油茶兩個響應干旱NAC轉錄因子的克隆、亞細胞定位及自激活檢測

摘 要：" 干旱脅迫是影響油茶生長發育、產量和品質的一類主要的非生物脅迫。NAC轉錄因子在植物響應干旱、鹽堿等非生物脅迫反應中具有重要的調控作用。為探究NAC轉錄因子在油茶響應干旱脅迫中的調控機制，該文以兩年生油茶苗為材料，通過TA克隆得到CoNAC5與CoNAC79的CDS序列，對其進行生物信息學分析、亞細胞定位及自激活分析，并采用qRT-PCR檢測CoNAC5與CoNAC79基因表達的組織特異性及PEG模擬干旱和ABA處理下的表達模式。結果表明：（1）基因結構分析顯示，CoNAC5與CoNAC79的CDS長分別為1 044 bp和990 bp，分別編碼348個和330個氨基酸，理論等電點分別為8.86和8.57，蛋白的不穩定系數分別為41.35和37.47，均無跨膜結構域，分別與柿子和荔枝的同源性最高。亞細胞定位顯示CoNAC5與CoNAC79的均定位在細胞核上。（2）酵母自激活檢測顯示，CoNAC5與CoNAC79的全長蛋白和N端結構域無自激活活性，但C端結構域均具有自激活活性。（3）CoNAC5與CoNAC79表達具有明顯的組織特異性，主要在根和種仁中高表達；PEG模擬干旱和外源施加ABA處理油茶苗發現，CoNAC5和CoNAC79表達量均顯著高于對照；CoNAC79的表達量在ABA處理48 h后下降，在PEG處理下顯著高于對照。綜上認為，CoNAC5與CoNAC79其N端可能存在抑制區域，從而阻礙了全長序列的轉錄；油茶兩個NAC基因可能通過ABA合成途徑間接參與干旱脅迫響應過程；在脅迫持續發生時，CoNAC79還可能通過其他途徑直接參與干旱脅迫響應過程。該研究結果為進一步探究NAC轉錄因子在油茶響應干旱脅迫過程中的作用提供了科學依據。

關鍵詞： 克隆，干旱脅迫，亞細胞定位，酵母自激活，ABA途徑

中圖分類號：" Q943"文獻標識碼：" A

文章編號：" 1000-3142（2024）12-2242-13

Cloning， subcellular localization， and self-activation detection of two NAC transcription factors in response"to drought for Camellia oleifera

ZHAO Nahong1， CAO Ruilan1， SU Wenjuan1， XIE Huiqing1， ZENG Jin2， LIU Juan1*

（ 1. College of Forestry， Jiangxi Agricultural University， Nanchang 330045， China; 2. School of Nuclear Technologyand Chemical Biology， Hubei University of Science and Technology， Xianning 437100， Hubei， China）

Abstract：" Drought stress is a major abiotic stress for the development， yield and quality of Camellia oleifera. NAC transcription factors play an important role in plant response to abiotic stresses such as drought and salinity. To explore the role of NAC transcription factors in the drought stress response of C. oleifera， two-year oil tea seedlings were used as materials. The CDS sequences of CoNAC5 and CoNAC79 were obtained from through TA cloning. Bioinformatics， subcellular localization and self-activation were performed. qRT-PCR was used to determine the tissue specificity of CoNAC5 and CoNAC79 gene expression and the expression PEG and ABA at different treatment time. The results were as follows： （1） Gene structure analysis showed that length of CoNAC5 and CoNAC79 were 1 044 bp and 990 bp， respectively， encoding 348 and 330 amino acids. Their theoretical isoelectric points were 8.86 and 8.57， respectively. The instability coefficients of the proteins were 41.35 and 37.47， respectively. No transmembrane domain was found between the two genes， the highest homology with persimmon and lychee， respectively. Subcellular localization showed that both CoNAC5 and CoNAC79 were located in the nucleus. （2） Yeast self-activation detection analysis revealed that CoNAC5 and CoNAC79 did not have self-activation activity in the full-length proteins and N-terminal domain. However， the C-terminal domain exhibited self-activation activity. （3） The expression of CoNAC5 and CoNAC79 had significant tissue specificity and mainly expressed in roots and kernels; when PEG simulated drought and exogenous ABA treated C. oleifera seedlings， the expression levels of CoNAC5 and CoNAC79 were significantly higher than the control; the expression level of CoNAC79 decreased after 48 h under ABA treatment， and significantly higher than the control under PEG treatment. In summary， it is believed that there may be an inhibitory region at the N-terminal of CoNAC5 and CoNAC79， which hinders the transcription of the full-length sequence; indicating that the two NAC genes in C. oleifera may be probably indirectly involved in drought stress response through pathway of ABA synthesis; CoNAC79 can also directly participate in the drought stress response through other" pathways. This study provided a scientific reference for further exploring the role of NAC transcription factors in the response of C. oleifera to drought stress.

Key words： cloning， drought stress， subcellular localization， yeast self-activation， ABA pathway

油茶（Camellia oleifera），隸屬于山茶科（Theaceae）山茶屬（Camellia L.），是我國特有的木本食用油料樹種。茶油單不飽和脂肪酸高達80%，具有很高的保健價值。油茶在我國已有2 000多年的栽培歷史，主要種植在我國長江流域及其以南的山地、丘陵地區（丁少凈等，2017）。干旱脅迫是影響植物生長發育的一類主要非生物脅迫。我國南方地區雖然降水量充沛，但是降水量在不同季節分配極度不均勻，5—6月多雨，8—10月常出現季節性高溫干旱天氣（何方，2011）。民間俗語“7月干球，8月干油”，指在每年陰歷7到9月是油茶果實膨大和種子油脂積累的關鍵時期，而此時油茶主產區常出現持續干旱高溫，導致油茶產量及出油率大幅降低（吳少強等，2022）。當受到干旱脅迫時，植物會產生應答機制來減弱或消除水分缺失造成的傷害，這一過程涉及多個基因、多種信號途徑及代謝產物，其轉錄調控起承上啟下的作用（張幸媛等，2021）。

NAC轉錄因子是植物特異性轉錄因子，其啟動子區富含低溫、缺水、損傷等逆境響應元件（Han et al.， 2015）。大量研究已證實，NAC轉錄因子參與植物對干旱、冷害、低氧等非生物脅迫響應（Bu et al.， 2008）。例如，OsNAC2/OsNAC6基因的過表達植株顯著增強了水稻對干旱、鹽分以及稻瘟病的耐受力，其中干旱脅迫下過表達OsNAC9植株的籽粒產量可提高30%（Liu et al.， 2016）；Hu等（2018）發現水稻OsNAC1能顯著提高花期的抗旱性，過表達植株結實率提高22%～34%且育性提高17%～24%；Takasaki等（2010）通過對水稻干旱脅迫誘導，發現OsNAC5在過表達水稻中上調表達，并通過上調脅迫誘導基因OsLEA3增強過表達植株的抗旱性。眾多研究表明，脫落酸ABA作為一種植物脅迫激素，是植物應對干旱脅迫響應并及時優化水分利用效率的重要調控因子（Huang et al.， 2016），而NAC轉錄因子被認為是ABA信號途徑中的重要轉錄激活調控因子（Wang et al.， 2016）。例如，Chen等（2014）發現過表達水稻OsNAC可通過ABA介導的氣孔關閉以降低葉片失水率，顯著提高水稻抗旱性；Shang等（2020）發現GhirNAC2通過調控GhNCED3a/3c的表達，控制ABA的生物合成和氣孔關閉，從而在棉花抗旱性中發揮積極作用。

課題組前期基于二倍體油茶基因組數據，利用生物信息學手段分析鑒定了油茶NAC基因家族成員并對部分成員開展干旱脅迫下表達模式分析（曹瑞蘭等，2021）。進一步對轉錄組數據分析發現ATNAC3亞組的CoNAC5、CoNAC79在干旱脅迫下表達量均上調，而系統發育分析發現同組的擬南芥AtNAC019、AtNAC055、AtNAC072基因，被證實參與逆境脅迫過程（Tran et al.， 2004; Jiang et al.， 2009），因此推測CoNAC5、CoNAC79可能參與油茶干旱脅迫調控過程，但是其轉錄活性和調控機制尚不清楚。本研究采用TA克隆獲得CoNAC5和CoNAC79的CDS序列，通過生物信息學、亞細胞定位、酵母自激活和熒光定量PCR分析，擬探討以下問題：（1）兩個油茶NAC基因的結構、進化關系及其亞細胞定位；（2）自激活活性及其具體的激活區域；（3）兩個油茶NAC基因在不同組織和干旱脅迫下表達模式差異及其可能參與干旱響應的信號途徑。本研究旨在為深入探究油茶響應干旱脅迫分子調控網絡提供參考，為油茶抗逆分子育種計劃提供候選基因。

1 材料與方法

1.1 試驗材料、生長條件以及脅迫處理

選取長勢一致的兩年生“長林18”油茶嫁接苗為試驗材料，在江西農業大學林學院校內實踐基地（28°46′ N、115°55′ E）溫室大棚開展盆栽試驗。采用水培法，將油茶根部浸潤在30%聚乙二醇（PEG6000）溶液中模擬干旱；ABA處理則采用葉面噴施法，在油茶葉面噴灑濃度為200 ng·mL-1的ABA溶液。于12、24、36、48 h采集各處理和對照的嫩葉，每個處理設置3次重復。采集根、莖、葉、花、幼果、種仁各部位材料，置于液氮中速凍，-80 ℃保存備用。

1.2 CoNAC5和CoNAC79基因的克隆

基于油茶全基因組數據（https：//github.com/Hengfu-Yin/CON_genome_data），獲得CoNAC5、CoNAC79基因序列，利用SnapGene軟件進行基因特異性引物設計（表1）。總RNA采用TastPureUniversal Plant Total RNA Isolation Kit Vazyme Cat（RC411-01，諾唯贊）試劑盒提取，方法按照說明書。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質量，Eppendorf μCuvette G1.0核酸蛋白測定儀檢測RNA濃度。使用HiScriPT lll All-in-one RT-SuperMix Perfect for qPCR（R333，諾唯贊）試劑盒反轉錄合成cDNA，按說明書描述的方法操作。以獲得的cDNA為模板，KL-CoNAC5-F/R與KL-CoNAC79-F/R為引物（表1），利用Ex PremierTM DNA Polymerase Dye plus（TaKaRa，大連）高保真酶，進行PCR擴增。反應程序：95 ℃ 10 min，95 ℃ 30 s，59～62 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，30個循環；72 ℃ 5 min，4 ℃保溫。將PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，目的條帶回收純化后將其連接至pMD19-T克隆載體，并轉大腸桿菌DH5α中，PCR檢測出陽性克隆，委托生工生物工程（上海）股份有限公司測序并比對測序結果，保菌并使用EasyPure Plasmid MiniPrep Kit（EM101-01，全式金）質粒小提試劑盒提取質粒。

1.3 CoNAC5和CoNAC79基因的生物信息學分析

利用Expasy-ProtParam對測序正確的CoNAC5與CoNAC79基因編碼氨基酸序列的理化性質進行在線分析，利用DNAMAN軟件將油茶CoNAC5與陸地棉（Gossypium hirsutum，XP_016732489.2）、君遷子（Diospyros lotus，XP_052206324.1）、柿子（Diospyros kaki，AZL_19402.1）、胡桃（Juglans regia，XP_018851445.1）等序列，CoNAC79與荔枝（Litchi chinensis，UKF_18671.1）、獼猴桃（Actinidia chinensis，QQG_64095.1）、柑橘（Citrus reticulata，AYC_35383.1）、馬鈴薯（Solanum tuberosum，ATD_50216.1）等序列進行比對，并利用TBtools軟件構建進化樹和保守基序。

1.4 EGFP-CoNAC5和EGFP-CoNAC79的載體構建及亞細胞定位

使用SnapGene軟件設計同源重組引物CZ-ECoNAC5-F/R和CZ-ECoNAC79-F/R（表1），以油茶cDNA為模板進行擴增，利用ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit（C115，諾唯贊）同源重組酶，構建EGFP-CoNAC5與EGFP-CoNAC79植物表達載體。提取含有增強綠色熒光蛋白EGFP的植物表達載體質粒，在37 ℃下kpn I酶切1 h，純化后使用同源重組酶，50 ℃下連接15 min，轉化至大腸桿菌DH5α，并涂布在含有卡納抗性和氨芐抗性的LB培養基上。挑選單菌落進行PCR驗證，將陽性克隆委托生工生物工程（上海）股份有限公司測序，比對測序結果并保菌。對含有EGFP-CoNAC5與EGFP-CoNAC79載體的大腸桿菌提取質粒，并轉化到GV3101農桿菌中，將農桿菌注射到健康生長的煙草葉片中，培養2 d，用激光共聚焦顯微鏡（FV3000，Olympus）觀察EGFP在煙草細胞中的分布情況。

1.5 pGBKT7-CoNAC5和pGBKT7-CoNAC79的載體構建[BT）]

使用CZ-BDCoNAC5-F/R和CZ-BDCoNAC79-F/R引物（表1），以油茶cDNA為模板，構建pGBKT7-CoNAC5與pGBKT7-CoNAC79載體。提取pGBKT7載體質粒，在37 ℃下使用EcoR I和BamH I雙酶切1 h，純化后使用同源重組酶在50 ℃下連接15 min，轉化大腸桿菌DH5α中，并涂布在含有卡納霉素的新鮮LB固體培養基上，對單菌落進行PCR檢驗并送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序，比對測序結果并保菌。

1.6 酵母的轉化及酵母自激活活性分析

使用質粒提取試劑盒，從測序正確的大腸桿菌中提取pGBKT7-CoNAC5和pGBKT7-CoNAC79質粒，并轉化到Y2HGoId酵母菌株中，涂布在SD/-Leu-Trp固體培養基上，并放置于28 ℃培養箱2～3 d，以pGADT7為陰性對照，以pGADT7-T和pGBKT-P53為陽性對照，PCR檢測陽性單菌落后保存pGBKT7-CoNAC5和pGBKT7-CoNAC79酵母菌株。

挑取成功轉化的pGBKT7-CoNAC5和pGBKT7-CoNAC79酵母單克隆菌株，稀釋重懸，將菌液濃度OD600調整到0.02、0.002和0.000 2，吸取5 μL濃度梯度點涂于SD/-Leu-Trp和SD/-Leu-Trp-His-Ade酵母培養基上，在28 ℃培養箱中培養2～3 d，觀察誘餌菌株的生長狀況。

1.7 CoNAC5和CoNAC79結構域的酵母自激活分析

CoNAC5和CoNAC79是典型的ATNAC3-NAC轉錄因子，在N端均含有一段保守結構域且在C端具有轉錄激活活性。本研究以位于CoNAC5和CoNAC79 N端1～417 bp構建pGBKT7-N載體，以417～1 044 bp、417～990 bp構建C端pGBKT7-C載體，并分別轉到Y2H酵母菌中進行篩選和檢測。挑取轉化成功的pGBKT7-CoNAC5-N和pGBKT7-CoNAC5-C以及pGBKT7-CoNAC79-N和pGBKT7-CoNAC79-C酵母單菌落，稀釋重懸，調整菌液濃度并點涂觀察。

1.8 qRT-PCR引物設計及其驗證

通過SnapGene軟件設計qPCR引物DL-CoNAC5-F/R與DL-CoNAC79-F/R，內參為EF-1α-F/R（表1）。采用25 μL反應體系：ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix（Q711-02，諾唯贊） 12.5 μL，cDNA模板2.5 μL，10 μmol·L-1上下游引物各1.5 μL，ddH2O 7 μL。熒光定量儀反應程序：95 ℃ 2 min，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，40個循環；95 ℃ 5 s；65 ℃ 5 s，95 ℃ 5 s。每個樣品進行3次生物學重復。反應完成后，用2-ΔΔCt對CoNAC5和CoNAC79基因的表達量進行計算。

1.9 數據處理

使用SPSS 22.0軟件的Duncan法進行顯著性分析，用Origin 2021軟件作圖。

2 結果與分析

2.1" CoNAC5和CoNAC79基因的克隆

提取油茶葉片總RNA，純化后獲得mRNA，反轉錄成cDNA。以cDNA為模板擴增CoNAC5和CoNAC79序列，得到約1 000 bp的擴增產物（圖1），切膠回收。將純化后的片段連接至pMD19-T載體上，挑取陽性克隆搖菌，將菌液送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。測序結果比對得出CoNAC5和CoNAC79序列長度為1 044 bp和990 bp，片段長度與PCR擴增反應結果（圖1）相符。

2.2 CoNAC5和CoNAC79基因的生物信息學分析

通過在線分析網站Expasy-ProtParam分析CoNAC5和CoNAC79蛋白的理化性質。CoNAC5編碼氨基酸數量348，相對分子量為39 114.92 Da，理論等電點為8.86，呈堿性；帶正負電殘基的數量分別為35和40，分子式為C1743H2673N483O525S10，蛋白的不穩定系數為41.35，為不穩定蛋白；脂溶性指數為65.29，平均親水系數為-0.617，為親水性蛋白。CoNAC79編碼氨基酸數量330，相對分子量37 198.71 Da，理論等電點為8.57，呈堿性；帶正負電殘基的數量分別為34和37，分子式為C1670H2535N453O499S8，蛋白的不穩定系數為37.47，為穩定性蛋白；脂溶性指數為62.72，平均親水系數為-0.605，為親水性蛋白。

2.2.1 CoNAC5和CoNAC79的系統發育進化樹、保守基序分析 將CoNAC5和CoNAC79氨基酸序列與多個同源氨基酸構建進化樹，發現其分別與柿子和荔枝聚在同一分支，同源性比較高。CoNAC5和CoNAC79都具有保守基序，通過SnapGene軟件構建進化樹和保守基序（圖2）。

2.2.2 CoNAC5和CoNAC79同源序列比對 通過MEGA 7.0軟件，選用鄰接法，對CoNAC5和CoNAC79的同源氨基酸序列進行多序列比對，運用BLASTp程序搜索油茶CoNAC5和CoNAC79氨基酸序列的同源序列，發現與CoNAC5相似度最高的分別為柿子（Diospyros kaki，AZL_19402.1），其次為君遷子（D. lotus，XP_052206324.1）和陸地棉（Gossypium hirsutum，XP_016732489.2），相似度分別達82.48%、79.53%和78.75%；與CoNAC79相似度最高的為荔枝（Litchi chinensis，UKF_18671.1 ），其次為獼猴桃（Actinidia chinensis，QQG_64095.1）和柑橘（Citrus reticulata，AYC_35383.1），相似度分別達84.22%、80.46%和80.29%（圖3）。

2.3 CoNAC5和CoNAC79基因的亞細胞定位

構建EGFP-CoNAC5和EGFP-CoNAC79表達載體，以35S-EGFP-CoNAC5和35S-EGFP-CoNAC79為核定位標記，并將其注射到煙草原生質體中。結果在煙草原生質質體的細胞核中檢測到綠色熒光，其在相同位置與核定位標記共表達，證明CoNAC5與CoNAC79蛋白均定位在細胞核中（圖4）。

2.4 CoNAC5和CoNAC79基因的自激活活性測定

NAC轉錄因子含有保守的N端DNA結合結構域和C端激活結構域。將CoNAC5和CoNAC79的CDS序列分別克隆到PGBKT-7載體中，并轉化到Y2H酵母菌中，陽性對照分別為pGADT7-T、pGBKT7-P53，AD與BD空載轉入酵母菌作為陰性對照，所有這些酵母菌在SD/-Leu-TrP培養基上生長良好，但只有陽性對照在SD/-Leu-Trp-His-Ade生長良好（圖5）。

2.5 CoNAC5和CoNAC79結構域自激活分析

含有pGBKT7-CoNAC5-N和pGBKT7-CoNAC5-C以及pGBKT7-CoNAC79-N和pGBKT7-CoNAC79-C載體質粒的酵母菌在SD/-Lue-Trp均能正常生長，但含有pGBKT7-CoNAC5-N和pGBKT7-CoNAC79-N載體質粒的酵母菌在SD/-Leu-Trp-His-Ade無法正常生長，說明CoNAC5與CoNAC79的N端不存在轉錄激活活性；含有pGBKT7-CoNAC5-C與pGBKT7-CoNAC79-C載體質粒的酵母菌在SD/-Leu-Trp-His-Ade可以正常生長，說明CoNAC5和CoNAC79的C端存在轉錄激活活性（圖6）。

2.6 CoNAC5和CoNAC79基因的表達模式分析

對不同組織表達特異性分析發現，CoNAC5和CoNAC79在油茶根、莖、葉、花、幼果和種仁6個組織中都有表達，其中均在根和種仁中表達較高，在花中表達最低（圖7）。CoNAC5在根中的表達量是花的111倍，是莖的90倍，是葉的28倍，是幼果的14倍，是種仁的1.2倍。CoNAC79在種仁中的表達量是花的580倍，是莖的480倍，是葉的81倍，是幼果的70倍，是根的5倍。

在PEG模擬干旱脅迫中，不同時間段下CoNAC5和CoNAC79的表達與對照相比，均存在顯著差異（圖8）。PEG處理36 h，CoNAC5的表達量是對照的76倍，48 h時依然呈現高表達，為對照的12倍。PEG處理36 h，CoNAC79的表達量是對照的180倍，48 h時為對照的6.8倍（圖8）。在ABA處理下，CoNAC5和CoNAC79的表達在24 h出現顯著上調，分別為對照的1.4倍和1.7倍。ABA處理36 h時，兩者的表達量均呈現高表達，分別為對照的11倍和12倍。48 h時，與對照相比，CoNAC5的表達量增長幅度下降，為對照的3.3倍，而CoNAC79的表達量出現下調趨勢，只有對照的85%，但兩者沒有顯著差異。

3 討論

NAC轉錄因子是植物中特有的轉錄因子，也是植物中數量最大的轉錄因子家族之一（Chen et al.， 2022）。NAC轉錄因子不僅參與調控植物生長發育過程，而且在響應逆境脅迫中扮演著重要角色（Sun et al.， 2020）。本研究克隆油茶NAC轉錄因子CoNAC5與CoNAC79，屬于ATNAC3亞組，分別與柿子和荔枝的同源性最高且N端均具有NAC轉錄因子特有的NAM結構域。亞細胞定位結果表明CoNAC5與CoNAC79蛋白均定位在細胞核上，屬于核蛋白，表明CoNAC5與CoNAC79作為轉錄因子可能調控細胞核中靶基因的轉錄過程，符合轉錄因子的特征。

研究發現NAC蛋白常通過與其他蛋白互作的形式來參與非生物脅迫（Hao et al.， 2011）。確定不同蛋白間相互作用常采用酵母雙雜技術，其中為降低酵母雙雜篩選時的假陽性概率，首先要確定誘餌蛋白本身是否具有轉錄激活功能。若誘餌蛋白具有轉錄活性，就能單獨激活下游啟動子調節的報告基因，從而造成假陽性。本研究發現CoNAC5與CoNAC79兩個蛋白沒有轉錄激活能力，進一步比較C端和N端結構域，發現這兩個蛋白的C端都含有轉錄激活區域，而N端沒有激活活性。這可能是由于CoNAC5與CoNAC79蛋白的N端存在轉錄激活的抑制區域，從而干擾了C端激活域及其全長蛋白的轉錄效應。Hao等（2010）研究大豆的3個NAC基因的轉錄激活能力，發現在N端存在NARD抑制結構域，封閉了其C端激活域的作用。眾多研究也進一步證實，轉錄因子NAC蛋白轉錄激活能力可能取決于N端的抑制區域與C端激活結構域的相互作用（Narberhaus et al.， 1995; Huang et al.， 2011）。此外，在G-box、MYB、HRT和ERF等轉錄因子中也發現了對全長序列自激活活性具有抑制作用的抑制結構域（Liu et al.， 1997; Raventos et al.， 1998; Jin et al.， 2000; Ohta et al.， 2001）。這些轉錄抑制區可能通過與啟動子結合而阻止其他轉錄因子與該啟動子結合，或與其他轉錄因子相互作用，從而抑制其他因子的作用。如Hao等（2010）的研究進一步證實大豆的NAC基因N端抑制結構域可以阻礙WRKY、Dof等其他轉錄因子的轉錄。因此，油茶CoNAC5與CoNAC79蛋白可能通過其N端抑制區域與其他轉錄因子相互作用或與順式作用元件結合，從而影響下游功能基因的轉錄和表達。此外，油茶CoNAC5與CoNAC79全長序列不存在轉錄自激活活性，未來可以利用酵母雙雜文庫構建和篩選可能的互作蛋白，深入探究油茶兩個NAC基因的功能。

植物受到逆境脅迫時，常通過調控細胞內激素含量，誘導一系列抗逆相關的基因表達來提高抗性（Mao et al.， 2016）。ABA作為觸發植物對逆境脅迫應答反應的傳遞體，在調節植物抗逆性方面發揮著重要作用（Aslam et al.， 2021）。研究發現NAC轉錄因子可能通過與ABA響應元件結合來參與干旱脅迫響應（Fujita et al.， 2004; Wang et al.， 2021）。Jensen等（2010）研究發現AtNAC019（AtNAC3亞組）是ABA應答的正調控因子，過表達AtNAC019顯著提高了轉基因植株對外源ABA敏感性。Yu等（2021）發現在過表達云杉PwNAC11（與AtNAC019近緣）的轉基因擬南芥對外源ABA具有高敏感性，進一步發現該基因能通過與ABA響應元件（ABREs）結合來激活下游ERD1基因表達，從而提高植株對干旱脅迫的耐受性。在本研究中，CoNAC5與CoNAC79基因在系統發育進化樹中屬于AtNAC3亞組，與AtNAC019為同源基因。PEG模擬干旱脅迫處理在36 h和外源施加ABA處理油茶24 h時，均顯著誘導了CoNAC5與CoNAC79基因的高表達且兩個NAC基因在外源施加ABA處理下更早啟動高表達，說明這兩個NAC基因可能通過參與ABA信號途徑參與干旱脅迫過程。此外，隨著處理時間的增加，不同處理下兩個NAC基因表達模式存在差異。CoNAC5的表達量在PEG和ABA處理下在36 h和48 h時均顯著高于對照；CoNAC79的表達量在PEG處理36 h和48 h以及ABA處理36 h，均顯著高于對照，但是在ABA處理48 h時與對照無顯著差異。這可能是由于在脅迫的不同階段，NAC基因也可能通過非ABA合成依賴的方式直接參與干旱脅迫響應過程。在云杉的NAC研究中，PwNAC11也可以通過直接與ABA非依賴的DREB2A基因相互作用，從而激活下游ERD1基因表達，直接參與干旱脅迫響應（Yu et al. 2021）。由此推測，兩個油茶NAC基因參與干旱脅迫的調控途徑可能存在差異。CoNAC5可能主要通過參與ABA合成的方式間接響應干旱脅迫，而CoNAC79可能存在參與ABA合成間接或非依賴ABA合成直接參與干旱脅迫響應過程，但是具體調控機制尚不清楚。

4 結論

本研究從油茶cDNA中成功克隆了CoNAC5與CoNAC79基因，亞細胞定位證實兩個蛋白均定位于細胞核上，為典型的核蛋白。酵母雜交實驗發現兩個蛋白的N端不具有轉錄自激活活性，而C端均具有轉錄自激活活性，這可能是由于N端存在阻礙全長序列下兩個NAC基因轉錄激活的抑制區段。熒光定量PCR結果證實CoNAC5與CoNAC79在干旱脅迫下和ABA處理下高表達，但是隨著處理時間的持續，不同處理下的基因表達趨勢存在差異，推測CoNAC5可能通過參與ABA合成途徑間接參與干旱脅迫響應，而CoNAC79可以通過ABA合成的方式間接或非ABA依賴途徑的方式直接調控干旱響應過程，但是具體調控機制尚不清楚，后續可從酵母雙雜文庫篩選互作蛋白、過表達或基因敲除等方式進一步研究其功能。

參考文獻：

ASLAM， WASEEM M， ZHANG Q， et al.， 2021. Identification of ABC transporter G subfamily in white lupin and functional characterization of L. albABGC29 in phosphorus use ［J］. BMC Genomics， 22（1）： 1-14.

BU QY， JIANG HL， LI CB， et al.， 2008. Role of the Arabidopsis thaliana NAC transcription factors ANAC019 and ANAC055 in regulating jasmonic acid-signaled defense responses ［J］. Cell Res， 18（7）： 756-767.

CHEN X， WANG YF， BO L， et al.， 2014. The NAC family transcription factor OsNAP confers abiotic stress response through the ABA pathway ［J］. Plant Cell Physiol， 55（3）：604-619.

CHEN ZY， YAN XQ， TANG MH， et al.， 2022. Molecularcharacterization and drought resistance of GmNAC3 transcription factor in Glycine max （L.） Merr ［J］. Int J Mol Sci， 23（20）： 12378.

CAO RL， LI ZQ， OUYANG WT， et al.， 2021. Identification of NAC gene in Camellia oleifera and analysis of its response to drought stress ［J］. J Jiangxi Agric Univ， 43（6）： 1357-1370. ［曹瑞蘭， 李知青， 歐陽雯婷， 等， 2021. 油茶NAC基因鑒定及對干旱脅迫響應分析 ［J］. 江西農業大學學報， 43（6）： 1357-1370.］

DING SJ， ZHONG QP， YUAN TT，et al.， 2017. Effects of drought stress on Camellia oleifera flower-bud growth and production ［J］. J Nanjing For Univ （Nat Sci Ed）， 41（5）： 197-202. ［丁少凈， 鐘秋平， 袁婷婷， 等， 2017. 干旱脅迫對油茶花苞生長及產量的影響 ［J］. 南京林業大學學報（自然科學版）， 41（5）： 197-202.］

FUJITA M， FUJITA Y， MARUYAMA K， et al.， 2004. A dehydration-induced NAC protein， RD26， is involved in a novel ABA-dependent stress-signaling pathway ［J］. Plant J， 39（6）： 863-876.

HAN XM， FENG ZQ， XING DN， et al.， 2015. Two NAC transcription factors from Caragana intermedia altered salt tolerance of the transgenic Arabidopsis ［J］. BMC Plant Biol， 15（1）： 1-12.

HAO YJ， WEI W， SONG QX， et al.， 2011. Soybean NAC transcription factors promote abiotic stress tolerance and lateral root formation in transgenic plants ［J］. Plant J， 68（2）： 302-313.

HAO YJ， SONG QX， CHEN HW， et al.， 2010. Plant NAC-type transcription factor proteins contain a nard domain for repression of transcriptional activation ［J］. Planta， 232： 1033-1043.

HE F， 2011. Study of overall arrangement for construction China’s industrial system of non-wood forest Ⅰ： Woody edible oils ［J］. J Cent S Univ For Technol， 31（3）： 1-7. ［何方， 2011. 中國現代經濟林產業體系建設布局研究Ⅰ——木本食用油料篇 ［J］. 中南林業科技大學學報， 31（3）： 1-7. ］

HU HH， DAI MQ， YAO JL， et al.， 2018. Overexpressing a NAM， ATAF， and CUC （NAC） transcription factor enhances drought resistance and salt tolerance in rice ［J］. Proc Natl Acad Sci USA， 103（35）： 12987-12992.

HUANG C， ORBAN T， JASTRZEBSKA B， et al.， 2011. Activation of G protein-coupled receptor kinase 1 involves interactions between its N-terminal region and its kinase domain ［J］. Biochemistry， 50（11）： 1940-1949.

HUANG L， ZHANG HJ， LI DY， et al.，2016. Rice NAC transcription factor ONAC095 plays opposite roles in drought and cold stress tolerance ［J］. BMC Plant Biol， 16： 1-18.

JENSEN M， KJAERSGAARD T， NIEISEN M， et al.， 2010. The Arabidopsis thaliana NAC transcription factor family： Structure-function relationships and determinants of ANAC019 stress signalling ［J］. Biochem J， 426（2）： 183-196.

JIANG HL， LI HM， BU QY， et al.， 2009. The RHA2a-interacting proteins ANAC019 and ANAC055 may play a dual role in regulating ABA response and jasmonate response ［J］. Plant Signal Behav， 4（5）： 464-466.

JIN H， COMINELLI E， BAILEY P， et al.， 2000. Transcriptional repression by AtMYB4 controls production of UV-protecting sunscreens in Arabidopsis ［J］. EMBO J， 19（22）： 6150-6161.

LIU YC， SUN J， WU YR， et al.， 2016. Arabidopsis ATAF1 enhances the tolerance to salt stress and ABA in transgenic rice ［J］. J Plant Res， 129： 955-962.

LIU ZB， HABEN G， GUILFOYLE TJ， et al.， 1997. A G-box-binding protein from soybean binds to the E1 auxin-response element in the soybean GH3 promoter and contains a proline-rich repression domain ［J］. Plant Physiol 115（2）： 397-407.

MAO HD， LI JY， HAN R， et al.， 2016. ZmNAC55， a maize stress-responsive NAC transcription factor， confers drought resistance in transgenic Arabidopsis ［J］. Plant Physiol Biochem， 105： 55-66.

NARBERHAUS F， LEE HS， SCHMITZ RA， et al.， 1995. The C-terminal domain of NiFL is sufficient to inhibit NiFA activity ［J］. J Bacteriol， 177（17）： 5078-5087.

OHTA M， MATSUIA K， HIRATSUA K， et al.， 2001. Repression domains of class Ⅱ ERF transcriptional repressors share an essential motif for active repression ［J］. Plant Cell， 13（8）： 1959-1968.

RAVENTOS D， SKRIVER K， SCHLEIN M， et al.， 1998. HRT， a novel zinc finger， transcriptional repressor from barley ［J］. J Biol Chem， 273（36）： 23313-23320.

SHANG XG， YU YJ， LIU HQ， et al.， 2020. A cotton NAC transcription factor GhirNAC2 plays positive roles in drought tolerance via regulating ABA biosynthesis ［J］. Plant Sci， 296： 110498.

SUN L， LIU LP， WANG YZ， et al.， 2020. NAC103， a NAC family transcription factor， regulates ABA response during seed germination and seedling growth in Arabidopsis ［J］.Planta， 252： 1-11.

TAKASAKI H， MARUYAMA K， SATOSHI K， et al.， 2010. The abiotic stress-responsive NAC-type transcription factor OsNAC5 regulates stress-inducible genes and stress tolerance in rice ［J］. Mol Genet Genom， 284： 173-183.

TRAN LAM-SON P， NAKAHIMA K， SAKUMA Y， et al， 2004. Isolation and functional analysis of Arabidopsis stress-inducible NAC transcription factors that bind to a drought-responsive cis-element in the early responsive to dehydration stress 1 promoter ［J］. Plant Cell， 16（9）： 2481-2498.

WANG JF， WANG YP， ZHANG J， et al.， 2021.The NAC transcription factor ClNAC68 positively regulates sugar content and seed development in watermelon by repressing ClINV and ClGH3.6 ［J］. Hortic Res， 8（1）： 214-214.

WANG YX， LIU ZW， WU ZJ， et al.， 2016. Transcriptome-wide identification and expression analysis of the NAC gene family in tea plant ［Camellia sinensis （L.） O. Kuntze］ ［J］. PLoS ONE， 11（11）： e0166727.

WU SQ， TANG CJ， ZHENG TH， et al.， 2022. Spatio-temporal characteristics of drought in Jiangxi based on index of continuous days without available precipitation ［J］. Resour Environ Yangtze Basin， 31（4）： 903-914. ［吳少強， 湯崇軍， 鄭太輝， 等， 2022. 基于連續無有效降雨日數指標的江西省干旱時空分布特征 ［J］. 長江流域資源與環境， 31（4）： 903-914.］

YU MX， LIU JI， DU BS， et al.， 2021. NAC transcription factor PwNAC11 activates ERD1 by interaction with ABF3 and DREB2A to enhance drought tolerance in transgenic Arabidopsis ［J］. Int J Mol Sci， 22（13）： 6952.

ZHANG XY， TIAN YH， QIN YZ， et al.， 2021. The role of miR169 family members in the processes of growth， development and abiotic stress response in planta ［J］. J Plant Genet Resour， 22（4）： 900-909. ［張幸媛， 田宇豪， 秦玉芝， 等， 2021. miR169在植物生長發育與非生物脅迫響應中的作用 ［J］. 植物遺傳資源學報， 22（4）： 900-909.］

（責任編輯 周翠鳴）

基金項目：" 江西省自然科學基金（20232BAB205054）； 江西省林業局油茶研究專項（YCYJZX ［2023］114號）； 湖北科技學院科研啟動金（BK202328）。

第一作者： 趙娜紅（1997—），碩士，研究方向為油茶抗旱分子機制，（E-mail）zhaonahong2021@163.com。

*通信作者：" 劉娟，博士，副教授，研究方向為林木遺傳改良、林木抗逆分子機制，（E-mail） liu_juan1122@163.com。