木薯糖轉運蛋白基因MeSWEET17b的克隆及表達分析

摘 要：" 木薯 （Manihot esculenta） 是熱帶亞熱帶地區重要的糧食作物。糖轉運蛋白SWEETs能夠促進糖在細胞間的流動，在植物生長發育過程中起著重要作用。為明確 SWEET 家族基因在木薯生長發育過程中的功能，該研究以木薯‘KU50’為實驗材料，采用基因克隆、生物信息學分析、亞細胞定位、體外酵母檢測及RT-qPCR等方法研究木薯MeSWEET17b的基因特性。結果表明： （1） MeSWEET17b基因開放閱讀框為726 bp，編碼242個氨基酸，定位于細胞膜；MeSWEET17b蛋白與AtSWEET16、AtSWEET17 親緣關系較近，含有7個跨膜結構域，屬于疏水性蛋白。（2） 體外酵母檢測表明MeSWEET17b主要轉運果糖。（3） RT-qPCR結果表明，MeSWEET17b在葉柄和莖桿中表達趨勢基本一致，成熟期相對表達量最高，在葉片中相對表達量較低，在塊根膨大期相對表達量最高，隨著塊根生長發育，相對表達量急速下降。（4） 對‘KU50’水培苗進行高鹽（8 g·L-1 NaCl）、干旱（100 mmol·L-1甘露醇）、氧化（10% H2O2）和低溫（15 ℃ 24 h，后降至4 ℃ 24 h）等非生物脅迫處理。RT-qPCR結果顯示，干旱脅迫下，MeSWEET17b在葉片和莖桿中的相對表達量變化差異最大；鹽脅迫下，MeSWEET17b在葉片和須根中的相對表達量變化最顯著；氧化和低溫脅迫下，MeSWEET17b在須根中和葉柄中的相對表達量隨著處理時間的延長呈極顯著上升趨勢。該研究為進一步研究糖轉運蛋白SWEETs在木薯中的作用機制提供依據。

關鍵詞： 木薯， 糖轉運蛋白， 亞細胞定位， 糖轉運能力， 非生物脅迫

中圖分類號：" Q943" 文獻標識碼：" A

Cloning and expression analysis of sugar transporter protein gene MeSWEET17b in cassava

XUE Jingjing1，2， WEI Zhuowen1， LUO Xiuqin1， AN Feifei1，2*

（ 1. Tropical Crops Genetic Resources Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences / Key Laboratory of Conservation and Utilization for Cassava Germplasm Resources， Haikou 571101， China; 2. Sanya Research Institute of Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Sanya" 572025， Hainan， China ）

Abstract：" Cassava （Manihot esculenta） is an important food crop in tropical and subtropical regions. Sugar transporter protein SWEETs facilitate the flow of sugar between cells and play an important role in plant growth and development. In order to clarify the function of SWEET family genes in cassava， cassava‘KU50’ was used as material in this study， and the gene properties of MeSWEET17b were studied by gene cloning， bioinformatics analysis， subcellular localization， in vitro yeast detection and RT-qPCR， etc. The results were as follows： （1） The open reading frame of MeSWEET17b was 726 bp， encoding 242 amino acids， and located in the plasma membrane. MeSWEET17b had the closer genetic relationship with AtSWEET16 and AtSWEET17， containing 7 transmembrane domains， and belonging to hydrophobic protein. （2） MeSWEET17b mainly transport fructose through the in vitro yeast detection. （3） The results of RT-qPCR showed that the expression trend of MeSWEET17b in stem was basically consistent with in petiole， and the expression was the highest at maturity. The relative expression of MeSWEET17b was relatively low in leaves， and the highest in the expansion stage of tuberous root， while decreased rapidly with the growth of tuberous roots. （4） The ‘KU50’ seedlings were subjected to abiotic stress treatments such as high salt （8 g·L-1 NaCl）， drought （100 mmol·L-1 mannitol）， oxidation （10% H2O2） and cold （15 ℃ for 24 h， then dropped to 4 ℃ for 24 h）. RT-qPCR showed that the relative expressions of MeSWEET17b in leaf and stem had the greatest difference under drought stress. The relative expressions of MeSWEET17b in leaf and fibrous root changed most significantly under salt stress; under oxidation and cold stress， the relative expressions of MeSWEET17b in fibrous root and petiole increased significantly with the extention of treating" time. This study provides a theoreticac reference for further studying the function mechanism of sugar transporter protein SWEETs in cassava.

Key words： cassava （Manihot esculenta）， sugar transporter protein， subcellular localization， sugar transport capacity， abiotic stress

糖是真核生物和原核生物重要的能量來源。糖轉運蛋白SWEETs是真核生物和原核生物中主要的轉運蛋白，能夠促進糖在細胞間的流動。SWEET家族基因及其同源物廣泛分布于包含細菌和古生菌的幾乎所有生命領域 （Chen et al.， 2015）。所有真核生物的SWEETs都是由7個預測的跨膜 （7TM） 結構域組成，其中3TM重復序列由連接螺旋連接起來。整個結構以3+1+3的拓撲結構排列在細胞膜上 （Chen et al.， 2010）。植物中，SWEETs主要定位于細胞質膜上，存在于不同細胞器官，如內質網、高爾基體和液泡 （Feng amp; Frommer， 2015）。定位于質膜上的SWEET轉運蛋白可以將胞液中的糖轉運到質外體，行使不同的功能，如花蜜分泌 （Lin et al.， 2014）、質外體韌皮部裝載 （Chen et al.， 2015）、種子灌漿 （Guan et al.， 2008）、花粉營養 （Sun et al.， 2013）、病原體感染 （Chen et al.， 2010）以及非生物脅迫 （Wu et al.， 2023） 等。

木薯（Manihot esculenta）塊根富含淀粉，是世界三大薯類作物之一，也是熱帶亞熱帶地區重要的糧食作物，全世界約有10億人以木薯作為主要糧食（Cai et al.， 2023）。木薯以蔗糖為主要運輸物質。木薯光合產物的分配是糖通過韌皮部維管系統從氣生葉向地下貯藏根的長距離運輸過程。[JP3]SWEET蛋白屬于MtN3/saliva gene family，也稱為MtN3/saliva/SWEET，可以轉運己糖和蔗糖，并介導糖外流到質外體。木薯SWEET家族共有28個同源基因，根據其轉運不同糖的特性，可以分為4個亞類。其中，對MeSWEET10a的研究最為深入。Zárate-Chaves等（2021）研究顯示，地毯黃單胞菌的毒力可以通過轉錄激活因子TAL20特異性誘導木薯MeSWEET10a的表達，增加糖的積累并最終導致木薯細菌性枯萎病的蔓延。此外，MeSWEET1、MeSWEET3b、MeSWEET15a、MeSWEET15b及MeSWEET18也有報道。其中，木薯MeSWEET1基因定位于細胞膜上，在成熟葉片的表達量最高 （劉秦等，2017）；木薯MeSWEET3b主要轉運半乳糖，黃單胞菌Xam 能夠誘導其表達（朱柏光等，2022）；木薯MeSWEET15a及MeSWEET15b基因可以轉運蔗糖、葡萄糖、果糖和甘露糖，VIGS沉默能夠增強木薯對干旱脅迫和鹽脅迫的耐受性（Fan et al.， 2023）；木薯MeSWEET18主要轉運果糖，VIGS沉默會導致其葉片中果糖含量的增加 （薛晶晶等， 2022， 2023）；GWAS分析發現MeSWEET18與木薯塊根干物質含量緊密相關，該基因主要在木薯塊根中發揮作用（Rabbi et al.， 2022）。前人對木薯糖轉運蛋白SWEET家族基因的研究多集中在基因克隆，糖轉運特性分析及非生物脅迫的表達特性等，其調控木薯塊根淀粉含量、干物率的作用機制還未深入研究。本研究前期研究發現，木薯糖轉運蛋白MeSWEET17b與MeSWEET18親緣關系最近，但其功能尚未報道。因此，本研究以木薯‘KU50’為研究材料，通過克隆、亞細胞定位、糖轉運特性分析以及非生物脅迫等方法，探究木薯MeSWEET17b的蛋白質性質、糖轉運特性以及非生物脅迫下的表達變化。擬探討與MeSWEET18親緣關系最近的MeSWEET17b在木薯中的表達情況，從而為糖轉運蛋白SWEETs在木薯中的功能研究提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究采用生長于中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所國家木薯種質資源圃的‘KU50’種質作為研究材料，分別取‘KU50’形成期（植后4個月）、膨大期（植后7個月）及成熟期（植后10個月）葉片、葉柄、莖桿和塊根。非生物脅迫主要是將生長20 d的‘KU50’水培苗，分別放入含有8 g·L-1 NaCl、100 mmol·L-1甘露醇及10% H2O2的溶液中進行鹽、干旱和氧化處理，各處理時間分別為0 h （對照，CK）、12 h、24 h和36 h。低溫處理則將水培苗直接放入植物光照培養箱采用15 ℃ 24 h，后降至4 ℃ 24 h進行處理。采集的樣本立即在液氮中冷凍并儲存 -80 ℃冰箱，每個樣本重復3次。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取與cDNA合成 總RNA的提取參照RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（Tiangen）的操作說明進行。cDNA第一鏈的合成參照RevertAid RT逆轉錄試劑盒（Thermo）的操作說明進行。

1.2.2 MeSWEET17b 基因全長cDNA擴增 以Phytozome 12.0中Manihot esculenta v7.1數據庫的MeSWEET17b序列設計引物（表1），以‘KU50’的cDNA為模板進行序列克隆。全長cDNA的擴增體系含PrimeSTAR Max Premix（2×） 25 μL、MeSWEET17b-F （10 μmol·L-1） 2.5 μL、MeSWEET17b-R （10 μmol·L-1） 2.5 μL、cDNA模板0.5 μL、滅菌水補足50 μL。擴增程序：95 ℃預變性5 min; 95 ℃ 30 s、56 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min，共34個循環；72 ℃延伸10 min。0.8%的瓊脂糖凝膠電泳分離PCR擴增產物，回收純化目的條帶，克隆至pEASY-Blunt Simple Cloning Vector載體上測序。

1.2.3 生物信息學分析 利用NCBI網站ORF Finder軟件對獲得的KU50 cDNA序列進行開放閱讀框（open reading frame，ORF）預測，同時翻譯成蛋白序列；ProtParam軟件分析該蛋白的分子量與等電點；NCBI在線軟件CDD分析蛋白的保守結構域；TMHMM Server v.2.0在線軟件進行跨膜結構域分析；ProtScale在線軟件預測該氨基酸序列的疏水性／親水性；SOPMA SECONDARY STRUCTURE PREDICTION METHOD在線軟件預測蛋白的二級結構。從擬南芥TAIR 數據庫下載所有SWEET的蛋白序列，利用MEGA 5.0軟件，選擇鄰接模型（neighbour-joining，NJ），并進行1 000次Bootstrap統計學檢驗，構建包括MeSWEET17b蛋白序列在內的木薯和擬南芥SWEET蛋白的系統進化樹。利用DNAMAN軟件比對MeSWEET17b與AtSWEET16、 AtSWEET17的序列同源性。

1.2.4 MeSWEET17b亞細胞定位 使用含有pCAMBIA1302表達載體同源序列的引物（表1）擴增MeSWEET17b不含終止密碼子的CDS序列，利用重組克隆試劑盒ClonExpress Ⅱ One Step Cloning （Vazyme） 將 MeSWEET17b亞克隆至 pCAMBIA1302-GFP 空載體上，構建亞細胞定位載體 35S∷MeSWEET17b-GFP，以35S∷GFP 作為對照。將重組質粒轉化農桿菌感受態細胞 GV3101，挑取單菌落用YEP液體培養基（含50 μg·mL-1 Kana，25 μg·mL-1 Rif），28 ℃ 220 r·min-1進行活化后擴大培養直至菌液OD600在0.8～1.0間。將菌液置于離心機中，5 000 r·min-1離心10 min后收集菌體沉淀。用15 mL侵染液（10 mmol·L-1 MgCl2、10 mmol·L-1 MES pH 5.8、100 μmol·L-1 AS）洗滌菌體，重復洗滌一次。用侵染液重懸菌體，調OD600約為0.8，黑暗靜置活化2～3 h，侵染煙草葉片，25 ℃黑暗培養48～72 h，通過熒光共聚焦激光掃描顯微鏡觀察，拍照。

1.2.5 實時熒光定量PCR分析 采用Thermo公司的CFX實時熒光定量PCR系統，實驗操作按儀器使用說明書進行。將cDNA稀釋10倍作為RT-qPCR分析的模板。10 μL反應體系包含1 μL模板、5 μL 2×SYBR Green qPCR Mix、0.8 μL 10 μmol·L-1 MeSWEET17b-qPCR引物、滅菌水補足10 μL。PCR反應程序：95 ℃預變性30 s，95 ℃ 10 s、60 ℃ 20 s共40個循環，循環完成后進行產物熔解曲線分析。以MeActin作為內參基因，以2-△△Ct算法進行基因的相對定量表達分析。

1.2.6 MeSWEET17b的糖轉運特性分析 EBY.VW4000酵母是一種己糖轉運功能缺陷型酵母突變體，此菌株無法在己糖為唯一碳源的尿嘧啶（ura）缺陷型選擇培養基SD-ura平板上生長，可以在麥芽糖為唯一碳源的選擇培養基SD-ura平板上恢復生長。將MeSWEET17b的CDS序列構建到酵母功能穿梭載體 pDR196（表1）上，使用YeastmakerTM Yeast Transformation System 2 kit 酵母轉化試劑盒（Clontech）的聚乙二醇/醋酸鋰高效酵母轉化法將重組后的MeSWEET17b-pDR196質粒轉化到EBY.VW4000酵母菌中。在選擇培養基SD-ura + 2%麥芽糖平板上劃線培養，倒置于 30 ℃培養箱中培養 3～5 d。挑單菌落放入SD-ura + 2%麥芽糖液體培養基中過夜搖菌 （30 ℃，220 r·min-1）。待 OD600 為 1 左右時，停止搖菌。取 1 mL 菌液加入 1.5 mL 無菌離心管中，室溫下，高速離心15 s，收集菌體，棄上清。加入 1 mL 無菌超純水，重懸菌體，再次高速離心 15 s，收集菌體，棄上清。如此清洗重懸2～3次菌體，盡量降低液體培養基的影響。取4 μL菌液為×1倍，依次稀釋×10倍、×100倍、×1 000 倍和×10 000 倍，均勻點涂到施加不同唯一碳源的SD-ura 選擇培養基上 （SD-ura + 2%麥芽糖、SD-ura + 2%葡萄糖、SD-ura + 2%果糖、SD-ura + 2%蔗糖），倒置30 ℃培養箱培養 3～5 d，觀察生長情況。

1.2.7 分析方法及數據處理 采用Excel 2021分析數據，GraphPad Prism 5.0軟件作圖以及Dunnetts 檢驗。

2 結果與分析

2.1" MeSWEET17b基因全長CDS克隆及蛋白質結構特性分析

通過RT-PCR擴增及測序，獲得MeSWEET17b 基因編碼框序列726 bp， 編碼242個氨基酸 （圖1： A） ，蛋白分子質量為26.32 kDa，理論等電點為7.72，不穩定系數為40.54，屬于不穩定類蛋白。通過NCBI 在線軟件CDD 分析發現，該蛋白N端含有MtN3_slv蛋白結構域，含有2個PQ-loop superfamily。TMHMM Server v.2.0在線軟件預測顯示，該蛋白含有7個跨膜結構域，是典型的膜蛋白（圖1： B）；ProtScale預測表明，MeSWEET17b蛋白屬于疏水性蛋白 （圖1： C）；SOPMA分析顯示，MeSWEET17b蛋白二級結構由49.79%α-螺旋、27.39% 延伸鏈、4.56%β-轉角和18.26%無規則卷曲組成。

2.2 MeSWEET17b 的系統進化樹分析及氨基酸序列比對

對木薯糖轉運蛋白SWEETs和擬南芥SWEET蛋白進行系統進化樹分析，發現MeSWEET17b與擬南芥AtSWEET16和AtSWEET17位于同一進化枝上，屬于第四亞類（Clade Ⅳ）（圖2： A）。采用DNAMAN軟件對MeSWEET17b、AtSWEET16和AtSWEET17氨基酸序列進行比對，結果顯示MeSWEET17b和AtSWEET16的同源性達到51.24%，MeSWEET17b和AtSWEET17的同源性達到53.72%，含有兩個明顯的PQ-loop superfamily結構（圖2： B）。

2.3 MeSWEET17b 的亞細胞定位

將35S∷GFP和35S∷MeSWEET17b-GFP重組質粒轉化農桿菌感受態細胞GV3101，并侵染煙草葉片，在熒光共聚焦顯微鏡下觀察其在煙草中的表達情況，結果顯示35S∷GFP在細胞膜和細胞核中均能觀察到熒光信號，而 35S∷MeSWEET17b-GFP只在細胞膜上存在熒光信號，推測 MeSWEET17b定位于細胞膜（圖3）。

2.4 MeSWEET17b 的糖轉運特性

為驗證 MeSWEET17b 的糖轉運特性，將pDR196和重組后的MeSWEET17b-pDR196質粒轉化至以麥芽糖作為唯一碳源的己糖轉運缺陷型酵母 EBY.VW4000 中。將含有pDR196 和MeSWEET17b-pDR196的轉化酵母按照1、10-1、10-2、10-3、10-4稀釋，分別點涂于含有2%麥芽糖（對照）、2%葡萄糖、2%果糖及2%蔗糖等不同碳源的選擇培養基SD-ura平板上，30 ℃，倒置培養3～5 d，觀察生長情況。由圖4可知， pDR196和MeSWEET17b-pDR196均能在2%麥芽糖為唯一碳源的SD-ura平板上生長；同時，MeSWEET17b-pDR196也能在2%果糖為唯一碳源的SD-ura平板上生長，推測MeSWEET17b主要轉運果糖。

2.5 MeSWEET17b 在木薯不同器官不同發育時期的表達

分別取‘KU50’形成期、膨大期及成熟期葉片、葉柄、莖桿和塊根材料，提取總RNA后，進行RT-qPCR分析。由圖5可知：MeSWEET17b在木薯葉片中的相對表達量較低，在成熟期時降到最低；在葉柄中的相對表達量隨著木薯的生長持續上升，在成熟期時達到最大；在膨大期和形成期時的莖桿中相對表達量無差異，在成熟期時呈顯著上升趨勢；在木薯塊根膨大期時的相對表達量為最高，隨著塊根生長，相對表達量低于形成期。

2.6" MeSWEET17b在非生物脅迫下的表達分析

將‘KU50’莖桿水培培養20 d后，進行干旱、鹽、氧化以及低溫脅迫，干旱、鹽和氧化脅迫處理時間分別為0 h、12 h、24 h、36 h，低溫脅迫采用15 ℃ 24 h，后降至4 ℃ 24 h的處理方式。采集每個時間點的葉片、葉柄、莖桿和須根進行RT-qPCR表達分析。RT-qPCR分析結果（圖6）顯示，干旱脅迫和鹽脅迫下，隨著處理時間的延長，MeSWEET17b的相對表達量呈先上升后下降的趨勢；當干旱脅迫24 h時，MeSWEET17b在葉片、莖桿和須根的相對表達量達到最高，與0 h相比，葉片和莖桿在處理24 h時相對表達量分別提高了11.17倍和20.95倍；鹽脅迫12 h時，MeSWEET17b在葉片和莖桿中的表達較對照分別提高了42.46倍和3.62倍；氧化脅迫下，MeSWEET17b在須根中的相對表達量最高，24 h時較對照提高了1 876倍且葉片和須根中的相對表達量均呈先上升后下降的趨勢，而葉柄和莖桿的相對表達量則呈先下降再上升的趨勢，至36 h達到最大值；低溫（15 ℃）處理24 h，MeSWEET17b在葉柄、莖桿和須根中的相對表達量呈上升趨勢，低溫（4 ℃）處理24 h后，葉柄和須根中的相對表達量進一步上調，但其在葉片中的相對表達量則呈先下降再上升的趨勢。

3 討論與結論

糖在植物的生理代謝、生長發育等方面具有重要作用，不僅是植物生長和細胞新陳代謝的能量來源，也是細胞的重要信號分子 （Liu et al.， 2019）；而糖轉運蛋白SWEET基因能夠調控細胞內外以及器官間的糖含量，影響植物的源庫關系 （Yin et al.， 2009），進而協調植物生長發育及環境響應 （Yu et al.， 2012）。以木薯‘KU50’葉片cDNA為模板，擴增MeSWEET17b的CDS序列，與Manihot esculenta v7.1數據庫中AM560的序列進行比對，結果發現無堿基差異，表明MeSWEET17b在木薯中高度保守。利用RT-qPCR分析MeSWEET17b在‘KU50’不同發育期的葉片、葉柄、莖桿和塊根的表達情況，發現MeSWEET17b在葉柄中高表達，其成熟期的相對表達量達到最大，在葉片、莖桿和塊根中的相對表達量均較低。與木薯栽培種‘TME204’不同組織/器官中的轉錄組結果一致 （Wilson et al.， 2017）。體外酵母檢測發現MeSWEET17b主要轉運果糖，推測木薯MeSWEET17b主要負責將葉柄中聚集的果糖進行外排，在木薯的‘流’器官中發揮作用。煙草瞬時表達顯示MeSWEET17b主要定位于細胞膜，是典型的膜蛋白，與MeSWEET1（劉秦等，2017），以及MeSWEET15a和MeSWEET15b（Fan et al.， 2023）的研究結果一致。

系統進化樹分析表明，MeSWEET17b 位于Clade Ⅳ，與擬南芥 AtSWEET16 和 AtSWEET17 屬于同一進化分支。MeSWEET17b與木薯MeSWEET18親緣關系最近，氨基酸序列同源性達到82.79%。木薯MeSWEET18主要轉運果糖，VIGS沉默MeSWEET18后，其沉默株系葉片的果糖含量增多 （薛晶晶等，2022，2023）。擬南芥AtSWEET17在葉片的果糖分配上發揮著重要作用，并且AtSWEET17 沉默株系表現為果糖積累功能紊亂、植株發育不良等（Chardon et al.， 2013）。對MeSWEET17b的糖轉運特性進行分析，發現其主要轉運果糖，與MeSWEET18和 AtSWEET17 主要影響果糖積累的研究結果一致。

前人已有較多研究表明，SWEET家族基因在非生物脅迫下的表達情況。例如，蘋果糖轉運蛋白基因MdSWEET17轉化番茄后，能夠增強番茄對干旱的耐受性，同時積累更多的果糖 （Lu et al.， 2019）；過表達擬南芥AtSWEET17和AtSWEET16會導致冷脅迫下葉片液泡中果糖積累減少 （Chardon et al.， 2013）；定位于液泡膜上的果糖特異性轉運蛋白SWEET17能夠影響干旱條件下擬南芥側根的生長（Valifard et al.， 2021）；茶樹CsSWEET16基因參與糖在液泡膜上的分配，能夠影響擬南芥低溫脅迫下的耐受性（Wang et al.， 2018）；百合LoSWEET14基因在干旱、低溫、鹽等非生物脅迫及脫落酸處理下的表達顯著增加， LoSWEET14基因過表達煙草株系顯著增強了對干旱和低溫等非生物脅迫及脫落酸的敏感性，但其與擬南芥AtSWEET10 親緣關系最近，主要轉運蔗糖（Zeng et al.， 2022）。本研究對木薯‘KU50’水培苗進行鹽、干旱、氧化和低溫處理，對處理不同時間的葉片、葉柄、莖桿和須根等器官進行RT-qPCR分析，結果發現：非生物脅迫下，MeSWEET17b 在葉片、葉柄、莖桿和須根等器官的相對表達量隨著處理時間的延長呈顯著性變化；干旱脅迫下，MeSWEET17b在葉片和莖桿中的相對表達量變化差異最大；鹽脅迫下，MeSWEET17b在葉片和須根中的相對表達量變化最為顯著；氧化和低溫脅迫下，MeSWEET17b在須根中的相對表達量呈現飛躍式上升，在葉柄中的相對表達量隨著處理時間的延長呈極顯著上升趨勢。MeSWEET17b在葉柄中相對表達量最高，可能主要作用于葉柄的糖轉運。因此，推測木薯MeSWEET17b可能主要在氧化脅迫和低溫脅迫下起作用。

因此，基于以上研究結果，在后續研究中，將利用木薯原生質體對MeSWEET17b進行亞細胞定位，明確其定位的具體細胞類型。分析MeSWEET17b啟動子序列中與非生物脅迫、糖信號等相關的順式作用元件，構建pMeSWEET17b∷GUS載體轉化木薯，采用組織化學染色法對轉基因植株中GUS基因的表達情況進行分析。對獲得的MeSWEET17b過表達株系及Crispr Cas9基因編輯株系的葉片、葉柄、莖桿及塊根的糖含量進行測定，并分析MeSWEET17b以及糖代謝相關基因的表達趨勢；同時，選擇差異倍數明顯的株系進行轉錄組分析及非生物脅迫研究，篩選調控MeSWEET17b的轉錄因子，深入研究木薯MeSWEET17b的基因功能，為進一步研究糖轉運蛋白SWEETs在木薯中的功能提供理論依據。

參考文獻：

CAI J， XUE JJ， ZHU WL， et al.， 2023. Integrated metabolomic and transcriptomic analyses reveals sugar transport and starch accumulation in two specific germplasms of Manihot esculenta Crantz" ［J］. Int J Mol Sci， 24（8）： 7236-7249.

CHARDON F， BEDU M， CALENGE F， et al.， 2013. Leaf fructose content is controlled by the vacuolar transporter SWEET17 in Arabidopsis" ［J］. Curr Biol， 23（8）： 697-702.

CHEN HY， HUH JH， YU YC， et al.， 2015. The Arabidopsis vacuolar sugar transporter SWEET2 limits carbon sequestration from roots and restricts Pythium infection" ［J］. Plant J， 83 （6）： 1046-1058.

CHEN LQ， HOU BH， LALONDE S， et al.， 2010. Sugar transporters for intercellular exchange and nutrition of pathogens" ［J］. Nature， 468 （7323）： 527-532.

FAN XW， SUN JL， CAI Z， et al.， 2023. MeSWEET15a/b genes play a role in the resistance of cassava （Manihot esculenta Crantz） to water and salt stress by modulating sugar distribution" ［J］. Plant Physiol Biochem， 194： 394-405.

FENG L， FROMMER WB， 2015. Structure and function of SemiSWEET and SWEET sugar transporters" ［J］. Trends Biochem Sci， 40（8）： 480-486.

GUAN YF， HUANG XY， ZHU J， et al.， 2008. RUPTURED POLLEN GRAIN1， a member of the MtN3/saliva gene family， is crucial for exine pattern formation and cell integrity of microspores in Arabidopsis" ［J］. Plant Physiol， 147（2）： 852-863.

LIN W， SOSSO D， CHEN LQ， et al.， 2014. Nectar secretion requires sucrose phosphate synthases and the sugar transporter SWEET9" ［J］. Nature， 508 （7497）： 546-561.

LIU HT， LYU WY， TIAN SH， et al.， 2019. The sweet family genes in strawberry： Identification and expression profiling during fruit development" ［J］. S Afr J Bot， 125： 176-187.

LIU Q， MA C， FENG SP， et al.， 2017. Molecular cloning， subcellular localization and function analysis of a MeSWEET1 gene from Manihot esculenta" ［J］. Mol Plant Breed， 15（7）： 2502-2509." ［劉秦， 馬暢， 馮世鵬， 等， 2017. 木薯SWEET1基因的分子克隆、亞細胞定位與功能分析" ［J］. 分子植物育種， 15（7）： 2502-2509.］

LU J， SUN MH， MA QJ， et al.， 2019." MdSWEET17， a sugar transporter in apple， enhances drought tolerance in tomato" ［J］. J Integr Agric， 18（9）： 2041-2051.

RABBI IY， KAYONDO SI， BAUCHET G， et al.， 2022. Genome-wide association analysis reveals new insights into the genetic architecture of defensive， agro-morphological and quality-related traits in cassava" ［J］. Plant Mol Biol， 109（3）： 195-213.

SUN M， HUANG X， YANG J， et al.， 2013. Arabidopsis RPG1 is important for primexine deposition and functions redundantly with RPG2 for plant fertility at the late reproductive stage" ［J］. Plant Reprod， 26（2）： 83-91.

VALIFARD M， HIR RL， MLLER J， et al.， 2021. Vacuolar fructose transporter SWEET17 is critical for root development and drought tolerance" ［J］. Plant Physiol， 187（4）： 2716-2730.

WANG L， YAO LN， HAO XY， et al.， 2018. Tea plant SWEET transporters： expression profiling， sugar transport， and the involvement of CsSWEET16 in modifying cold tolerance in Arabidopsis" ［J］. Plant Mol Biol， 96 （6）： 577-592.

WILSON MC， MUTKA AM， HUMMEL AW， et al.， 2017. Gene expression atlas for the food security crop cassava" ［J］. New Phytol， 213（4）： 1632-1641.

WU YT， WANG SS， DU WH， et al.， 2023. Sugar transporter ZmSWEET1b is responsible for assimilate allocation and salt stress response in maize" ［J］. Funct Integr Genomics， 23（2）： 137-147.

XUE JJ， AN FF， LUO XQ， et al.， 2022. Study on the function of cassava sugar transporter Mesweet18 by VIGS ［J］. Curr Biotechnol， 12 （6）： 888-893." ［薛晶晶， 安飛飛， 羅秀芹， 等， 2022. VIGS技術鑒定木薯糖轉運蛋白Mesweet18的功能研究 ［J］. 生物技術進展， 12（6）： 888-893.］

XUE JJ， AN FF， ZHU WL， et al.， 2023. Cloning and functional analysis of sugar transporter MeSWEET18 in cassava ［J］. Chin J Trop Crops， 44 （6）： 1083-1090." ［薛晶晶， 安飛飛， 朱文麗， 等， 2023. 木薯糖轉運蛋白MeSWEET18的克隆與功能分析 ［J］. 熱帶作物學報， 44（6）： 1083-1090.］

YIN X， GUO W， SPIERTZ JH， 2009. A quantitative approach to characterize sink-source relationships during grain filling in contrasting wheat genotypes" ［J］. Field Crop Res， 114（1）： 119-126.

YU Y， HUI Z， LI W， et al.， 2012. Genome-wide analysis and environmental response profiling of the fk506-binding protein gene family in maize （Zea mays L.）" ［J］. Gene， 498（2）： 212-222.

ZRATE-CHAVES CA， OSORIO-RODRGUEZ D， MORA RE， et al.， 2021. TAL Effector repertoires of strains of Xanthomonas phaseoli pv. manihotis in commercial cassava crops reveal high diversity at the country scale" ［J］. Microorganisms， 9（2）： 315-340.

ZENG Z， LYU T， LYU YM， 2022. LoSWEET14， a sugar transporter in lily， is regulated by transcription factor LOABF2 to participate in the ABA signaling pathway and enhance tolerance to multiple abiotic stresses in tobacco" ［J］. Int J Mol Sci， 23（23）： 15093-15111.

ZHU BG， LI C， ZHANG XJ， et al.， 2022. Molecular cloning and function analysis of a MeSWEET3b gene from Manihot esculenta" ［J］. Mol Plant Breed， 20（3）： 733-741." ［朱柏光， 李闖， 張雪嬌， 等， 2022. 木薯MeSWEET3b 的基因克隆及功能分析 ［J］. 分子植物育種， 20（3）： 733-741.］

（責任編輯 李 莉 周翠鳴）

基金項目：" 中國熱帶農業科學院國家熱帶農業科學中心科技創新團隊 （CATASCXTD202301） 。

第一作者： 薛晶晶（1983—），博士，副研究員，研究方向為木薯糖代謝，（E-mail）xuetao608@[KG-0.5mm]163.com。

*通信作者：" 安飛飛， 博士， 副研究員， 研究方向為木薯采后腐爛機制解析，（E-mail）anfeifei@[KG-0.5mm]catas.cn。