水稻OCPI2基因的克隆與表達分析

摘 要： "為探究蛋白酶抑制劑基因在水稻抵御植食性昆蟲為害中的功能，該研究以水稻品種‘中花11’為材料，克隆了水稻絲氨酸蛋白酶抑制劑基因OCPI2編碼區序列，并通過生物信息學軟件對其序列特征進行了分析和系統發育樹的構建，同時采用實時熒光定量PCR技術探究了該基因在植食性昆蟲取食和植物激素誘導下的表達特征。結果表明：（1）水稻OCPI2基因編碼區序列全長219 bp，編碼72個氨基酸，預測蛋白分子量為7.72 kDa，理論等電點為5.21，不含信號肽，無跨膜結構。（2）OCPI2蛋白與烏拉爾圖小麥（Triticum urartu， EMS61613.1）同源蛋白親緣關系較近。（3）OCPI2基因具有1個potato_inhibit保守結構域，屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑家族。（4）二化螟和褐飛虱取食、機械損傷以及水楊酸甲酯處理均能誘導OCPI2基因的表達，茉莉酸甲酯處理則持續抑制OCPI2基因表達。以上研究結果表明，OCPI2基因可能參與了水稻對植食性昆蟲的誘導防御反應，為深入研究OCPI2基因在水稻抗蟲防御反應中的功能提供理論依據。

關鍵詞： 水稻， 蛋白酶抑制劑， OCPI2， 基因克隆， 誘導表達特征

中圖分類號： "Q943"文獻標識碼： "A

文章編號： "1000-3142（2024）12-2187-10

Cloning and expression analysis of OCPI2 gene in rice

XU Jingang1，2， REN Xinxin2， WANG Haibing2， WANG Baixue2，JING Shengli2， LIU Qingsong2，3*

（ 1. College of Forestry， Southwest Forestry University， Kunming 650224， China; 2. College of Life Sciences， Xinyang Normal University，Xinyang 464000， Henan， China; 3. College of Life Sciences， State Key Laboratory of Cotton Bio-Breedingand Integrated Utilization， Henan University， Kaifeng 475004， Henan， China ）

Abstract： "To investigate the function of protease inhibitor genes in rice defense against herbivorous insects， the coding sequence of the protease gene OCPI2 from the rice variety ‘Zhonghua 11’ was cloned. The sequence characteristics of OCPI2 gene were analyzed， and a phylogenetic tree was constructed using bioinformatics software. Real-time quantitative PCR was utilized to examine the expression characteristics of OCPI2 gene under herbivorous insect feeding and plant hormone treatment. The results were as follows： （1） The coding region of OCPI2 gene was 219 bp， encoding a protein of 72 amino acids. The OCPI2 protein had a molecular weight of 7.72 kDa and a theoretical isoelectric point of 5.21， with no signal peptide and no transmembrane structure. （2） The OCPI2 protein was closely related to the homologous protein in Triticum urartu （EMS61613.1）. （3） The OCPI2 gene contained a potato_inhibit conserved domain and belonged to the serine protease inhibitor family. （4） The expression of OCPI2 gene was induced by feeding from the rice striped stem borer （Chilo suppressalis） and the brown planthopper （Nilaparvata lugens）， mechanical wounding， and methyl salicylate treatment， whereas methyl jasmonate treatment consistently suppressed OCPI2 gene expression. Taken together， these results suggest that OCPI2 gene may be involved in the induced defense response of rice to herbivorous insects. This study provides a theoretical reference for a deeper understanding of the function of OCPI2 gene in rice defense against insect herbivores.

Key words：rice， protease inhibitor， OCPI2， gene cloning， induced expression signature

蛋白酶抑制劑（protease inhibitor， PI）廣泛存在于動物、植物和微生物中，是一類分子量介于5～25 kDa之間的小分子多肽或蛋白質，以二聚體或四聚體的方式存在于生物體中，對于蛋白水解活性的調節至關重要，在代謝和細胞生理學相關的生物學過程中發揮重要作用（Habib amp; Fazili， 2007）。在植物中，蛋白酶抑制劑是貯藏蛋白，也是內源性蛋白調節因子，不僅參與種子萌發和休眠等生理過程，而且參與調節植物對植食性昆蟲的抗性（Hrger amp; van der Hoorn， 2013; Singh et al.， 2020; Xie et al.， 2021）。例如，一些植物蛋白酶抑制劑通過調控昆蟲內源蛋白酶活性從而導致細胞程序性死亡，它們也能進入昆蟲消化道，與昆蟲腸道中消化酶結合，抑制其活性，從而影響昆蟲對營養物質的消化吸收，最終干擾昆蟲的生長發育（Meekins et al.， 2017）。此外，一些蛋白酶抑制劑也能進入昆蟲血淋巴，干擾免疫系統（Rahbé et al.， 2003）。因此，發掘植物蛋白酶抑制劑基因，解析其生理功能，并將其應用于害蟲防治對于發展綠色農業具有重要意義。

植物中存在多種類型的蛋白酶抑制劑，主要包括絲氨酸蛋白酶抑制劑（serine proteinase inhibitor）、半胱氨酸蛋白酶抑制劑（cysteine proteinase inhibitor）、天冬氨酸蛋白酶抑制劑（aspartic proteinase inhibitor）和金屬蛋白酶抑制劑（metallo-proteinase inhibitor） （Laskowski amp; Kata， 1980）。在這些蛋白酶抑制劑中，絲氨酸蛋白酶抑制劑和半胱氨酸蛋白酶抑制劑的應用最為廣泛。絲氨酸蛋白酶抑制劑是植物最豐富的一類蛋白酶抑制劑（Rustgi et al.， 2018），其結構較為復雜，但在功能上非常保守，可以抑制多種絲氨酸蛋白酶的活性和調節植物體內自身的免疫反應，增強植物對昆蟲的抗性（Clemente et al.， 2019; Benbow et al.， 2019; Ferreira et al.， 2023）。如Losvik等（2017）發現在大麥（Hordeum vulgare）中過表達絲氨酸蛋白酶抑制劑基因Barley chymotrypsin inhibitor 2c （CI2c）能顯著提高大麥對桃蚜（Myzus persicae）的抗性，進一步研究發現，CI2c基因通過抑制桃蚜消化酶的活性，干擾了其營養吸收和生長，從而顯著降低其繁殖力。半胱氨酸蛋白酶抑制劑則通過水解半胱氨酸蛋白酶影響昆蟲的正常生長發育，對于鞘翅目昆蟲具有較好的抗蟲效果。Cingel等（2017）將半胱氨酸蛋白酶抑制劑胱抑素I和Ⅱ （oryzacystatin I和oryzacystatin Ⅱ，OC I和OC Ⅱ）基因轉入馬鈴薯（Solanum tuberosum）中，獲得能同時表達這兩種蛋白質的馬鈴薯。進一步生物測定試驗顯示，取食上述轉基因馬鈴薯的科羅拉多馬鈴薯甲蟲（Leptinotarsa decemlineata）幼蟲發育速度減慢，體重降低，死亡率升高。

水稻（Oryza sativa）是全球重要的糧食作物之一，水稻的穩產對于全球糧食生產至關重要。然而，水稻在生長過程中常常受到各種害蟲的為害，導致產量和品質下降（Lou et al.， 2013）。當前我國水稻害蟲防治主要依賴化學殺蟲劑，不僅危害人類健康，還會導致環境污染、農副產品中農藥殘留量超標和害蟲抗藥性增加等（Mao et al.， 2019）。因此，發展綠色防控手段對于水稻害蟲綜合治理具有重要意義。發掘抗蟲基因，培育和種植抗蟲水稻品種是水稻害蟲防治的重點，植物蛋白酶抑制劑基因的發掘和利用是其中一個重要研究方向。譬如，絲氨酸蛋白酶抑制劑在水稻抵御二化螟（Chilo suppressalis）、稻縱卷葉螟（Cnaphalocrocis medinalis）及稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）等病蟲害中發揮了重要作用（Zhang et al.， 2020; Liu et al.， 2021; 張娜等，2022）。轉基因水稻超量表達胰蛋白酶抑制劑基因AvrPiz-t interacting protein 4 （APIP4）可增強對二化螟和稻瘟病菌的抗性（Zhang et al.， 2020; Liu et al.， 2021）。也有研究顯示轉入外源蛋白酶抑制劑基因可增強植物對病蟲害抗性，如豇豆胰蛋白酶抑制劑基因（cowpea trypsin inhibitor， CpTI）是一種廣譜抗蟲基因，向水稻中轉入CpTI基因可對多種水稻害蟲產生較強的抗性（Xu et al.， 1996）。轉基因水稻表達大麥胰蛋白酶抑制劑CMe基因顯著提高了對米象（Sitophilus oryzae）的抗性，進一步研究發現，轉基因水稻中表達的胰蛋白酶抑制劑CMe降低了米象腸道胰蛋白酶的活性，從而抑制米象的生長和發育（Alfonso-Rubí et al.， 2003）。因此，發掘新的蛋白酶抑制劑基因對于水稻害蟲綠色防控具有重要價值。

前期轉錄組測序結果表明，二化螟和褐飛虱（Nilaparvata lugens）為害均可誘導水稻蛋白酶抑制劑基因（Oryza sativa chymotrypsin protease inhibitor 2， OCPI2）上調表達，推測該基因在水稻抵御上述害蟲中發揮了重要作用（Liu et al.， 2016，2021）。本研究以水稻品種‘中花11’（‘Zhonghua 11’，‘ZH11’）為材料，通過基因克隆的方法對OCPI2基因編碼區進行克隆，利用生物信息學軟件對該基因進行生物信息學分析，通過實時熒光定量PCR技術分析了OCPI2基因的誘導表達特征，擬探討以下問題：（1）OCPI2基因編碼區序列及其在不同水稻品種中序列是否一致；（2）OCPI2基因編碼蛋白的理化性質、結構特征、所屬家族以及物種間蛋白序列同源性和進化關系；（3）OCPI2基因在不同昆蟲（二化螟和褐飛虱）、機械損傷處理和不同植物激素（水楊酸甲酯和茉莉酸甲酯）處理后的表達特征，以期為深入解析OCPI2在水稻抗蟲中的功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試水稻

本研究以水稻品種‘ZH11’和‘臺中1號’（‘TN1’）為試驗材料，‘ZH11’用于試驗處理，‘TN1’用于飼養褐飛虱。將顆粒飽滿的水稻種子浸泡于清水中，置于37 ℃恒溫箱。待浸泡種子露白后，將其以浸濕毛巾包裹，并繼續置于37 ℃恒溫箱中，待其根和芽露出后種植于滅菌營養土中。培養條件：溫度（30 ± 2） ℃、光周期16 L（光）∶8 D（暗）、相對濕度（75 ± 10）%，生長至40 d，取長勢及狀態相似的水稻植株用于試驗。

1.2 供試昆蟲

二化螟和褐飛虱用于本試驗。二化螟采用茭白飼養至化蛹，羽化后飼以20%的蜂蜜水。飼養條件：溫度（28 ± 2） ℃、光周期16 L∶8 D、相對濕度（75 ± 10）%。褐飛虱以40 d左右‘TN1’水稻苗飼養，飼養條件：溫度（26 ± 2） ℃、光周期16 L∶8 D、相對濕度（60 ± 10）%。

1.3 水稻處理

1.3.1 二化螟為害處理 采用透明塑料筒（直徑為1.5 cm，高為7 cm）套在水稻莖稈基部，上下用海綿封住后置于培養箱中放置3 d，消除套管對水稻造成的機械損傷。將提前饑餓處理2 h的3齡二化螟幼蟲接入透明管內的水稻莖稈上，并觀察幼蟲鉆蛀行為，至二化螟幼蟲身體一半鉆入水稻莖稈后開始計時。在二化螟為害水稻不同時間（0、1、2、4、8、12、24、48 h）后，剪取蟲害部位水稻莖稈，立即浸入液氮速凍，然后置于Symbolm@@80 ℃超低溫冰箱中保存。以套筒后未接蟲的‘ZH11’水稻相同部位莖稈作為對照，每個處理設置3次生物學重復。

1.3.2 褐飛虱為害處理 提前3 d在水稻植株基部套上透明塑料筒（見1.3.1），在筒內接入15頭褐飛虱4齡若蟲，放入后開始計時。在褐飛虱為害不同時間（0、1、2、4、8、12、24、48 h）后，剪取為害部位水稻莖稈，立即浸入液氮速凍，然后置于-80 ℃超低溫冰箱中保存。以套筒后未接入褐飛虱的‘ZH11’水稻相同部位莖稈作為對照，每個處理設置3次生物學重復。

1.3.3 機械損傷處理 在靠近水稻莖稈基部2～3 cm處的兩側，用昆蟲針（針尖直徑0.32 mm）少力均勻地刺100次。在損傷后不同時間點（0、1、2、4、8、12、24、48 h），剪取水稻損傷部位莖稈，立即浸入液氮速凍，然后置于Symbolm@@80 ℃超低溫冰箱中保存。以相同條件下未經昆蟲針刺的‘ZH11’水稻相同部位莖稈作為對照，每個處理設置3次生物學重復。

1.3.4 植物激素處理 使用pH=8.0的50 mmol·L-1磷酸緩沖液將水楊酸甲酯（美國Sigma公司）和茉莉酸甲酯（美國Sigma公司）分別配制成終濃度為70 μg·mL-1和100 μg·mL-1 的溶液，噴灑前分別加入終體積為0.01%的吐溫20。在40 d苗齡的‘ZH11’水稻整株均勻噴灑2 mL上述水楊酸甲酯或者茉莉酸甲酯溶液。分別在處理0、1、2、4、8、12、24、48 h后剪取水稻莖稈，立即浸入液氮速凍，然后置于Symbolm@@80 ℃超低溫冰箱中保存。以相同條件下噴灑2 mL的50 mmol·LSymbolm@@1磷酸緩沖液（pH 8.0）的水稻莖稈作為對照，每個處理設置3次生物學重復。

1.4 總RNA提取及cDNA合成

水稻莖稈組織采用液氮研磨處理后，取100 mg樣品用于提取總RNA，參照RNAiso Plus （TaKaRa）說明書進行。提取的RNA經瓊脂糖凝膠電泳檢測確認無降解后，用NanoDrop 2000 （Thermo Fisher Scientific， USA）檢測其濃度和純度。以1 μg總RNA為模板，參照PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser （Perfect Real Time） （TaKaRa）試劑盒說明書合成cDNA。該反應采用20 μL反應體系，分兩步進行：第一，去除基因組DNA；第二，再反轉錄成cDNA。具體包括以下步驟，第一步反應：1 μg總RNA，2 μL 5 × gDNA Eraser Buffer，1 μL gDNA Eraser，加RNase Free dH2O至10 μL。反應條件：42 ℃， 2 min， 4 ℃終止反應。第二步反應：第一步反應液10 μL，1 μL PrimeScript RT Enzyme Mix I，1 μL RT Primer Mix，4 μL 5 × PrimeScript Buffer 2 （for Real Time），加RNase Free dH2O至總體積20 μL。反應條件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 50 s終止反應。試驗全程在超凈工作臺上完成，使用耗材均為RNase Free，反應液的配置均在冰上完成，合成的cDNA保存于Symbolm@@20 ℃冰箱用于后續試驗。

1.5 水稻OCPI2基因克隆與序列分析

根據水稻基因組數據庫（Rice Genome Annotation Project， RGAP）報道的‘日本晴’（Oryza sativa spp. japonica） OCPI2基因（LOC_Os01g42860）序列，用Primer 5軟件設計包含該基因全部CDS的上下游引物，引物序列見表1，送至生工生物工程（上海）股份有限公司合成。以二化螟幼蟲為害24 h的‘ZH11’水稻莖稈cDNA為模板進行PCR擴增，將擴增產物在1%的瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測，經切膠回收后連接于pMD-18T載體（TaKaRa），連接產物轉入感受態大腸桿菌，并涂布到含有氨芐青霉素（Amp）的抗性平板上培養過夜，挑取單菌落進行菌液PCR驗證，最后將PCR驗證正確的菌液送至武漢禾泰青生物公司測序。利用Jalview軟件將測序結果與‘日本晴’OCPI2基因序列進行比對。使用在線軟件ExPASy （https：//web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam）預測OCPI2蛋白分子量、理論等電點等理化特性，分別使用SignalP 5.0 （http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）預測OCPI2蛋白的信號肽和TMHMM Server 2.0 （http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）預測OCPI2蛋白的跨膜結構，以及使用Conserved Domain Search Service（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）對OCPI2蛋白進行結構域預測。

1.6 同源序列比對和系統發育分析

利用NCBI數據庫Blastp工具獲取其他禾本科植物同源基因氨基酸序列，分別使用Jalview和MEGA 11軟件進行同源序列比對和系統發育樹構建，系統發育樹構建采用鄰接法（Neighbor-Joining， NJ），Bootstrap值設置為1 000次。

1.7 實時熒光定量PCR

利用CFX96型實時熒光定量PCR儀（美國伯樂公司）檢測OCPI2在不同處理下的表達。采用Primer 5軟件設計OCPI2基因特異性定量引物，引物序列見表1，送至生工生物工程（上海）股份有限公司合成。參照2X M5 HiPer SYBR Premix Es Taq（聚合美）說明書，選擇10 μL的PCR反應體系，包括5 μL的SYBR，2 μL的cDNA模板，0.4 μL的引物（混合）和2.6 μL的ddH2O。實時熒光定量PCR擴增程序：95 ℃預變性60 s；95 ℃變性10 s，60 ℃退火60 s，40個循環。以水稻18S ribosomal RNA （Os18s， AK059783）基因作為內參，目標基因相對表達量采用2-△△Ct法進行計算。

1.8 數據處理與分析

采用Student t檢驗（Student’s t-test）分析OCPI2在害蟲為害、機械損傷以及激素處理響應下的表達量。所有數據均采用SPSS 22.0軟件進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 水稻OCPI2基因的克隆與分析

以二化螟幼蟲為害24 h的‘ZH11’水稻莖稈cDNA為模板，利用OCPI2基因特異性引物進行PCR擴增。將得到的PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果顯示在300～400 bp處出現擴增條帶（圖1）。

將純化的PCR產物連接至pMD18-T載體，并轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，挑取陽性克隆進行測序。測序結果表明，PCR擴增序列長度為342 bp，其中包含OCPI2基因的完整CDS序列，長度為219 bp。與RGAP數據庫中‘日本晴’的OCPI2基因（LOC_Os01g42860）CDS序列進行比對分析，結果表明‘ZH11’與‘日本晴’OCPI2基因的CDS序列完全一致（圖2）。

利用ProtParam對OCPI2基因編碼氨基酸序列進行分析，發現OCPI2基因編碼72個氨基酸，預測蛋白分子量為7.72 kDa，理論等電點為5.21。通過SignalP 5.0預測分析OCPI2氨基酸序列，發現不含有信號肽（圖3：A），說明OCPI2可能為非分泌型蛋白；運用在線軟件TMHMM Server 2.0對OCPI2編碼蛋白的跨膜結構進行預測分析，結果顯示該蛋白不存在跨膜結構（圖3：B）。利用NCBI網站保守結構域分析工具對OCPI2基因編碼氨基酸進行保守結構域分析，發現其具有一個potato_inhibit保守結構域（圖3：C），通過查詢保守結構域數據庫和相關文獻發現該基因屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑家族成員（Volpicella et al.， 2011; Wang et al.， 2023）。

2.2 OCPI2的同源性及系統發育分析

為了探究OCPI2蛋白的進化關系，將8種禾本科植物CPI蛋白與OCPI2蛋白進行同源性分析及系統發育樹構建，包括柳枝稷（Panicum virgatum， XP_039836276.1）、硬直黑麥草（Lolium rigidum， XP_047070641.1）、二粒小麥（Triticum dicoccoides， XP_037471069.1）、烏拉爾圖小麥（T. urartu， EMS61613.1）、非洲栽培稻（Oryza glaberrima， XP_052139272.1）、黑麥草（Lolium perenne， XP_051224251.1）、玉米（Zea mays， NP_001232814.2）、南荻（Miscanthus lutarioriparius， CAD6334936.1），利用Jalview和MEGA 11軟件作圖。結果表明，在9個物種中均含有一個potato_inhibit保守結構域且CPI蛋白在不同物種之間同源性較高（圖4：A）；系統發育分析結果顯示，OCPI2蛋白與烏拉爾圖小麥、硬直黑麥草、二粒小麥和黑麥草的同源蛋白親緣關系較近，與玉米、非洲栽培稻、柳枝稷和南荻的親緣關系相對較遠（圖4：B）。

2.3 OCPI2基因受蟲害誘導的表達分析

為探究植食性昆蟲為害對OCPI2表達的影響，通過實時熒光定量PCR技術分析OCPI2受二化螟和褐飛虱取食為害誘導情況。單頭3齡二化螟幼蟲為害水稻后的24 h內，OCPI2的表達量在2 h和8 h有兩個高峰期，與對照均存在顯著差異，分別是對照的3.1倍和3.8倍（圖5：A）。在蟲害48 h后，OCPI2表達顯著升高，是對照的30.6倍。15頭4齡褐飛虱若蟲為害時，OCPI2的表達量在1 h時迅速升高并達到峰值，是對照的6.7倍，之后表達量開始下降，在8 h時表達量下降到正常水平，持續為害的表達量會繼續呈現出先升高再下降的表達趨勢，除8 h外，在蟲害后其余時間點OCPI2表達量與對照組均存在顯著性差異（圖5：B）。上述結果表明，二化螟和褐飛虱為害均能誘導水稻OCPI2的表達，但二者誘導表達趨勢并不相同，推測OCPI2可能參與水稻對二化螟和褐飛虱的抗性。

2.4 OCPI2基因受機械損傷處理的表達分析

機械損傷處理水稻后，OCPI2的表達量在處理后1 h時顯著增加，為對照的29.1倍；處理后2 h開始降低并在4 h恢復到正常水平，之后呈現出先升高再降低再升高的小范圍表達量波動（圖6）。

2.5 OCPI2基因受外源植物激素處理的表達分析

經水楊酸甲酯處理后，OCPI2表達量在1 h內顯著升高，達到對照組的12.6倍，2 h時恢復到正常水平，之后表達量與對照相比沒有顯著差異（圖7：A）。而經茉莉酸甲酯處理后，OCPI2在1 h時與對照組相比呈現出下調的趨勢，2 h時呈現出極顯著的下調趨勢，之后與對照組相比一直呈現下調趨勢，直至12 h時恢復到與對照相似的表達水平，之后表達量在24 h又呈現顯著性下降直至48 h時也未恢復至正常水平（圖7：B）。這些結果表明，外源水楊酸甲酯可以誘導OCPI2表達，而外源茉莉酸甲酯處理則抑制水稻OCPI2表達。

3 討論與結論

蛋白酶抑制劑是植物體內重要的防御蛋白，當植物受到植食性昆蟲為害時，會迅速合成蛋白酶抑制劑，以抵御昆蟲取食（Volpicella et al.， 2011）。利用基因工程技術，將編碼蛋白酶抑制劑基因導入農作物中，培育出具有抗蟲效果的轉基因作物，可以有效控制農田害蟲的發生。水稻是重要的糧食作物，常遭受二化螟和褐飛虱等多種害蟲為害。因此，研究水稻蛋白酶抑制劑基因及其介導的抗蟲機理對水稻生產具有重要意義。

本研究成功從水稻中克隆并獲得OCPI2基因cDNA序列，序列分析表明該基因編碼區全長為219 bp，編碼72個氨基酸，含有1個potato_inhibit結構域，屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑家族成員。眾多研究表明，植物絲氨酸蛋白酶抑制劑主要通過調節絲氨酸蛋白酶活性進而調節植物抗蟲反應。如大豆絲氨酸蛋白酶抑制劑（Bowman-Birk Inhibitor， SBBI）可延遲瓜實蠅（Bactrocera cucurbitae）的生長發育（Kaur et al.， 2017），取食光海紅豆（Adenanthera pavonine）的胰蛋白酶抑制劑（Adenanthera pavonina trypsin inhibitor， ApTI）會導致大豆夜蛾（Anticarsia gemmatalis）幼蟲死亡率升高（Merio et al.， 2020）。因此，推測OCPI2在水稻的抗蟲防御反應中發揮重要作用。

誘導表達特征的結果顯示，二化螟和褐飛虱取食以及機械損傷均能誘導OCPI2基因的表達。其中，機械損傷處理的響應模式與刺吸式口器昆蟲褐飛虱為害的響應模式較為類似，但機械損傷造成的響應更加強烈。本研究機械損傷是采用昆蟲針刺傷進行樣品處理，其造成的傷口與褐飛虱取食所造成的傷口類似，但機械損傷造成的傷害更為嚴重且密集，因此OCPI2對其響應更為強烈。同樣的，Singh等（2009）報道機械損傷誘導OCPI2表達，同時還發現脫落酸、低溫和鹽脅迫均可誘導該基因表達。然而，對其他水稻蛋白酶抑制劑基因誘導表達模式研究發現，OsLTPL164和OsLTPL151在二化螟取食和機械損傷處理不同時間后，兩個基因均呈現表達水平先上升后下降再上升的趨勢，但二化螟取食3 h后便可誘導OsLTPL164和OsLTPL151上調表達，而在機械損傷6 h后才被顯著誘導表達（何雨娟等， 2018）。咀嚼式口器昆蟲二化螟為害誘導后OCPI2的最高響應強度雖高于褐飛虱誘導處理，但其響應速度和響應時間沒有褐飛虱誘導處理迅速和持久。類似的，舞毒蛾（Lymantria dispar）和燈蛾（Amata mogadorensis）幼蟲及柳弗葉甲（Phratora vulgatissima）成蟲為害誘導黑楊（Populus nigra） Kunitz型胰蛋白抑制劑基因同樣呈現不同的表達模式，其中舞毒蛾和燈蛾幼蟲取食誘導表達模式相似，而柳弗葉甲成蟲則誘導蛋白酶抑制劑基因表達更強烈（Eberl et al.， 2021）。這些結果表明，不同植食性昆蟲為害誘導蛋白酶抑制劑基因呈現不同的表達特征，并且昆蟲取食與機械損傷誘導OCPI2基因的表達也存在明顯不同。昆蟲取食過程中不僅對植株造成機械損傷，還會分泌唾液。唾液中含有的激發子或效應子也會誘導植物產生不同的防御反應（Jones et al.， 2022; 劉清松等，2023）。

茉莉酸（jasmonic acid， JA）和水楊酸（salicylic acid， SA）作為重要的內源激素，調控植物對多種植食性昆蟲防御反應（Erb amp; Reymond， 2019；Liu et al.， 2021）。例如，JA途徑正調控水稻對二化螟和褐飛虱的抗性（Xu et al.， 2021）；SA途徑也參與調控水稻對褐飛虱的抗性（Guo et al.， 2018）；在水稻中，研究報道外源JA誘導胰蛋白酶抑制劑基因合成和蛋白酶抑制劑的積累（Farmer et al.， 1992）。然而本研究結果表明，水楊酸甲酯處理可在短時間內迅速誘導OCPI2表達，而茉莉酸甲酯處理則持續抑制OCPI2表達。這表明JA和SA拮抗調控OCPI2表達，與前人結果一致，即JA和SA信號途徑存在相互拮抗作用，JA途徑抑制SA途徑介導的防御反應，反之亦然。例如，在擬南芥中同時采用SA和JA處理，發現SA可以拮抗JA的生物合成和信號傳導（de Vleesschauwer et al.， 2014）。盡管如此，但有一些研究發現JA和SA信號通路可以協同調控植物對植食性昆蟲抗性（Liu et al.， 2021）。因此，在調控水稻的抗蟲反應中，JA和SA并非獨立作用于植物，二者間的相互拮抗作用或協同作用更能有效抵御植食性昆蟲取食。然而，其他植物激素是否作用于OCPI2仍有待研究。

綜上所述，本研究成功克隆水稻絲氨酸蛋白酶抑制劑基因OCPI2的全部編碼區序列，采用生物信息學技術分析了其編碼酶的理化特性及其進化關系，并分析了植食性昆蟲取食為害、機械損傷和激素處理對其轉錄水平的影響。本研究結果表明，OCPI2參與水稻誘導抗蟲防御反應，但具體作用機制還有待進一步研究。

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（責任編輯 周翠鳴）

基金項目：" 國家自然科學基金（31901896）； 河南省科技攻關項目（222102110116）； 中國科協青年人才托舉工程（2023QNRC001）。

第一作者： 許金港（1998—），碩士研究生，研究方向為植物與昆蟲的相互作用，（E-mail）xjg157164@[KG-0.5mm]163.com。