探討血清外泌體miRNA-132及SIRT1在2型糖尿病伴輕度認知障礙中的診斷價值

摘 要：目的" 本研究旨在探索血清外泌體miRNA-132及沉默信息調節因子1（SIRT1）在2型糖尿病（T2DM）伴輕度認知障礙（MCI）患者中的表達水平，以及作為診斷T2DM伴MCI的診斷價值。方法" 本實驗選取泰州市人民醫院內分泌科60例2型糖尿病患者，其中認知正常組（T2DM+NCI）30例，輕度認知障礙組（T2DM+MCI）30例，檢測血清外泌體miRNA-132 及SIRT1的表達水平。結果" 與T2DM+NCI組相比，T2DM+MCI組患者中性別、年齡、受教育程度、LPA有差異性，具有統計學意義（Plt;0.05）；且血清外泌體miRNA-132、血清SIRT1表達水平降低，亦具有統計學意義（Plt;0.05）。ROC曲線顯示血清外泌體miRNA-132在單獨檢測時，其靈敏度為0.933，特異度為0.5，曲線下面積（AUC）為0.727。血清SIRT1在單獨檢測時，靈敏度為0.433，特異度為1，曲線下面積（AUC）為0.673。兩者聯合檢測時，靈敏度為0.867，特異度為0.6，曲線下面積（AUC）為0.752。結論" 與T2DM+NCI組相比，T2DM+MCI組患者中miRNA-132、SIRT1表達水平同向降低。血清外泌體miRNA-132及血清SIRT1對診斷T2DM伴輕度認知障礙具有一定的意義，二者聯合檢測時診斷價值更高。

關鍵詞：2型糖尿病；輕度認知障礙；外泌體miRNA-132；SIRT1

中圖分類號：R587.1 " " " " " "文獻標志碼：A 文章編號：1671-0142（2024）06-0065-05

隨著社會的發展，生活方式的改變以及老齡化等各種因素，糖尿?。―iabetes Mellitus，DM）發病率呈逐年上升趨勢，同樣老齡化的發展也帶來了認知障礙人群的增多，數年前鹿特丹研究發現2型糖尿病（Type 2 diabetes mellitus，T2DM）患者發生阿爾茨海默癥（Alzheimer's disease，AD）的風險約為正常人的2倍[1]，可能與2型糖尿病患者長期處于高血糖狀態、神經炎癥以及血腦屏障被破壞等因素有關[2]。包括輕度認知障礙（Mild cognitive impairment，MCI）在內的糖尿病并發癥直接影響了患者的生存質量及壽命，影響疾病的預后，也增加了家庭及社會經濟負擔，所以積極開展糖尿病伴認知障礙的研究，開發生物標志物的檢測篩查癡呆發病前期，早發現，早診治，積極采取干預措施，對延緩疾病的不可逆發展進程將具有重要臨床意義。近年來科學家們發現外泌體作為生物標志物具有高特異性、強穩定性等特點，且外泌體廣泛分布于生物體的各種體液中，較易獲取。外泌體（exosomes）是一種大小為40～100納米的脂質雙分子囊泡，這些囊泡廣泛分布于生物體的血液、尿液、腦脊液等各種體液中。外泌體其表面具有的多種粘附蛋白已經成為基因治療的潛在載體，納米尺寸和柔韌性使它們能夠跨越主要的生物屏障[3]，如血腦屏障（BBB）等，故提取血液中外泌體標本進行相關生物標志物檢測能更好地反映中樞神經系統相關疾病的病理生理機制。目前外泌體在神經系統相關疾病的研究中也越來越多[4]。在生物體液中，miRNAs在細胞間通訊中發揮著重要作用，循環miRNAs的轉運可以通過蛋白質轉運體或外泌體進行，并且miRNAs可進一步調節其下游靶基因蛋白，進一步影響疾病發病的信號通路。目前發現miRNAs與多種疾病如腫瘤、心血管疾病、神經系統疾病有著密切的聯系，尤其是在神經退行性疾病AD 中發揮著重要調控作用。相關研究表明：成年海馬中神經元發生缺陷與AD有關，miRNA-132缺失并最終損害成人海馬區神經，可以通過恢復miRNA-132水平來修復，miRNA-132具有神經元保護功能[5]，miRNAs的水平可能為了解AD大腦中發生的變化提供一個窗口。另有研究表明，外泌體內 miRNAs含量比于外周血總 miRNAs含量更加豐富，因此具有更直接、特異性更高的特點[6]。

1 一般資料

1.1 資料選取 本實驗選取在泰州市人民醫院內分泌科住院，在2021年8月至2022年8月期間的2型糖尿病患者共60例（男性30例，女性30例），平均年齡為54.98±11.56歲。

1.2 納入標準 （1）2型糖尿病（符合1999年世界衛生組織關于糖尿病的診斷標準：1）空腹血糖≥7.0mmol/L；2）口服葡萄糖耐量試驗（OGTT）2h血糖≥11.1mmol/L；3）三多一少癥狀加隨機血糖≥11.1mmol/L）。（2）入組患者年齡：18歲以上。

1.3 排除標準 （1）伴有糖尿病急性并發癥及急性感染病變患者，嚴重低血糖史。（2）嚴重肝腎功能不全。（3）伴隨其他內分泌疾病如甲亢、甲減等。（4）惡性腫瘤個人史。（5）曾做過減重手術或目前正在接受減肥藥物治療者。（6）伴有慢性消耗性疾病、貧血、嚴重營養不良者。（7）妊娠期及哺乳期患者。（8）已明確阿爾茨海默病，或伴腦血管病、腦外傷、中毒性腦病、帕金森病、腦垂體瘤及影響認知功能的神經系統疾病。（9）非T2DM患者。（10）聽力、視力、精神障礙等無法配合量表評估者。

1.4 評估認知能力 對入組患者進行MoCA量表的評估，若評分gt;25分表明患者認知功能正常，若19分≤評分≤25分則提示患者為MCI；對受教育年限不滿12年的患者評分結果可加1分。

2 研究方法

2.1 樣品收集 采集入組患者入院第2天清晨空腹靜脈血液樣本5mL，離心后收集上層血清于凍存管，并保存在-80C°冰箱中，用于后續實驗。

2.2 常規檢測 入院后常規檢測生化指標，收集糖化血紅蛋白（HbA1c）、空腹C肽（FC-P）、空腹血糖（FBG）、尿酸（UA）、高密度脂蛋白（HDL-C）、低密度脂蛋白（LDL-C）、血肌酐（CREA）、尿白蛋白肌酐比（ACR）、總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、載脂蛋白E（APOE）、脂蛋白A（LPA）等指標。計算出體重指數（BMI），利用C肽改良的HOMA公式來計算胰島素抵抗指數（HOMA-IR）、胰島β細胞功能指數（HOMA-β）。

2.3 血清外泌體miRNA-132的提取及測定

2.3.1 使用exoRNeasy Midi Kit 試劑盒提取外泌體，對提取的外泌體進行透射電鏡（TEM）、納米顆粒追蹤分析（NTA）以及蛋白印跡（WB）鑒定。

2.3.2 使用exoRNeasy Midi Kit試劑盒提取外泌體總RNA，用艾科瑞生物的逆轉錄試劑盒（Code No.AG11716）合成第一鏈cDNA，進行逆轉錄，對逆轉錄得到的產物進行實時熒光定量PCR（qPCR）。具體引物信息，見表1。

2.3.3 采用2^（-△△Ct）法計算兩組血清外泌體樣本中miRNA-132 相對表達水平。

2.4 血清SIRTI的提取及測定 用酶聯免疫吸附實驗（ELISA）檢測血清中SIRT1的水平。

2.5 統計學方法 應用軟件SPSS 27.0對本次實驗的結果進行統計學分析；經Shapiro-Wilk檢驗后，對不符合正態分布的數據用非參數檢驗的方法，以中位數、四分位數來表示。對符合正態分布的數據使用兩獨立樣本T檢驗的方法，用均數±標準差來表示。軟件Graphpad Prism進行畫圖；最后使用ROC曲線分析來判斷測量指標對T2DM伴MCI的診斷價值。qPCR的實驗數值采用2^（-△△Ct）來表示。Plt;0.05具有統計學意義。

3 結果

實驗結果發現兩組患者在T2DM+MCI組中女性患者更多，年齡更大，受教育程度更低，LPA值更高，且具有統計學意義（Plt;0.05），見表2；在病程、BMI、HbA1c、FC-P、FBG、UA、HDL-C、LDL-C、CREA、ACR、TC、TG、APOE、HOMA-IR-c、HOMA-β-c等方面無明顯差異（Pgt;0.05）。

實時熒光定量 PCR（qPCR）實驗結果CT值計算得出2^（-△△Ct）進行驗證，結果發現血清外泌體miRNA-132在T2DM+MCI組患者中表達下調，與T2DM+NCI組患者相比有顯著差異（Plt;0.05），具有統計學意義。血清SIRT1在T2DM+MCI組中表達下調，差異具有統計學意義（Plt;0.05），見圖1。

血清SIRT1在T2DM+MCI組中表達下調，差異具有統計學意義（Plt;0.05），見表3。

使用ROC曲線分析血清外泌體miRNA-132、血清SIRT1檢測對T2DM伴MCI的診斷價值，以及兩者聯合檢測對T2DM伴MCI的診斷價值。結果顯示，血清外泌體miRNA-132單獨檢測時，曲線下面積（AUC）為0.727，95%置信區間（CI）為0.598～0.855，靈敏度為0.933，特異度為0.5，最佳截斷值為1.142。血清SIRT1單獨檢測時，曲線下面積（AUC）為0.673，95%置信區間（CI）為0.535-0.812，靈敏度為0.433，特異度為1，最佳截斷值為 292.01。兩者聯合檢測時，曲線下面積（AUC）為0.752，95%置信區間（CI）為0.629-0.875，靈敏度為0.867，特異度為0.6，最佳截斷值為0.568。

4 討論

隨著老齡化社會的到來，糖尿?。―iabetes Mellitus，DM）已然成為威脅老年人身心健康最常見的疾病。預測到2045年，全球20～79歲的成年人糖尿病患病率將上升至12.2%，約7.832億人[7]。糖尿病并發癥給患者帶來的危害遠超糖尿病本身，如糖尿病合并冠心病及腎病時其患者體內的炎癥反應遠遠高于單純性冠心病及腎病患者[8]。阿爾茨海默病是一種以進行性認知功能障礙以及行為損害為特征的退行性中樞神經系統病變，主要發生于老年和老年前期。輕度認知障礙為阿爾茨海默前期階段，可進一步發展為癡呆。研究表明糖尿病是認知功能障礙的危險因素，因此積極開展糖尿病伴認知障礙的研究，開發生物標志物的檢測篩查癡呆發病前期，具有重要臨床意義。

外泌體是一種脂質雙分子囊泡，其獨特的結構使其能通過血腦屏障，更加準確地反應中樞神經系統的病理生理過程。miRNAs是一種內源性非編碼RNA，在調節基因表達方面發揮著重要作用，但是目前關于外泌體miRNA-132及SIRT1在T2DM中的研究較少。本研究結果表明，女性罹患T2DM伴輕度認知障礙的數量明顯多于男性，與既往一項以性別分組的研究結論一致，該研究提示在AD的演化過程中，不同性別之間的腦血流灌注具有顯著的差異性[9]。研究證據表明年齡與認知功能緊密相關，并且隨著年齡的增長，癡呆的風險越大。本研究結果顯示T2DM+MCI組患者年齡高于T2DM+NCI組（Plt;0.05），與既往研究一致，既往大部分對于認知障礙的研究多在老年患者中進行，而本研究入組患者年齡并未局限于老年患者，結果發現在年齡范圍擴大后，年齡仍然是T2DM伴MCI的重要影響因素。本研究組設想基于年齡因素，在T2DM患者中評估認知功能可能需提前篩查，有待今后進一步研究。本研究中T2DM+NCI組的患者的受教育程度普遍高于T2DM+MCI組?？赡芘c接受更高水平的教育時，大腦的新陳代謝增快，以及生物神經突觸的連接程度發生變化有關。因此本研究組認為，對受教育程度低的T2DM患者更應關注其認知功能。本實驗發現在T2DM+MCI組患者中LPA的表達量高于對照組。LPA是一種特殊的脂蛋白，又稱脂蛋白（a），LPA由一種類似LDL的顆粒組成，它與載脂蛋白（a）共價結合，在結構上與其他載脂蛋白不同。早在2002年，就有研究表明，較高的 LPA 濃度與阿爾茨海默病 （AD）之間存在聯系，其促進心血管疾病和炎癥的發生是腦血管疾病和認知能力下降的可能機制[10]。miRNA-132來源于miRNA212/132簇，是一種能參與神經元功能形成、分化及成熟過程的調控因子，與認知功能的發生發展息息相關。miRNA-132對維持大腦神經元的完整性具有十分重要的作用，并能減少海馬神經元之間的突觸傳遞。miRNA-132在大腦中的表達下調會加重Aβ蛋白的沉積和tau蛋白的磷酸化[11，12]。本研究發現，血清外泌體miRNA-132在T2DM+NCI組的表達高于T2DM+MCI組，這與國內外學者研究結果一致[13]。SIRT1的減少可能增加 AD 和胰島素抵抗的風險，血糖濃度升高可下調SIRT1以及增加p53乙酰化而誘導神經元凋亡[14]，本研究結果表明血清SIRT1在T2DM+MCI組患者中的表達水平較T2DM+NCI組顯著降低，與上述研究結果一致。SIRT1可受其上游靶基因miRNA-132的調控，Sara Giovanna Romeo等學者通過對30例來自開顱手術切除腦腫瘤的不同組織學分級的星形細胞瘤標本研究認為，miRNA-132的過表達降低了SIRT1的表達?？赡芘cmiRNA-132能阻滯NF-KBp56去乙?；?，從而導致SIRT1的表達減少有關[15]。同時SIRT1通過P53-miRNA-34a-SIRT1-P53這一環路調節miRNA的表達已被證實[16]。在本次實驗中，血清外泌體miRNA-132及SIRT1在兩組間的表達水平表現為同向下調，但對二者進行相關性分析時也并未發現明顯的相關性，與上述既往研究結果存在一定程度不一致。分析考慮可能與本研究樣本量不大，樣本來源不同以及研究對象不同有關，而目前也并未發現在T2DM患者中開展的類似研究，故有待在今后的研究工作中深入探討。

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（責任編輯 劉 紅）

Exploration on the Diagnostic Value of Serum Exosome miRNA-132 and SIRT1 in Type 2 Diabetes Mellitus with Mild Cognitive Impairment

WEI Jing-wen1， LIU Chen1， CHEN Qian1， YANG Shu-fang1，2

（1. The Affiliated Taizhou People’s Hospital of Nanjing Medical University， Taizhou Jiangsu 225300;

2. Zhongda Hospital Southeast University， Nanjing Jiangsu 210000， China）

Abstract： Objective This study was to investigate the expression levels of serum exosome miRNA-132 and silent information regulator1 （SIRT1） in patients with type 2 diabetes mellitus （T2DM） and mild cognitive impairment （MCI）， and their diagnostic value in the diagnosis of T2DM with MCI. Methods 60 patients with type 2 diabetes mellitus （T2DM） from the Endocrinology Department of Taizhou People’s Hospital were selected， including 30 patients with normal cognition （T2DM+NCI） and 30 patients with mild cognitive impairment （T2DM+MCI）. The expression levels of exosomal miRNA-132 and SIRT1 in the serum were detected. Results There were significant differences in gender， age， education level， and LPA between the T2DM+MCI group and the T2DM+NCI group （Plt;0.05）. Compared with the T2DM+NCI group， the expression levels of serum exosomal miRNA-132 and SIRT1 were lower in the T2DM+MCI group， and the differences were statistically significant （Plt;0.05）. The ROC curve shows that when serum exosomal miRNA-132 is detected alone， its sensitivity is 0.933， its specificity is 0.5， and the area under the curve （AUC） is 0.727. When serum SIRT1 is detected alone， the sensitivity is 0.433， the specificity is 1， and the area under the curve （AUC） is 0.673. When the two are jointly detected， the sensitivity is 0.867， the specificity is 0.6， and the area under the curve （AUC） is 0.752. Conclusions Compared with the T2DM+NCI group， the expression levels of serum miRNA-132 and SIRT1 in the T2DM+MCI group were lower in the same direction. The expression of miRNA-132 in serum exosomes and serum SIRT1 are of certain significance in diagnosing T2DM with mild cognitive impairment， and the diagnostic value is higher when the two are jointly detected.

Key words： type 2 diabetes mellitus; mild cognitive impairment; exosome miRNA-132; SIRT1