響應曲面法優化生草烏干熱抑菌最佳工藝

摘要：目的：通過響應曲面法優化生草烏干熱抑菌工藝條件。方法：以成品制劑微生物（細菌、霉菌）數量和烏頭類雙酯型生物堿轉移率為評價指標，選取加熱溫度、加熱時間、鋪盤厚度為考察因素，利用響應曲面法優選生草烏抑菌最佳工藝。結果：生草烏最佳抑菌工藝條件：加熱溫度為106 ℃，加熱時間為10 h，鋪盤厚度為3 cm。結論：此工藝條件經工藝驗證試驗，干熱后選用生草烏入藥的制劑成品微生物指標可達到《中國藥典》2020年版要求，重復性好，且干熱前后烏頭類雙酯型生物堿轉移率較高。

關鍵詞：響應面優化；烏頭類雙酯型生物堿轉移率；干熱抑菌

草烏屬于烏頭屬植物，具有抗炎、鎮痛、鎮靜、解熱等藥理作用，作為常用的中藥臨床用藥［1］。國內外專家學者已從烏頭屬植物中分離鑒定了許多種生物堿類化合物，其中烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿（hypaconitine），這3種生物堿在烏頭屬植物中最常見，且含量最高，也是該類植物中主要的藥效成分［2］，因此，生藥入藥在生產工藝中，控制烏頭類雙酯型生物堿的轉化程度就顯得尤為重要。

1儀器與材料

1.1儀器

CTC2熱風循環烘箱，江蘇省范群干燥設備廠有限公司；Waters2695高效液相色譜系統（配2996PAD檢測器，Empower 3分析軟件），美國Waters公司，minitab statistical software 2010版。

1.2試藥

甲醇，分析純，太倉滬試試劑有限公司；乙腈，色譜純，德國默克集團（Merck KGaA）；純化水，屈臣氏集團；其他試劑均為分析純，太倉滬試試劑有限公司。

生草烏：桂林三金藥業股份有限公司211108批生草烏，水分7%，粒度≤1.5 cm。

2方法與結果

2.1干熱方法

每次將生草烏按設定的不同裝量裝平鋪至設備配套的不銹鋼托盤，放置在干燥架上，推入熱風循環烘箱中，在設定溫度下加熱不同時間。

2.2檢驗方法

（1） 微生物檢測按《中國藥典》2020年版微生物計數法和控制菌檢查法檢查。

（2） 含量檢測方法參照《中國藥典》2020年版高效液相色譜法測定，并計算轉移率=滅菌后飲片的含量/滅菌前飲片的含量×100%。

2.3干熱工藝條件的選擇

影響生草烏干熱抑菌效果的因素有設備循環風量、烘箱熱分布均一性、生草烏水分、藥材粒徑大小、加熱溫度、加熱時長、鋪盤厚度。其中設備性能、生草水分和粒徑波動不大，故不作為本次實驗的考查對象。

干熱抑菌是通過氧化作用使微生物死亡。有趙斌秀，王妍彥等專家學者研究得出在干熱條件下100 ℃作用60 min、120 ℃作用15 min、140 ℃作用10 min可使載體上的大腸桿菌全部滅活。當溫度超過120 ℃時會使微生物表面的有機物碳化［3］。為避免有機成分“碳化”，采用120 ℃以下的溫度作為設計考察；飲片中存在大量的水分、纖維結構、復雜有機物，需要延長加熱時間。另根據滅菌柜設備性能確認，滿載時物料4 h方達到100 ℃穩態溫度，最終選擇干熱溫度100 ℃、105 ℃、110 ℃，干熱時長9 h、10 h、11 h進行響應面工藝優化。鋪盤厚度2 cm、3 cm和4 cm三個水平進行響應面優化。

2.4中心組合設計實驗及結果分析

2.4.1因素和水平的篩選

響應優化法以烏頭類雙酯型生物堿轉移率為響應值，以鋪盤厚度（A）、加熱溫度（B）、加熱時長（C）為考察因素，選擇minitab軟件進行試驗設計和數據擬合。

2.4.2Box-Behnken實驗設計與結果

根據Box-Behnken實驗設計原理，設計了3因素3水平共15次實驗點的響應面分析實驗，測定雙酯型生物堿含量，并計算轉移率，同步檢測微生物限度。

根據前期研究，確認生草烏細菌數、霉菌數在≤1×105 cfu/g時，就能保證成品微生物限度合格，因此微生物限度為標準。結果見表1。表1干熱工藝響應面試驗設計及結果

序號鋪盤厚

度/cm加熱溫

度/℃加熱時

長/h細菌

/（cfu·g-1）霉菌

/（cfu·g-1）質量分數

/（g·g-1）轉移率

/%12105935 0001 1000.1266.2241001036 0007100.1162.134105930 0002500.1370.743110926 0003000.1266.6531051036 0001 2000.1479.9621101022 0003500.1370.1721051134 0003000.1269.4831051034 0001 0000.1480.3931001137 0008000.1161.41021001036 0001 0000.155.41141051125 0001 5000.1374.91231101120 0001800.1266.91341101021 0002300.1370.7143100932 0001 3000.1161.41531051033 0001 6000.1478.7

干熱前生草烏細菌：3.6×105 cfu/g霉菌：1.6×105 cfu/g；烏頭類雙酯型生物堿含量：0.18%

根據實驗的結果可知，細菌數和霉菌數均符合≤1×105 cfu/g，符合抑菌設定要求，因此在各因素擬合回歸中，將以轉移率為響應值，得到回歸方程如下：

轉移率=-5 323+58.2鋪盤厚度+91.0加熱溫度+97.0加熱時長-4.42鋪盤厚度×鋪盤厚度-0.425 7加熱溫度×加熱溫度-4.92加熱時長×加熱時長-0.305鋪盤厚度×加熱溫度+0.25鋪盤厚度×加熱時長+0.015加熱溫度×加熱時長

回歸決定系數R-sq=96.2%，回歸模型P=0.005＜0.05，說明響應值擬合程度良好，失擬項0.072＞0.05，說明失擬情況可接受。從下表2中可以看出加熱溫度對烏頭類雙酯型生物堿的轉移率有顯著影響（P=0.004＜0.05），鋪盤厚度的二次效應、加熱溫度的二次效應、加熱時長的二次效應均對烏頭類雙酯型生物堿的轉移率有顯著影響（P＜0.05）。

響應曲線面圖是響應值針對實驗因素鋪盤厚度、加熱溫度、加熱時長所構成的響應面圖形，可以直觀的看出各參數之間的關系。本實驗的響應面圖形分析如圖1所示。

圖1響應面優化模型的等值線圖和曲面圖

2.4.3最佳工藝的優化與放大工藝驗證試驗

運用響應曲面分析中的響應優化器，以烏頭類雙酯型生物堿轉移率最大為目標，模型給出的最佳參數為：鋪盤厚度3.2 cm，加熱溫度105.9 ℃，加熱時長10.1 h。

為方便生產，實驗最佳參數調整為：鋪盤厚度3 cm，加熱溫度106 ℃，加熱時長10 h，取不同批次的生草烏各5 kg，驗證有效性。實驗結果烏頭類雙酯型生物堿的轉移率波動范圍72%～75%（n=10），RSD=4.2%（RSD＜5%），且位于95%預測區間，對生草烏的有效成分保留以及抑菌效果均能符合預期。工藝穩定、可重復性好。

3討論

本實驗工藝參數：加熱溫度106 ℃，加熱時間10 h，鋪盤厚度3 cm。有效地保留了生草烏的烏頭類雙酯型生物堿，在生產前端有效抑制微生物數量，在后續的工藝步驟對微生物分級消殺，從而最終實現成品滿足微生物限度要求。

參考文獻：

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典［M］.北京：中國醫藥科技出版社，2020.247.

［2］宋東江，陸滿文，李漢青.烏頭堿類化合物毒理學研究概況［J］.中國藥理學通報，1989（5）：272274.

［3］趙斌秀，王妍彥，梁辰，等.脊髓灰質炎病毒與大腸桿菌熱抗力的比較及有機物對熱抗力影響的研究［J］.中國衛生檢驗雜志，2011，21（3）：6162.

作者簡介：鄒贛昌，男.廣西桂林人，工程師，碩士，研究方向，藥物化學。

通訊作者：俸雅娟，女，廣西桂林人，工程師，本科，研究方向：制藥工程。