵詞： 玉米， ZmSPY， 基因克隆， 亞細胞定位， 激素應答

中圖分類號：" Q943"文獻標識碼：" A

文章編號：" 1000-3142（2024）12-2255-10

Cloning and expression analysis of maize fucosyltransferase gene SPINDLY

LI Bowen， WANG Zhiqin， ZHU Xiaona， ZHU Zhenyu， GAO Xiaoxiao*

（ College of Biotechnology， Dalian Polytechnic University， Dalian 116034， Liaoning， China ）

Abstract：" SPINDLY （SPY） is a novel nucleocytoplasmic protein O-fucosyltransferase that regulates target protein activity or stability via O-fucosylation. Previous studies have indicated that the SPY protein regulates plant growth and development by modulating various intracellular processes in Arabidopsis thaliana. Its mediated O-fucosylation plays an important role in maintaining cell homeostasis and regulating plant growth and development， however protein O-fucosylation regulated by SPY in other plants largely remain unknown. Maize （Zea mays ） is one of the most important cereals crops for supplying foods， fibers， and fuels to humans. In order to explore the function of maize fucosyltransferase gene （ZmSPY）， this study first analyzed the conserved domain， amino acid sequence and physicochemical properties of ZmSPY protein by bioinformatics method， and cloned the gene from maize root tissue to construct the GFP fusion protein expression vector. The subcellular localization of ZmSPY was analyzed， and its response to different hormone treatments （GA， IAA， 6BA， ABA） was determined by exogenous hormone application. The results were as follows： （1） ZmSPY proteins belonged to the TPR and SPY superfamilies， and structural analysis demonstrated that ZmSPY had TPR （Tetratricopeptide repeat） and catalytic domains. （2） Phylogenetic analysis showed that SPYs were highly conserved， and ZmSPY exhibited strong homology to SPY in Sorghum bicolor. （3） Sequence analysis showed that the CDS region of ZmSPY was 2 736 bp. Physicochemical analysis indicated that ZmSPY， which contained 911 amino acids and 33 glycosylation sites， was hydrophilic and non-secretory. Its secondary and tertiary structures were largely composed of alpha helix and random coil. （4） The subcellular localization of ZmSPY was predominantly observed in the nucleus. （5） The expression of ZmSPY was induced by phytohormones including GA， IAA， 6BA and ABA， and exhibited various expression patterns. This study provides foundational information on SPY in maize， which contributes to further investigation of SPY and its effect on O-fucosylation in cereal plants.

Key words： maize， ZmSPY， gene cloning， subcellular localization， hormone response

蛋白質糖基化修飾在動植物糖信號轉導過程中扮演著關鍵角色，對于維持細胞內環境平衡以及生長發育調控至關重要。蛋白質氧連糖基化（O-glycosylation）是糖信號轉導的關鍵機制，其中O-巖藻糖基化修飾是蛋白質轉錄翻譯后糖基化修飾的主要部分之一，該環節主要表現在將巖藻糖殘基結合到N-聚糖、O-聚糖以及糖脂分子上（Park et al.， 2020）。在動物體內，O-巖藻糖基化修飾普遍存在且具有特異性，已經被證實與動物胚胎發育、細胞遷移、腫瘤生長、病灶轉移等重要生理活動密切相關（Ajima et al.， 2017; Chabanais et al.， 2018; Leng et al.， 2018）。植物中有關蛋白質糖基化的工作開展相對較晚，目前僅在模式植物中報道較多。Aizezi等（2023）研究顯示，擬南芥中有兩種O-糖基化修飾，是由SPINDLY（SPY）及其同源蛋白SECRET AGENT（SEC）分別介導的細胞內蛋白的巖藻糖（O-fucose）和乙酰葡糖胺（O-GlcNAc）糖基化修飾。SPY已被證實是一種作用于核質蛋白的新型O-巖藻糖基轉移酶（protein O-fucosyltransferase），在植物的生長發育中起到關鍵作用。SPY為糖基轉移酶GT41家族成員（Cui et al.， 2014），盡管與人源N-乙酰氨基葡萄糖轉移酶OGT高度同源，但與人源OGT功能存在差異。除植物以外，SPY同源蛋白還存在于原核生物、原生生物和藻類中，表明SPY所催化的蛋白發生O-巖藻糖基化修飾對于上述物種調控胞內蛋白功能可能具有重要作用（Zhu et al.， 2022）。已有的研究顯示，SPY能夠通過參與植物響應赤霉素、細胞分裂素等內源激素信號及轉導過程來調節植物生長、發育和生殖等生理過程（Bi et al.， 2023），在植物的種子萌發（Liang et al.， 2018）、莖的生長（An et al.， 2012）、開花誘導（Tseng et al.， 2004）等過程中發揮著重要作用。SPY還參與調控植物光信號（Zentella et al.， 2017）、生物鐘與節律（Wang et al.， 2020; Xu et al.， 2022）、應答生物與非生物脅迫（Qin et al.， 2011）等過程。此外，SPY突變體的多效性表型表明SPY可能在調節多種細胞途徑的關鍵蛋白中發揮作用（Steiner et al.， 2012）。

玉米（Zea mays）是禾本科玉蜀黍屬1年生草本植物，是世界上分布最廣泛的糧食作物之一，其不僅是我國畜牧業、養殖業和水產養殖業等行業的重要飼料來源，而且還是食品、醫療衛生和輕工業以及化工業等行業的重要原料（高文成等，2016；許青青等，2023）。目前，有關作物中蛋白糖基化的研究還鮮有報道。Xu等（2019）對小麥的研究顯示，O-GlcNAc信號能夠通過調控冬小麥VRNs加速春化作用，進而促進開花，揭示了O-GlcNAc對于作物開花，乃至結實的重要作用。當前，尚未見有關作物蛋白O-巖藻糖基化修飾的報道。因此，本研究以玉米為研究對象，擬探討：（1）ZmSPY進化關系、蛋白質結構特征與理化性質；（2）ZmSPY蛋白亞細胞定位特征；（3）ZmSPY對外源激素信號的應答及其在激素調控網絡中的潛在功能。本研究結果將為禾本科植物中巖藻糖基轉移酶基因ZmSPY的功能挖掘提供理論基礎，也為植物蛋白的O-巖藻糖基化修飾相關研究提供數據支撐。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

B73玉米與本生煙草（Nicotiana tabacum）培養于大連工業大學生物工程學院溫室；大腸桿菌（Escherichia coli） XL-10 Gold以及根瘤農桿菌（Agrobacterium tumefaciens） GV3101由本實驗室保藏；定位載體pBIGD-GFP為本實驗室構建保藏；植物RNA提取試劑TRIzol、DNA Marker購自天根生化科技（北京）有限公司；2×TransStart Top Green qPCR SuperMix購自北京全式金生物技術有限公司；PrimeSTAR HS DNA Polymerase、M-MLV反轉錄酶、Ex Taq DNA Polymerase、限制性核酸內切酶、T4 DNA連接酶、瓊脂糖凝膠、DNA回收試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司；GA、ABA、IAA、6BA購自北京索萊寶科技有限公司；所需引物均由北京六合華大基因科技有限公司合成（表1）。

1.2 方法

1.2.1 ZmSPY生物信息學分析 使用DTU Health Tech網站中的TMHMM、SignalP、YinOYang-1.2功能來預測蛋白質結構和功能、跨膜結構域、信號肽、糖基化位點等；使用SOPMA網站預測蛋白質的二級結構；使用Phyre2在線網站預測蛋白質的三級結構；使用Expasy-ProScale網站對蛋白質進行親疏水性預測分析；使用DNAMAN 8.0軟件對蛋白質序列進行多序列比對；使用MEGA 11.0軟件的ClustalW算法進行序列比對，并以Maximum-Likelyhood法構建多種植物間的系統進化樹；使用Wolf Psort網站進行亞細胞定位的預測。

1.2.2 ZmSPY基因的克隆和亞細胞定位載體的構建 從NCBI數據庫中獲得玉米ZmSPY的核苷酸FASTA序列，使用Primer Premier 5.0軟件設計目的基因克隆所需引物（表1），送至北京六合華大基因科技有限公司合成。利用TRIzol法提取玉米B73根系的總RNA，選取完整性較好和純度較高的RNA，通過Reverse Transcriptase M-MLV反轉錄酶將其反轉錄為cDNA。以此為模板使用高保真酶PrimeSTAR HS DNA Polymerase和特異性引物擴增ZmSPY基因編碼區全長片段，通過1%的瓊脂糖凝膠檢測PCR產物。

將目的片段膠塊切下，并回收純化，使用BamHⅠ和KpnⅠ兩種內切酶同時酶切純化后的PCR產物與亞細胞定位所需的pBIGD-GFP載體，通過T4 DNA連接酶將ZmSPY片段與pBIGD-GFP載體按照3∶1的比例于16 ℃下過夜連接，連接完成后通過熱激法轉入大腸桿菌感受態細胞，并將菌體涂布至LB-Kan抗性的平板上，挑取生長狀態較好的單菌落于LB-Kan液體培養基中培養約4 h，待菌液渾濁后，以此為模板進行菌落PCR鑒定，選擇陽性菌液擴大培養，提取重組質粒pBIGD-ZmSPY-GFP，并進行酶切鑒定，最后送至北京六合華大基因科技有限公司進行全長測序。

1.2.3 農桿菌轉化和煙草侵染 參照CaCl2法制備根瘤農桿菌GV3101感受態細胞，將pBIGD-GFP（對照質粒）與pBIGD-ZmSPY-GFP質粒分別轉入感受態細胞，經驗證正確后保藏菌種備用。另取200 μL菌液接種于50 mL含Kan（50 mg·mL-1）、Gen（40 mg·mL-1）和Rif（20 mg·mL-1）LB液體培養基中，并加入10 mmol·L-1 MES和20 mmol·L-1乙酰丁香酮，在28 ℃和180 r·min-1條件下擴大培養至OD600在0.6左右，將菌體重懸于侵染緩沖液（5 g·L-1葡萄糖、50 mmol·L-1 MES、2 mmol·L-1 Na3PO4·12H2O，100 μmol·L-1 ACE）中，調菌液OD600在1.2左右，28 ℃孵育3 h，用注射器將侵染液注射至本生煙草葉片中，避光培養2～3 d，通過激光共聚焦顯微鏡觀察煙草表皮細胞，判斷ZmSPY蛋白的定位情況。

1.2.4 實時熒光定量PCR表達分析 通過RT-qPCR檢測ZmSPY表達量的變化，從而探究其對不同激素處理的響應。分別于培養液中施加100 μmol·L-1的赤霉素（GA）、吲哚乙酸（IAA）、6-氨芐基嘌呤（6BA）、脫落酸（ABA），處理玉米B37根系3、6、12 h。提取總RNA，進行反轉錄，并稀釋cDNA濃度至100 ng·uL-1左右，以此為模板，以ZmUBQ為內參基因，使用實時熒光定量PCR檢測ZmSPY基因的表達量。反應體系（20 μL）：TransStart Top Green qPCR Super Mix 10 μL，Primer F 0.4 μL，Primer R 0.4 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 7.2 μL。按照反應體系于冰上加樣至96孔板，每個基因檢測3組平行。實時熒光定量PCR設定程序如下：95 ℃ 5 min；變性95 ℃ 20 s，退火50 ℃" 15 s，延伸72 ℃ 15 s，以上循環45次；72 ℃繼續延伸10 min。待程序運行完成后，將目標基因和內參基因擴增所得的Ct值，代入公式2-△△Ct，計算得出基因的相對表達量，并進行分析。

1.2.5 數據分析 所有指標的檢測至少重復進行3次，實驗結果以平均值±標準差（x±s）表示，并作圖。

2 結果與分析

2.1 ZmSPY保守結構域與氨基酸序列比對分析

通過NCBI網站的Conserved Domain Search Service （CD Search）模塊對ZmSPY蛋白進行結構域分析，由圖1： A可知，ZmSPY歸屬于TPR和SPY超家族，主要由TPR（tetratricopeptide repeats）結構域以及C端的催化結構域（catalytic domain）構成。之后，利用NCBI數據庫檢索獲得擬南芥（Arabidopsis thaliana， At）、高粱（Sorghum bicolor， Sb）、水稻（Oryza sativa， Os）、小麥（Triticum aestivum， Ta）等植物的SPY蛋白質序列，并進行多序列比對分析。由圖1： B可知，不同物種中SPY蛋白高度保守，不同物種間的序列差異主要集中于蛋白結構的C末端附近。

2.2 ZmSPY蛋白質進化樹分析

為了探究SPY在不同物種之間的親緣關系及玉米ZmSPY的潛在生物學功能，使用MEGA11.0軟件構建關于SPY蛋白的系統進化樹。由圖2可知，8個物種被分為兩大類，玉米、高粱、柳枝稷（Panicum virgatum）、小麥、水稻、擬南芥為一組；狗尾草（Setaria viridis）、小米（Setaria italica var. germanica）為一組。其中，玉米與同為禾本科植物的高粱屬同一支，說明氨基酸序列一致性最高，親緣關系最近；其次玉米與禾本科植物柳枝稷進化關系密切。

2.3 ZmSPY蛋白質生物信息學分析

Expasy-ProtParam分析結果顯示，ZmSPY共由911個氨基酸組成，分子式為C4476H7040N1204O1351S54，相對分子質量約為101.07 kD，理論等電點為5.62，正負電荷殘基總數分別為111和92，不穩定系數為39.45（lt;40），脂溶性指數為87.85，總平均親水性為-0.20。分析蛋白質的二級、三級結構，可為蛋白功能研究提供基礎支撐（耿柳婷等，2023）。ZmSPY蛋白質的二級結構預測結果（圖3： A）顯示，ZmSPY蛋白由58.62%的α-螺旋、7.24%的延伸鏈、5.93%的β-轉角和28.21%的無規卷曲共同組成。ZmSPY蛋白質的三級結構預測結果（圖3： B）顯示，α-螺旋是ZmSPY蛋白的主要構成元件。

Expasy-ProScale預測結果（圖4： A）顯示，ZmSPY蛋白屬于親水性蛋白，在氨基酸序列第334個位點處，親水性最高；在氨基酸序列第145個位點處，疏水性最高。TMHMM 2.0 Server預測結果顯示，ZmSPY蛋白不存在跨膜結構域。YinOYang 1.2 Server預測結果（圖4： B）顯示，ZmSPY蛋白共有33個糖基化位點。Wolf Psort預測ZmSPY蛋白的亞細胞定位結果顯示，該蛋白可能定位于細胞核、細胞質中，并且定位于細胞核的可能性更大。

2.4 ZmSPY基因的克隆和亞細胞定位研究

蛋白質的功能、代謝以及相互作用都與其亞細胞定位密切相關，成熟的蛋白質只有運輸至特定的亞細胞結構或區域才能發揮正確的生物學功能（Wang amp; Balint-Kurti， 2015）。Wolf Psort預測結果顯示，ZmSPY蛋白定位于細胞核的可能性更大。為了驗證此結果，通過GFP融合蛋白表達法來確定ZmSPY蛋白的亞細胞定位。通過克隆獲得ZmSPY基因編碼區全長片段（圖5： A），大小為2 736 bp。連接、轉化，挑取單菌落驗證及提質粒酶切驗證，結果顯示PCR擴增片段、酶切片段的長度與目的片段大小一致（圖5： B、C），表明成功構建了由農桿菌（GV3103）介導的pBIGD-ZmSPY-GFP表達載體。通過農桿菌轉化使其在煙草表皮細胞中瞬時表達，結果（圖6）顯示對照組（pBIGD-GFP）胞內呈現分散非特異性的熒光信號，實驗組（pBIGD-ZmSPY-GFP）僅在細胞核上觀察到特異性的熒光信號，與細胞核經DAPI染色后呈現的藍色熒光信號重疊，表明ZmSPY蛋白定位于細胞核中。

2.5 外源激素處理對ZmSPY基因表達量的影響

為探究ZmSPY可能參與的生物學過程，我們采用不同外源激素處理玉米根系，通過RT-qPCR檢測ZmSPY表達量的變化，結果（圖7）顯示在受到不同外源激素（GA、IAA、6BA、ABA）處理后，ZmSPY表達水平隨處理時間的變化表現出不同的變化趨勢。在GA實驗組的處理下，ZmSPY表達量始終表現為下調趨勢，并且下調趨勢隨處理時間增長逐漸減弱。IAA、6BA實驗組變化趨勢一致，ZmSPY表達量整體呈現出隨處理時間的增長先下調后上調的趨勢。短時間（3 h）內ZmSPY基因表達水平均呈現下調趨勢，其中受IAA處理的玉米根系中ZmSPY表達量下調幅度最為明顯，當外源激素處理時間到達6 h及以上時，ZmSPY表達量轉為上調且上調趨勢逐漸升高。ABA實驗組與IAA、6BA實驗組變化趨勢類似，不同之處在于當外源激素處理時間到達12 h時，ZmSPY表達量才轉為上調且上調趨勢不顯著。以上結果表明，ZmSPY能夠響應GA、IAA、6BA、ABA多種外源激素信號，并且表現出不同的應答模式。

3 討論

蛋白質O-糖基化修飾是實現蛋白質功能多樣化、動態調節胞內信號與細胞生理狀態的關鍵過程（Zhang et al.， 2019）。SPY同源蛋白廣泛存在于許多物種，包括原核生物、原生生物、藻類和所有植物，本研究針對玉米SPY的結構和序列分析發現，ZmSPY蛋白C端的催化結構域包含N端（N-Cat）和C端（C-Cat），二者均具有GT41亞家族成員典型的Rossmann式折疊，此種結構能夠增強酶與蛋白質底物結合的親和力（Kawai et al.， 2011）。C端催化結構域是SPY行使O-巖藻糖基化修飾功能的關鍵區域，該處差異可能使其結合蛋白質多樣化，并動態調節其信號整合和生理狀態。針對擬南芥SPY蛋白質晶體結構解析的研究顯示，SPY的N-末端無序肽含有反式自體巖藻糖基化位點（trans auto-fucosylation sites），能夠抑制其自身活性（Kumar et al.， 2023）。基于SPY序列與進化的高度保守性，推測ZmSPY的N-末端無序肽也可能行使相似的生物學活性。此外，ZmSPY蛋白的TPR結構域包含12個TPR重復序列，能夠在空間上形成一個狹長的超螺旋結構。TPRs超螺旋內壁上的一系列天冬氨酸負責結合底物蛋白，位于TPRs超螺旋中部的賴氨酸和絲氨酸參與，并決定SPY對蛋白質底物的選擇性（Zhu et al.， 2022）。Kumar等（2023）對擬南芥SPY的研究顯示，其TPRs 1-5能夠通過干擾蛋白質底物結合動態調節SPY的活性。同理，對于ZmSPY的TPRs結構域的深入研究也將進一步揭示玉米O-巖藻糖基化修飾的底物選擇特征。

盡管SPY與人源OGT擁有高度同源的序列結構特征，但SPY被證實在植物中發揮新型核質蛋白O-巖藻糖基轉移酶的功能，與OGT功能相異（Zhu et al.， 2022）。Vasudevan和Haltiwanger（2014）的研究顯示，大多數催化蛋白質絲氨酸/蘇氨酸殘基發生O-巖藻糖基化修飾，主要由定位于內質網的蛋白O-巖藻糖基轉移酶介導。在擬南芥中的研究結果顯示，SPY于核質均可表達，并且主要存在于細胞核內（Zentella et al.， 2023）。本文在玉米中的研究結果顯示，ZmSPY也主要定位于細胞核。類SPY（SPY-like）蛋白在組織器官水平豐富的表達，說明O-巖藻糖基化修飾應是調節植物細胞內蛋白質功能廣泛的蛋白質翻譯后修飾方式。現有的研究結果顯示，植物O-巖藻糖基化修飾的蛋白主要包括轉錄因子、核蛋白、激酶，以及涉及信號轉導、新陳代謝等生理過程的關鍵蛋白（Mutanwad amp; Lucyshyn， 2022），這些蛋白大部分為核內蛋白，暗示SPY介導O-巖藻糖基化修飾的區室化傾向。胞內生理生化過程的區室化現象在植物體中廣泛存在，其可能對于提高產物穩定性（Zhang amp; Fernie， 2021）、降低酶抑制效應（Alam et al.， 2017），并防止不必要的催化串擾（Knudsen et al.， 2018）具有重要意義。因此，我們推測SPY的核內定位可能有助于其識別且糖基化底物，從而穩定有效地調控植物體O-巖藻糖基化修飾水平穩定。

Jia和Yin（2017）的研究表明SPY在植物激素信號轉導過程中發揮了重要作用。在擬南芥中，過表達SPY能夠抑制種子的萌發，以及莖的伸長，并造成開花延遲和雄性不育等，呈現出GA生物合成缺陷表型（Bi et al.， 2021）。在轉基因矮牽牛花中，外源施加GA能夠解除SPY異源表達對GA反應的抑制（Izhaki et al.， 2010），進一步說明SPY與GA激素信號之間的密切關聯。Sun等（2021）的研究結果顯示，GA信號轉導核心抑制因子DELLA受到SPY介導的O-巖藻糖基化修飾后形成活性更高的開放構象，進而促進DELLA與生長相關轉錄因子的結合，抑制植物生長發育。本研究實時熒光定量PCR的結果顯示，外源施加GA處理能夠降低ZmSPY的表達。此外，受到IAA、6BA和ABA處理后，玉米植株ZmSPY表達水平均隨時間延長呈現先下調后上調的表達趨勢，暗示ZmSPY與這些植物激素可能存在復雜的交互關系，并且可能通過介導植物激素信號網絡的動態過程參與玉米的生長發育與脅迫應答，其內在機制仍需更為深入詳細的研究。

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（責任編輯 蔣巧媛 王登惠）

基金項目：" 國家自然科學基金（32102493）。

第一作者： 李博文（1998—），碩士研究生，研究方向為植物生長調節因子的機制和應用，（E-mail）1161432391@qq.com。

*通信作者：" 高瀟瀟，博士，講師，研究方向為植物次生代謝途徑調控，（E-mail）xxgao@dlpu.edu.cn。