免疫原性細胞死亡基因風險模型的建立及其對肝細胞癌預后和腫瘤微環境特征的預測價值

摘要：目的鑒定肝細胞癌（HCC）免疫原性細胞死亡（ICD）相關基因，并基于相關基因構建評分模型預測HCC的預后和腫瘤微環境特征。方法通過癌癥基因組圖譜數據庫獲取HCC數據集，采用熱圖展示了HCC中57個ICD相關基因的表達。基于ICD相關基因表達進行聚類分析，對2種ICD相關亞型（ICD低表達組和ICD高表達組）進行基因本體富集、京都基因和基因組百科全書富集、體細胞突變差異、免疫細胞浸潤差異分析。構建LASSO Cox回歸風險預后模型，驗證其臨床應用價值。構建列線圖模型，預測患者1、3和5年的生存率。此外，采用qRT-PCR驗證模型中關鍵基因的表達水平。兩組間比較采用成組t檢驗，采用單因素和多因素Cox回歸分析確定臨床病理特征中的預后因素。采用Kaplan-Meier生存曲線進行預后分析。采用Spearman秩相關進行相關性分析。結果ICD低表達組預后較差，ICD高表達組與良好的臨床結果相關（P=0.004）。進一步研究表明ICD高表達組與免疫活性微環境相關，且ICD高表達組的基因主要富集于免疫相關通路（免疫球蛋白受體結合、造血細胞譜系和B淋巴細胞受體信號通路）。體細胞突變結果顯示，ICD高表達組的CD274、CTLA4、HAVCR2、TIGIT、PDCD1和PDCD1LG2的基因表達水平較高（P值均＜0.05）。利用8個ICD相關基因（HSP90AA1、ATG5、BAX、PPIA、HSPA4、TLR2、TREM1、LY96）建立風險預后模型，該模型在不同臨床特征中均有較好的預測價值。單因素和多因素Cox回歸分析表明，在訓練集中，年齡和風險評分是總生存期的獨立預后因素（P值均＜0.05）。qRT-PCR結果表明，HSPA4和REM1在HCC腫瘤樣本中的相對表達水平顯著高于瘤旁組織（P值均＜0.001）。ICD風險評分升高的患者與γamp;T淋巴細胞（r=-0.29）、漿細胞（r=-0.3）和CD8+T淋巴細胞（r=-0.37）呈負相關（P值均＜0.05），與記憶B淋巴細胞（r=0.38）、靜止樹突狀細胞（r=0.47）和M0型巨噬細胞（r=0.49）呈正相關（P值均＜0.05）。結論本研究確定了與HCC預后相關的ICD基因，為理解不同ICD表達譜相關的免疫特性提供了見解。構建的風險模型和列線圖對于預測HCC患者的預后預測和免疫治療指導具有重要的價值。

關鍵詞：癌，肝細胞；免疫原性細胞死亡；預后；腫瘤微環境

肝細胞癌（HCC）作為一種常見的惡性腫瘤，在全球范圍內引發了嚴重的公共衛生問題。HCC發現時常在晚期，限制了早期干預和治療的機會[1-3]。因此，探索能夠準確預測早期HCC患者預后的生物標志物和分子機制顯得尤為重要。據相關報道[4-8]，近年來免疫療法在多種惡性腫瘤治療中取得了顯著的突破。然而，在HCC治療中的應用受到了限制。可能的原因是肝癌組織微環境的免疫抑制作用，其中包括細胞死亡途徑的紊亂。近期研究[9-10]表明，免疫原性細胞死亡（immunogenic cell death，ICD）在調節腫瘤微環境中的免疫應答方面起著重要作用。然而，關于ICD與HCC早期患者預后之間潛在關系的了解還相對有限。

ICD是一種特殊的細胞死亡方式，它是由某些化學藥物、放療、光動力療法、溶瘤病毒等方式作用于腫瘤細胞，觸發內質網應激反應和產生活性氧并從細胞內釋放免疫信號分子，增強腫瘤細胞的免疫原性，激活腫瘤特異性細胞毒性T淋巴細胞對腫瘤細胞的攻擊，從而引起機體抗腫瘤免疫反應。腫瘤發生ICD時，會在細胞膜表面上調并釋放一系列免疫信號分子，被識別后，促進免疫效應因子的合成與釋放，誘導機體免疫應答殺傷腫瘤細胞，這一系列免疫信號分子被稱為損傷相關分子模式[11-14]。在過去的幾年中，已經探索了ICD的分子機制，但是很少在臨床上研究患者來評估ICD的可能性。例如，根據患者對ICD免疫療法的反應來識別和分類生物標志物，將具有重要的臨床價值。近年來有研究[15-16]表明，ICD相關的基因在免疫治療中起著關鍵的作用，但在HCC中的具體作用尚不清楚。因此，本研究將基于大規模的HCC患者隊列，利用系統生物學方法篩選與ICD 相關的基因，并構建一個基于這些基因的模型，用于預測HCC患者對免疫治療的反應和生存結果。在未來，這項技術可以幫助醫生對治療作出重要的判斷。

1"""" 資料與方法

1.1" 數據收集"""""" 獲取與HCC中ICD相關的基因特征隊列采集和特征分析：從癌癥基因組圖譜（TCGA）和基因型-組織表達（GTEx）項目的存儲庫中獲取HCC隊列的臨床屬性以及相應的對照肝組織樣本的轉錄組測序數據。共收集了252例早期HCC患者進行分析。根據文獻[17-18]報道的57個ICD相關基因用于后續分析（表1）。

1.2" HCC中ICD相關基因變異" 使用R（v4.3.1）在TCGA-HCC數據矩陣中識別出HCC與對照組之間表達改變的基因子集，遵循假陽性率（FDR）lt;0.05和絕對對數變化倍數（logFC）gt;1.5的閾值篩選原則。將這些差異表達基因（differentially expressed genes，DEG）與預先確定的ICD相關基因進行交集，以確定差異表達的ICD相關基因集合。使用“ConsensusClusterPlus”R包（v1.54.0）進行一致性聚類分析，基于非負矩陣分析的異質性聚類分析方法將患者樣本進行分組，設置候選聚類數目k從2～9，通過多次重復聚類并計算一致性矩陣，確定最優的聚類數目為k=2，并分為ICD高表達組和ICD低表達組。隨后使用GO（基因本體）框架和KEGG（京都基因和基因組百科全書）通路映射對這些差異表達的ICD相關基因進行功能注釋，利用R中的Cluster Profiler包（v4.0.2），調整后的Plt;0.05且最小計數為1。深入分析ICD高表達組相關的功能和信號通路，采用基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA），選擇MSigDB數據庫中的“c2.cp.kegg.v7.0.symbols.gmt”和“c5.go. bp.v7.0.symbols.gmt”基因集進行分析。

1.3" ICD基因表達與體細胞突變、免疫參數之間的關聯 通過下載HCC樣本的體細胞突變數據，使用Maftools包（v2.8.0）對突變數據進行處理和可視化分析。通過ESTIMATE算法評估HCC患者腫瘤中ICD表達與免疫微環境之間的相互作用，該算法檢查了這些腫瘤樣本中預測的基質和免疫細胞含量。使用CIBERSORT算法計算HCC患者之間的免疫浸潤狀態。通過CIBERSORT算法進行t檢驗分析，以研究ICD表達與免疫細胞浸潤、免疫檢查點之間的差異。

1.4" 構建風險模型""""" 在來自TCGA-HCC數據集的252例具有總生存期（OS）數據的HCC病例隊列中，對差異表達的DE-IRG集合進行單變量Cox回歸分析，以篩選出Plt;0.05的基因。隨后通過應用最小絕對收縮和選擇算子（least absolute shrinkage and selection operator，LASSO）技術，對基因選擇進行進一步優化，確定用于構建預后風險模型的基因。使用R包中的ggplot2包（v3.3.5）對這些基因在HCC和對照組樣本之間的表達進行比較分析，并通過人類蛋白質圖譜資源進行免疫組化驗證。根據各自Cox系數加權的基因表達水平線性組合計算每位患者的風險評分（風險評分=α1×X1+α2×X2+...+αn×Xn），根據中位數風險評分將患者分為高風險或低風險類別。進行比例風險假設檢驗以評估風險模型的擬合度。通過Kaplan-Meier生存分析提供高風險與低風險隊列的比較生存指標，以圖形方式表示生存分布和風險特征。模型的預測可靠性通過pROC包中的受試者工作特征曲線（ROC曲線）分析進行量化。使用類似的方法論，應用GTEx數據集進行外部驗證。此外，為了確定風險模型輸出與臨床參數之間的相關性，將來自TCGA-HCC的HCC樣本分為高于和低于中位數基因表達的兩個組，并對每個亞組執行生存分析。

1.5" 確定早期HCC患者獨立的預后因素 利用來自TCGA-HCC數據庫HCC的完整臨床數據集，首先進行單變量Cox比例風險分析，以確定具有Plt;0.05的臨床和風險模型因素。然后將這些顯著因素進行多變量Cox回歸分析，以識別與HCC患者顯著相關的獨立預后指標。構建整合這些獨立變量的預后列線圖，以預測早期HCC患者1、3、5年的生存概率。通過生成校準圖，評估列線圖的預測準確性和可靠性。

1.6" 臨床樣本采集及RT-PCR""" 選取2022—2023年南昌大學第一附屬醫院收治的HCC患者5例。手術或活檢后立即將標本保存在氣相液氮中。采用E.Z.N.A法提取標本中的總RNA。總RNA試劑盒I（Omega）遵循制造商的協議。采用CFX96 Touch實時PCR檢測系統（Bio- Rad）進行qRT-PCR，采用比較Ct法檢測目的基因的相對表達水平。以GAPDH作為歸一化對照。引物序列見表2。

1.7" 統計學方法"" 使用R（v4.3.1）進行統計分析。兩組間比較采用成組t檢驗。采用單因素和多因素Cox回歸分析確定臨床病理特征中的預后因素。采用Kaplan- Meier生存曲線進行預后分析。采用Spearman秩相關進行相關性分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2"""" 結果

2.1" 基于ICD差異基因分組結果""""" 通過一致性聚類，根據最優聚類數目（k=2），將患者樣本分為ICD低表達組和ICD高表達組（圖1a～c）。構建了ICD基因表達的熱圖（圖1d），ICD低表達組顯示ICD相關基因的低表達水平，而ICD高表達組顯示高表達水平。此外，生存分析表明，ICD低表達組預后較差，ICD高表達組與良好的臨床結果相關（P=0.004）（圖1e）。

2.2" ICD高表達組DEG和信號通路的分析""""" 由于ICD高表達組的臨床治療效果好，而ICD低表達組的預后差，在不同的表達組中確定了關鍵的DEG信號通路，以了解調控預后的分子機制。研究分析了上調基因的信號通路，發現這些基因在ICD高表達時富集于細胞黏附的調節、細胞活化的正調控、細胞黏附的正調控、白細胞活化的正調控、細胞因子-細胞因子受體相互作用、PI3K- Akt信號通路（圖2a、b）。這些結果表明，ICD的高表達與免疫活性微環境有關。為了進一步確定與ICD高表達相關的信號通路，對ICD高表達組和低表達組進行了GSEA。結果表明，ICD高表達組中的基因集中于免疫相關通路，如免疫球蛋白受體結合、造血細胞譜系和B淋巴細胞受體信號通路（圖2c、d）。

2.3" 免疫細胞浸潤的體細胞突變分析與評價"" 研究對ICD高表達組和ICD低表達組進行了體細胞突變分析，發現TP53、CTNNB1和MUC16是兩組中相對常見的突變，且具有不同的相對頻率（圖3）。此外，使用ESTIMATE算法分析HCC患者樣本數據，比較了患者免疫細胞和基質細胞的相對評分，與ICD低表達組相比，ICD高表達組的免疫評分更高（P＜0.05）（圖4a～c）。基于CIBERSORT算法，本研究發現在ICD低表達組中血漿細胞和CD8+T淋巴細胞的浸潤增加，而ICD高表達組中樹突狀細胞和巨噬細胞M0的浸潤增加（圖4d）。對免疫檢查點的分析發現，ICD高表達組CD274、CTLA4、HAVCR2、TIGIT、PDCD1和PDCD1LG2的基因表達水平較ICD低表達組明顯升高（P值均＜0.05）（圖4e）。同時，ICD高表達組的HLA-A、HLA-C、HLA-DPA1等基因表達水平也高于ICD低表達組（P值均＜0.05）（圖4f）。

2.4" ICD風險特征的構建與驗證 在訓練集中，通過單因素Cox比例風險分析確定了8個與HCC預后相關的ICD基因（圖5a）。這些與OS相關的ICD基因隨后被用于通過LASSO Cox生成預后特征回歸方法（圖5b、c），其中來自2個ICD基因對的系數被用于計算風險評分。風險評分模型采用以下算法開發：風險評分=HSPA4×0.131 8+TREM1×0.395 6。根據風險評分的中位數將HCC患者分層為低風險組和高風險組，然后在訓練集中評估其預測價值。高風險組的HCC患者OS較差（P=0.002）（圖5d）。然后將相同的公式和截止閾值應用于驗證集（GEO，GSE76427），同樣揭示了高風險組的HCC患者有更差的OS（P＜0.001）（圖5e）。隨著風險評分的增加，死亡風險增力口。在驗證集中也觀察到了相同的分析結果（圖5f～i）。

2.5" 列線圖的構建、評估及qRT-PCR驗證"""" 通過結合患者的臨床病理特征，將年齡、性別、腫瘤分級、腫瘤分期和風險評分納入到單因素和多因素Cox回歸進行分析。結果表明，在訓練集中，年齡和風險評分是OS的獨立預后因素（P值均＜0.05）（圖6a、b）。為了更好地應用這一結果，將TNM分期分三個參數納入，構建了列線圖來預測患者1、3和5年的生存率（圖6c），校準圖顯示該列線圖具有良好的預測能力（圖6d）。此外，還通過qRT-PCR在5個臨床樣本中驗證了風險評分模型中2個基因的表達水平。結果表明，HSPA4和REM1在HCC腫瘤樣本中的相對表達水平顯著高于瘤旁組織（P值均＜0.001）（圖7）。

2.6" 風險評分與免疫微環境特征""""" 考慮到ICD在抗腫瘤免疫反應中的重要生物學作用，進一步探究了ICD風險評分與腫瘤微環境之間的關系。結果表明，風險評分升高的患者與γδT淋巴細胞、漿細胞和CD8+T淋巴細胞呈負相關，與記憶B淋巴細胞、靜止樹突狀細胞和M0型巨噬細胞呈正相關（P值均＜0.05）（圖8）。

3"""" 討論

HCC是世界上第六大常見的惡性腫瘤，也是惡性腫瘤死亡的第四大常見原因[19]。在治療過程中，由于化療藥物的選擇性不強，故易誘發多藥耐藥，這導致肝癌治療過程中化療藥物的臨床效果大大被降低。目前，許多HCC的化療方案均未達到預期效果，其中化療耐藥是影響肝癌化療療效的最關鍵因素[20-22]。免疫治療近年來在多種惡性腫瘤中取得了顯著的突破，然而，在HCC的治療中，免疫療法的應用仍受限制。一個可能的原因是肝癌組織微環境的免疫抑制作用。近期研究[23]表明，ICD在調節腫瘤微環境中的免疫應答方面起著重要作用。

ICD是一種獨特的受調控的細胞死亡類型，通過釋放免疫信號分子如損傷相關分子模式，能夠增強樹突狀細胞的抗原呈遞能力，并激活腫瘤特異性T淋巴細胞的殺傷作用，從而促進宿主免疫系統對腫瘤的免疫反應[24-25]。未來的研究可以進一步探索ICD相關基因/通路在個性化HCC治療中的應用前景，特別是通過結合ICD與其他臨床參數的預后模型，以幫助醫生更精準地預測患者的治療反應和生存結果。基于ICD相關基因的表達，本研究通過聚類分析在HCC中確定了2種聚類分型，即ICD低表達組和ICD高表達組。結果顯示ICD低表達組預后較差，ICD高表達組與良好的臨床結果相關。進一步分析了不同表達組的關鍵DEG和信號通路，結果顯示，ICD的高表達組與免疫活性微環境相關。GSEA分析結果顯示，ICD高表達組的基因主要集中在免疫相關途徑。體細胞突變分析表明，TP53、CTNNB1和MUC16在ICD高表達組中的相對頻率與ICD低表達組不同，TP53突變在ICD高表達組中相對更為普遍，而CTNNB1和MUC16在ICD低表達組中更為突出。這些差異可能反映了不同ICD表達亞型對免疫細胞浸潤和腫瘤微環境的調節方式。另外，與ICD低表達組相比，ICD高表達組的免疫評分明顯較高，腫瘤純度較低。基于CIBERSORT算法，發現在ICD 低表達組中血漿細胞和CD8+T淋巴細胞的浸潤增加，而ICD高表達組中樹突狀細胞和巨噬細胞M0的浸潤增加。對免疫檢查點的分析發現，ICD高表達組的CD274、CTLA4、HAVCR2、TIGIT、PDCD1、PDCD1LG2、HLA-A、HLA-C、HLA-DPA1等基因的表達水平明顯高于ICD低表達組。

此外，研究還構建并驗證了8個ICD相關基因的預后風險特征。高風險組的HCC患者OS較差，且死亡風險隨著風險評分的增加而增加。Cox回歸分析表明，年齡和風險評分是OS的獨立預后因素。為了更好地應用該結果，構建了列線圖，預測患者1、3、5年的生存率，結果顯示列線圖具有較好的預測能力。相關性分析結果顯示，風險評分升高的患者與Y8T淋巴細胞、漿細胞和CD8+T淋巴細胞呈負相關；與記憶B淋巴細胞、靜止樹突狀細胞和M0型巨噬細胞呈正相關。ICD作為一種可引起免疫反應的細胞死亡，有望打破免疫抑制的腫瘤微環境，啟動T淋巴細胞介導的適應性免疫應答，動員全身的免疫反應，從而實現長期抑制腫瘤的作用[26]。

雖然該研究利用生物信息學分析，對ICD相關基因在免疫微環境中的潛在意義及其在HCC免疫治療反應中的預測價值提供了深入見解，但本研究存在一定局限性。本研究的數據來源于TCGA公共數據庫，即使全面分析了ICD基因表達、免疫應答和突變的各個方面，仍需要進一步的臨床驗證和實驗探索。

綜上，本研究強調了與ICD相關的基因可能在塑造免疫微環境中發揮的關鍵作用，并可能成為HCC免疫治療反應的預測指標。此外，構建的ICD風險特征模型和列線圖對HCC患者的預后預測和制訂個體化治療方案具有重要的價值。然而，筆者認為持續的研究和嚴格的臨床驗證是確認這些結果準確性和可靠性不可或缺的步驟，將進一步推動對HCC患者與ICD相關基因的理解和應用。

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