龍牙百合遠緣雜交后代鑒定及枯萎病抗性評價

摘 要： "龍牙百合（Lilium brownii var. viridulum）在栽培過程中容易感染枯萎病，而觀賞百合中的部分品種具有較強的枯萎病抗性。為了培育抗枯萎病的龍牙百合雜交后代，該文選擇抗病性強的觀賞百合品種與龍牙百合分別進行正交和反交，通過SSR分子標記鑒定雜種的真實性，并對雜交后代的枯萎病抗性進行鑒定。結果表明：（1）‘Black stone’等亞洲百合雜種系品種枯萎病抗病性較強，而龍牙百合、‘Pink planet’等品種枯萎病抗性最弱。（2）將龍牙百合作母本的正交組合共獲得28個蒴果，最終獲得3株龍牙百合 × ‘Black stone’的雜種苗；將龍牙百合作父本的反交組合共獲得74個蒴果，最終獲得1株‘Strawberry event’×龍牙百合的雜種苗。（3）SSR分子標記鑒定結果顯示，龍牙百合 × ‘Black stone’的3個雜種株系為真實雜種，‘Strawberry event’×龍牙百合的1個雜種株系為假雜種。（4）所獲得的3個龍牙百合 × ‘Black stone’雜種株系枯萎病抗性均為中抗。該研究結果為龍牙百合與觀賞百合的遠緣雜交提供了技術參考，也為后期培育枯萎病抗性強的百合新品種提供了材料基礎。

關鍵詞： 龍牙百合， 遠緣雜交， 枯萎病抗性， 胚珠培養， SSR分子標記

中圖分類號： "Q945.8"文獻標識碼： "A

文章編號： "1000-3142（2024）12-2172-15

Identification and Fusarium wilt resistance evaluation of distant hybrid offspring of Lilium brownii var. viridulum

LI Ze1，2， CHEN Miao1，2， ZHOU Li4， SUN Mengshan 4， XIANG Wei1，

MA Jie5， ZHENG Sixiang 4， ZENG Jianguo 3， LI Yufan 1，2*

（ 1. College of Horticulture， Hunan Agricultural University， Changsha 410128， China; 2. Hunan Mid-Subtropical Quality Plant Breeding andUtilization Engineering Technology Research Center， Changsha 410128， China; 3. College of Veterinary Medicine， Hunan AgriculturalUniversity， Changsha 410128， China; 4. Hunan Institute of Agricultural Environmental Ecology， Changsha 410128，China; 5. Hunan Cotton Research Institute， Changde 415000， Hunan， China ）

Abstract： "During the cultivation process of Lilium brownii var. viridulum， it is easy to be infected with wilt disease， while some varieties of ornamental lilies have strong resistance to wilt disease. The study aimed to create hybrids with improved resistance to wilt disease by crossbreeding Lilium brownii var. viridulum with various ornamental lily varieties. Disease-resistant ornamental lily cultivars were specifically chosen for reciprocal crosses with Lilium brownii var. viridulum. The authenticity of the hybrids was confirmed through SSR molecular markers， and the resistance of the hybrid offspring to wilt disease was subsequently assessed. The results were as follows： （1） Lilium Asiatic hybrids such as ‘Black stone’ had strong resistance to Fusarium wilt， while Lilium brownii var. viridulum and ‘Pink planet’ had the weakest resistance to Fusarium wilt. （2） A total of 28 capsules were obtained from the orthogonal combination using Lilium brownii var. viridulum as the maternal parent， and three Lilium brownii var. viridulum × ‘Black stone’ hybrid seedlings were finally obtained. The cross combination of Lilium brownii var. viridulum as the male parent obtained a total of 74 capsules， and ultimately obtained a hybrid seedling of ‘Strawberry event’ × Lilium brownii var. viridulum. （3） SSR molecular marker identification results showed that three hybrid seedlings of Lilium brownii var. viridulum" × ‘Black stone’ were real hybrids， while one hybrid seedlings of ‘Strawberry event’ × Lilium brownii var. viridulum was a 1 hybrid. （4） The three Lilium brownii var. viridulum × ‘Black stone’ hybrid seedlings obtained had moderate resistance to Fusarium wilt. This study provides a reference for the distant hybridization of Lilium brownii var. viridulum and ornamental lilies， and proves that Lilium brownii var. viridulum" hybrids with Fusarium wilt resistance can be obtained through hybridization. This study provides a technical guidance for the distant hybridization of Lilium brownii var. viridulum" with ornamental lily varieties， laying the groundwork for the breeding of new lily varieties with enhanced resistance to wilt disease in the future.

Key words： Lilium brownii var. viridulum， distant hybridization， Fusarium wilt resistance， ovule culture， SSR molecular markers

龍牙百合（Lilium brownii var. viridulum）主產于湖南、江西、貴州、四川等地，是我國傳統的食用百合栽培種類，亦是一種道地藥材。此外，龍牙百合觀賞價值較高，是一種藥食賞兼用的多功能植物，在鄉村振興中發揮重要作用。近年來，湖南、江西等龍牙百合主產區面臨著因品種退化、土傳病害嚴重而導致的連作障礙問題（蔣思佳，2023）。百合栽培過程中面臨的土傳病害是由尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）引起的枯萎病（Prados-Ligero et al.， 2008；王麗波等，2018；Sun et al.， 2024），通常采用化學方式進行防治。但是，由于化學防治容易造成農殘含量超標等一系列問題，而利用抗性品種進行枯萎病防治則更加安全、環保，因此利用雜交進行龍牙百合抗性育種具有重要意義。目前，雜交育種既是培育百合新品種的主要手段，也是近代育種工作中最常采取的方法，育種學家已經培育出大量枯萎病抗性強的觀賞百合品種（楊秀梅等，2010；龍彬等，2018）。然而，鮮有人利用雜交育種進行龍牙百合抗病性種質創新。

目前，已有大量學者對不同百合品種的枯萎病抗性進行了評價。其中，亞洲百合雜種系（Lilium Asiatic hybrids）的抗性最強，麝香百合雜種系（Lilium longiflorum hybrids）的抗性次之，東方百合雜種系（Lilium Oriental hybrids）的抗性最弱（Lim et al.， 2003；楊秀梅等，2010）。由于百合商業栽培品種更新較快，因此近年來暢銷的觀賞百合栽培品種的枯萎病抗性并未獲得鑒定。已有一些學者將易感枯萎病的百合品種與枯萎病抗性強的百合品種進行雜交，成功選育出抗枯萎病的雜交后代。例如，謝松林（2011）將易感枯萎病的麝香百合‘White fox’與具有枯萎病抗性的亞洲百合‘Connecticut king’進行雜交，獲得了具有枯萎病抗性的雜種后代；龍彬等（2018）利用枯萎病抗性強的東方百合‘Huaxianzi’作母本參與雜交，培育出了對鐮刀菌有很強抗性的東方百合新品種‘驚鴻’。利用枯萎病抗性強的觀賞百合與易感枯萎病的龍牙百合進行雜交，有望獲得具有枯萎病抗性的龍牙百合新種質。當前，有關龍牙百合的雜交育種研究主要聚焦于培育賞食兼用的龍牙百合雜交后代，如武利可（2020）將萬載龍牙百合和蘭州百合（Lilium davidii var. unicolor）進行雜交，崔羅敏（2021）將三倍體觀賞百合與二倍體食用龍牙百合進行雜交。以上2個研究均成功獲得了雜交后代，但未對親本及后代的抗病性進行評價。

雖然枯萎病已成為遏制龍牙百合種球生產的重要因素之一，但有關培育龍牙百合抗枯萎病雜交后代的研究鮮見報道。因此，本研究以湖南省隆回縣的龍牙百合，以及目前國內市場上暢銷的14個百合栽培品種為材料，對其進行枯萎病的抗性評價，將篩選出抗病性強的百合栽培品種與龍牙百合分別進行正交和反交，并對雜交后代進行枯萎病抗性鑒定，以期為龍牙百合的遠緣雜交提供參考，為后期培育抗性強的百合新品種提供材料基礎。本研究擬探討以下問題：（1）參與雜交的親本材料的枯萎病抗性；（2）通過重復授粉、子房切片及胚珠離體培養能否克服龍牙百合遠緣雜交障礙；（3）通過SSR分子標記鑒定以及雜交后代的枯萎病抗性鑒定能否鑒定出具有枯萎病抗性的龍牙百合雜交后代。

1 材料與方法

1.1 材料

研究所用植物材料包括傳統栽培變種龍牙百合（購自湖南一線情農業有限公司）和觀賞百合栽培品種（5個雜種系14個品種，均購自浙江的虹越花卉股份有限公司和湖南的龍山縣印家界生態農業開發有限公司）。其中，亞洲百合雜種系品種（A）為‘金百合’、‘Tresor’、‘Red county’、‘Peter’、‘Black stone’、‘Secret kiss’、‘Strawberry event’；東方百合雜種系品種（O）為‘Sorbonne’；麝香百合雜種系品種（L）為新鐵炮百合（Lilium×formolongi）、‘Pink planet’；麝亞百合雜種系品種（Lilium longiflorum hybrids×Lilium Asiatic hybrids，LA）為‘Yellow brush’、‘Brindisi’；麝東百合雜種系品種（Lilium longiflorum hybrids×Lilium Oriental hybrids，LO）為‘Cali’、‘Magnefique’。以上植物材料的種球均于2022年春季栽培于湖南農業大學園林花卉基地，植物材料開花圖片如圖1所示。供試菌種尖孢鐮刀菌（菌株編號為ACCC37262，購自中國農業微生物菌種保藏管理中心），該菌為百合枯萎病的致病菌。菌種接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（potato dextrose agar，PDA），購自北京索萊寶科技有限公司，37 g·L-1，置于25 ℃下培養7 d后保存于4 ℃冰箱待用。

1.2 方法

1.2.1 枯萎病抗性鑒定 對所有百合材料采用離體葉片接種法進行枯萎病抗性鑒定。（1）離體葉片的準備：每個百合品種選擇生長健壯發育階段一致的植株，每個品種分別從上、中、下 3個部位等量摘取葉片，共摘取30片葉片。（2）菌絲塊的準備：用直徑為0.5 cm的打孔器將尖孢鐮刀菌打成菌絲塊，待用。（3）接種：將摘取的葉片用75%酒精滅菌15 s，用無菌水沖洗干凈，擺放于鋪有無菌濾紙的培養皿上，濾紙用無菌水保濕；用接種針挑取菌絲塊，每個葉片上分別接種2個菌絲塊，菌絲面朝下和葉片充分接觸；將葉片基部用濕潤的棉球覆蓋，接種完成后包上保鮮膜，置于25 ℃條件下培養，分別于1 d、3 d、5 d、7 d、9 d的同一時間調查葉片的發病情況，每日觀察時在濾紙上滴加無菌水。

百合尖孢鐮刀菌侵染葉片致病的分級標準、枯萎病抗性評價標準參照朱麗梅等（2012）的方法。枯萎病葉部病斑分級標準如下：0級，無病斑；1級，葉片病斑較少，病斑面積占整片葉面積的 5%以下；3級，病斑較多，病斑面積占整個葉面積的 5%～30%；5級，病斑較多，病斑面積占整個葉面積的 31%～50%；7級，病斑很多或融合成大斑，病斑面積占整個面積的比例在50%以上。根據相對抗性指數進行抗性劃分，抗性水平及對應的相對抗性指數分別為高抗（HR）=0.70～1.00、中抗（MR）=0.40～0.69、中感（MS）=0.20～0.39、高感（HS）lt;0.20。

病情指數的計算公式如下：

病情指數（%）=Σ（病級葉片數×病級代表值）/（調查總葉片數×最高病級代表值）×100；相對抗性指數（%）=100-相對病情指數。

1.2.2 雜交組合與雜交方式的確定 根據不同百合種及品種的枯萎病抗病程度、前期測定的花粉生活力情況，確定雜交組合。選擇枯萎病抗性為高抗、中抗的觀賞百合栽培品種與龍牙百合分別進行正交和反交，作父本的觀賞百合栽培品種要求具有較強的花粉生活力。采用常規雜交授粉方式，分別于花蕾期、盛花期、末花期進行不同時期授粉，每天早、中、晚重復授粉3次，每個雜交組合雜交 30 朵花以上，授粉后套袋，并掛上標簽（周敏等，2023）。授粉后30 d統計子房膨大率，子房膨大率（%）=膨大子房數/授粉花朵數×100。

1.2.3 子房切片培養及胚珠離體培養 授粉50 d后，摘下尚未成熟的子房，刷洗表面污垢，于自來流水下沖洗1 h左右，在組培臺上用75%酒精消毒30 s，無菌水沖洗3次，放于10%次氯酸鈉溶液（NaClO）中不斷搖晃5 min，無菌水沖洗5次，置于接種盤上將子房橫切為0.3 cm的薄切片；之后接種在子房切片培養基上，培養基配方為1/2 MS+30 g·L-1蔗糖+0.01 mg·L-1萘乙酸（NAA）+0.1 mg·L-1 6-芐氨基嘌呤（6-BA）+7.5 g·L-1瓊脂，pH值為5.8～6.0。培養25 d后，將膨大胚珠取出放于胚珠離體培養基上，培養基配方為MS+30 g·L-1蔗糖+0.01 mg·L-1 NAA+7.5 g·L-1瓊脂，pH值為5.8～6.0。大約2個月后統計胚珠的萌發率，胚珠萌發率（%）=萌發出苗的胚珠數/膨大胚珠數×100。

1.2.4 雜種苗SSR分子標記鑒定 采用SSR分子標記鑒定雜種的真實性，采集雜種苗及其親本的新鮮幼嫩葉片，并提取DNA。利用周艷萍（2020）篩選發表的百合SSR引物進行PCR擴增。反應體系25.0 μL：2×Rapid Taq Master Mix 12.5 μL，DNA模板1.0 μL，10 μmol·L-1上游和下游引物各1.0 μL，補足ddH2O至25 μL。擴增程序：95 ℃預變性3 min；95 ℃15 s，56～63 ℃ 15 s，72 ℃ 15 s，進行35個循環；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。用2%瓊脂糖凝膠電泳篩選出條帶穩定清晰、無雜帶且多態性較好的引物，加上熒光標記后送至北京睿博興科生物技術有限公司進行毛細管電泳檢測。

1.2.5 雜交后代枯萎病抗性鑒定 選取直徑1.5 cm左右的組培小鱗莖移植到無菌基質中培養7 d，將小鱗莖移入大小一致的裝有滅菌基質的花盆中，用直徑1 cm的打孔器將尖孢鐮刀菌打成菌絲塊放入基質中，每5小球為一組，設置3次重復，置于25 ℃培養箱中培養，培養3 d、6 d、9 d、12 d、15 d、18 d、21 d、24 d、27 d、30 d后分別對病情進行統計。百合尖孢鐮刀菌侵染百合鱗莖致病的鑒定方法、病級分級標準抗性評價標準均參考羅建讓和謝松林（2015）的方法。枯萎病鱗莖病級分級標準：1級，無癥狀；2級，莖盤處稍有鐮刀菌侵染癥狀；3級，莖盤已有明顯腐爛，外部鱗片易脫落；4級，球莖盤嚴重腐爛，外部鱗片脫落；5級，球莖盤完全腐爛，鱗片觸手即散；6級，種球完全腐爛，無法找到。根據相對抗性指數進行抗性劃分，抗性水平及對應的相對抗性指數分別為高抗（病情指數＜0.25）、中抗（0.25≤病情指數＜0.5）、中感（0.5≤病情指數＜0.75）和高感（0.75≤病情指數＜1）。

病情指數的計算公式如下：

各基因型病情指數=∑（病級數×鱗莖個數）/（最高級×總鱗莖數）。

2 結果與分析

2.1 不同百合種及品種枯萎病抗性鑒定

不同百合種及品種枯萎病的病情發展動態及抗性鑒定結果如表1所示，由于觀察到第9天時，大部分百合都達到最高感病等級，因此以第7天時的相對抗性指數確定抗性水平。7 d時不同百合種及百合品種枯萎病病情如圖2所示。表1和圖2結果表明，龍牙百合、‘Tresor’、‘Secret kiss’、‘Pink planet’ 感抗類型為中感； ‘金百合’、 ‘Redcounty’、‘Peter’、‘Strawberry event’、‘Sorbonne’、新鐵炮百合、‘Yellow brush’、‘Brindisi’、‘Cali’、‘Magnefique’的感抗類型為中抗；‘Black stone’的感抗類型為高抗。多數感病品種（龍牙百合、‘Secret kiss’、‘Pink planet’）發病早，病情發展迅速，多數抗性品種（‘Black stone’、‘Sorbonne’等）發病晚，病情發展緩慢。

2.2 雜交組合的確定及子房膨大率分析

根據不同百合種及品種枯萎病抗性鑒定結果，‘Tresor’、‘Secret kiss’和‘Pink planet’感抗類型為中感，不參與雜交，其余12個觀賞百合栽培品種的感抗類型為中抗或高抗，與中感類型的龍牙百合進行雜交，希望能獲得枯萎病抗性更強的后代。根據課題組前期花粉萌發率測定結果，‘Yellow brush’、‘Brindisi’、‘Cali’和‘Magnefique’的花粉萌發率基本為0，這4個百合品種僅作為母本參與雜交。因此，本研究以龍牙百合為母本，以‘金百合’、‘Red county’、‘Peter’、‘Black stone’、‘Strawberry event’、‘Sorbonne’和新鐵炮百合為父本進行正交，共7個雜交組合；以‘金百合’、‘Red county’、‘Peter’、‘Black stone’、‘Strawberry event’、‘Sorbonne’、新鐵炮百合、‘Yellow brush’、‘Brindisi’、‘Cali’和‘Magnefique’為母本，以龍牙百合為父本進行反交，共11個雜交組合。

授粉50 d后，以龍牙百合作母本時，所有雜交組合的子房均有膨大，但不同品種間的子房膨大率存在顯著差異，其中龍牙百合בStrawberry event’的子房膨大率最高，為26.09%；以‘金百合’、‘Black stone’（圖3：A）、‘Peter’3個亞洲百合品種作父本時，子房膨大率在11%～13%之間；以新鐵炮百合作父本時，子房膨大率最低，為3.23%（表2）。以龍牙百合作父本時，只有‘Red county’、‘Black stone’、‘Strawberry event’、新鐵炮百合、‘Brindisi’、‘Cali’和‘Magnefique’為母本的雜交組合的子房出現膨大，其中以‘Red county’、‘Strawberry event’、‘Brindisi’為母本的雜交組合的子房膨大率較高，均在40%以上，而以‘Black stone’作母本的子房膨大率最低，為2.50%（表3）。

因此，以龍牙百合做母本時，所有雜交組合都存在子房膨大現象，但子房膨大率普遍不高，較高的幾個組合均為以亞洲百合品種作父本的雜交組合；以龍牙百合做父本時，只有一部分雜交組合獲得了膨大蒴果，但子房膨大率明顯高于以龍牙百合做母本的。

2.3 不同雜交組合幼胚萌發率分析

以龍牙百合作母本時，通過子房切片（圖3：B）及胚珠離體培養（圖3：C），僅有龍牙百合בBlack stone’這一雜交組合中有幼胚萌發，萌發率為12.90%（圖3：D；表2）。以龍牙百合作父本時，僅有‘Strawberry event’×龍牙百合有胚珠萌發，萌發率為7.69%（表3）。胚珠經過120 d無菌培養后，共獲得龍牙百合בBlack stone’（LYA-1、LYA-2、LYA-3）的3個雜種單株（圖3：E）和‘Strawberry event’×龍牙百合（ALY）的1個雜種單株。其他雜交組合所獲胚珠均未出現萌發現象。

2.4 雜種苗SSR分子標記鑒定

使用SSR分子標記對雜交后代的真實性進行檢測，利用瓊脂糖凝膠電泳篩選，得到11對條帶清晰、具有多態性的SSR引物，并用這些引物進行毛細管電泳檢測（表4）。圖4、圖5結果表明，LYA-1、LYA-2、LYA-3在引物SB091中同時擴增出了母本和父本的特異性片段，LYA-1、LYA-3在引物MJ014中同時擴增出了母本和父本的特異性片段；圖6結果表明，LYA-2、LYA-3在引物XT094中同時擴增出了母本和父本的特異性片段；ALY在11對引物中均只擴增出了母本的特異性片段。因此，LYA-1、LYA-2、LYA-3均為龍牙百合בBlack stone’的真實雜交后代，而ALY不是‘Strawberry event’× 龍牙百合的雜交后代。

2.5 雜交后代枯萎病抗性鑒定

以親本為對照，龍牙百合 × ‘Black stone’雜交后代枯萎病的病情發展動態及抗性鑒定結果如表5所示，以30 d時的感病指數確定抗性水平。龍牙百合在接菌培養24 d后1個小鱗莖完全腐爛至無法找見，第30天時3個小鱗莖腐爛至完全找不見，而30 d時其他百合種類均未存在完全腐爛至無法找見的情況，第21天時雜交后代LYA1及親本小鱗莖生長狀況如圖7所示。因此，龍牙百合感抗類型為高感，‘Black stone’、LYA-1、LYA-2、LYA-3感抗類型為中抗；龍牙百合發病早、病情發展迅速，而‘Black stone’、LYA-1、LYA-2、LYA-3病情發展較為緩慢。

3 討論

3.1 百合種質資源枯萎病抗性評價

為選擇枯萎病抗性較強的親本，本研究采用離體葉片接菌法對收集到的百合種質資源進行枯萎病抗性評價，結果表明亞洲百合雜種系、麝香百合雜種系、麝亞百合雜種系、麝東百合雜種系中大部分品種均具有一定的抗病性，存在高抗及中抗品種，這與楊秀梅等（2012）研究結果一致。楊秀梅等（2012）采用鱗片接種法對36個百合栽培品種及5個野生種進行枯萎病抗性鑒定，發現百合野生種的抗病性較強，亞洲百合雜種系、麝香百合雜種系、麝亞百合雜種系的多數品種對鐮刀菌表現為較高的抗性，而東方百合雜種系中大部分品種則表現為較易感染鐮刀菌。本研究用離體葉片接菌法鑒定湖南隆回龍牙百合枯萎病抗性結果為中感，但在李潤根和程華（2017）的研究中，采用離體葉片接種法進行枯萎病抗性鑒定，其所選用的7個不同產地的龍牙百合種系枯萎病抗性鑒定結果均為高感，而在鱗片接種法中7個龍牙百合枯萎病抗性有所不同，其中‘廣西高片’、‘萬載柳片’的龍牙百合為中抗，說明不同產地的龍牙百合品系間的枯萎病抗性有所差異。

3.2 龍牙百合遠緣雜交技術研究

本研究中，以龍牙百合做母本時，盡管所有雜交組合都存在子房膨大現象， 但子房膨大率普遍橫向數字表示片段長度， 縱向數字表示信號強度。下同。

不高，較高的幾個組合都是以亞洲百合品種作父本的雜交組合，以東方百合品種作父本時子房膨大率次之，而麝香百合品種最低。本研究結果表明，龍牙百合與亞洲百合系列的大部分品種親和性較高，較易獲得膨大蒴果實及雜種后代。以龍牙百合做父本時，雖然只有一部分雜交組合獲得膨大蒴果，但子房膨大率明顯高于以龍牙百合做母本的雜交組合。這說明以龍牙百合作父本進行遠緣雜交時，較容易獲得膨大果實。盡管本研究獲得了較多以龍牙百合作父本的膨大蒴果，但未獲得雜種后代，推測可能受限于子房切片、胚珠離體培養的實驗技術水平，或是沒有選擇到合適的時期，從而沒能克服受精后障礙獲得雜種苗。

近年來，部分學者對龍牙百合進行了遠緣雜交育種的研究，武利可（2020）將龍牙百合與蘭州百合進行正交和反交，僅在以龍牙百合為母本、以蘭州百合為父本時，獲得膨大果實，并獲得166株雜種苗。Kim等（2022）將漢森百合與龍牙百合進行正交和反交，僅有以龍牙百合為父本的雜交組合獲得了92株雜種苗。本研究將龍牙百合與觀賞百合栽培品種進行正交和反交，僅獲得龍牙百合בBlack Stone’的3株雜種苗，與上述兩位學者的研究結果一致，僅獲得單向的雜交后代，這可能與龍牙百合跟其他百合品種進行雜交時容易出現單向雜交不親和的現象有關。單向雜交不親和現象在其他百合種及品種的雜交中也較為常見，如尹燕等（2022）將蘭州百合與大花卷丹進行正交和反交，僅獲得蘭州百合×大花卷丹的雜交后代。此外，Wu等（2021）、Kim和Kim（2017）、Kim等（2022）選用龍牙百合進行遠緣雜交均獲得較多的雜交后代，但本研究獲得的雜交后代較少，分析認為，上述學者以龍牙百合為親本進行雜交的雜交組合較少，但雜交的花朵數都在80朵以上，并選擇了切割柱頭、混合授粉等多種雜交方式克服遠緣雜交障礙，從而獲得大量雜交后代。雖然本研究的雜交組合較多，但由于每一雜交組合的花朵數在30朵左右，并且僅采用重復授粉的方式克服遠緣雜交障礙，因此通過雜交僅獲得3株龍牙百合雜交后代。綜上可知，擴大雜交授粉的花朵數量和采用不同授粉方式是克服遠緣雜交障礙、增加雜交成功率、獲得更多雜交后代的重要方法。

3.3 雜交后代真實性鑒定及枯萎病抗性評價

本研究利用瓊脂糖凝膠電泳篩選得到11對條帶清晰、具有多態性的SSR引物，并利用SSR分子標記的方法，鑒定出3個龍牙百合בBlack stone’的真實雜交后代，1個‘Strawberry event’×龍牙百合的假雜種，為今后開展SSR分子標記鑒定工作提供了參考。近年來，SSR分子標記已成為百合雜交后代鑒定的一種普遍方法。例如，李卓憶（2019）通過SSR分子標記確定了蘭州百合בPrunotto’的15個雜交后代的真實性；舒柯（2022）利用SSR分子標記鑒定確定出卷丹百合בTresor’的2個雜種株系為真雜種。另外，本研究以龍牙百合作父本的雜交組合獲得了假雜種，考慮可能是因重復授粉的操作過程中未能包裹好柱頭而導致異源花粉污染或自交授粉，胡偉榮（2021）在雜交后代鑒定時也發現了蘭州百合בPink flavour’的假雜種，推測有可能是因授粉時花粉污染而導致。

本研究對所獲得的3個雜交后代及其親本進行枯萎病抗性鑒定，‘Black stone’、LYA-1、LYA-2、LYA-3的枯萎病抗性為中抗，龍牙百合的枯萎病抗性為高感，本研究通過雜交成功獲得了具有一定枯萎病抗性的龍牙百合雜交后代，說明通過遠緣雜交進行抗性育種在龍牙百合上切實可行。本研究采用小鱗莖栽培基質接種病原菌方法鑒定出‘Black stone’為中抗、龍牙百合為高感，與離體葉片法鑒定結果有所不同；李潤根和程華（2017）通過離體葉片接菌法、鱗片接種法鑒定蘭州百合、‘吉安龍牙’等百合的枯萎病抗性時，也出現兩種方法鑒定結果不一致的情況；張麗麗等（2012）通過用鱗片接種和離體葉片接種方法進行枯萎病抗性鑒定時，‘Bright’和‘Snow queen’在兩種不同方法下的鑒定結果也有差異。對于同種百合在不同方法進行枯萎病鑒定時存在差異的現象，可能是由于枯萎病為土傳病害，采用百合的不同部位為實驗材料，因此所展現的抗病能力有所不同。

4 結論

本研究將易感枯萎病的龍牙百合與抗枯萎病的觀賞百合進行遠緣雜交，最終獲得了具有枯萎病抗性的龍牙百合雜交后代，為之后培育抗性強、觀賞性狀優良的賞食兼用百合新品種提供了材料基礎。目前，本研究獲得的龍牙百合雜種苗仍處于幼齡生長階段，未能將其與親本進行觀賞性、食用價值等方面的比較，本課題組成員后期將對雜交后代觀賞性和食用價值等進一步進行評估，為培育抗性強、高產、優質的食用百合新品種提供材料基礎。

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（責任編輯 蔣巧媛 王登惠）

基金項目： "湖南省科學技術廳種業創新項目（2021NK1005）； 湖南省自然科學基金（2023JJ30292）。

第一作者： 李澤（1998—），碩士研究生，主要從事百合遺傳育種研究，（E-mail）495833558@qq.com。

*通信作者： "李玉帆，講師，主要從事百合遺傳育種研究，（E-mail）liyufan@hunau.edu.cn。