絕經后骨質疏松患者血清miR-27b-3p的表達及意義

[摘要]"目的"探討絕經后女性血清miR-27b-3p與Ⅰ型前膠原氨基端前肽（N-terminal"propeptide"of"type"Ⅰ"procollagen，PINP）和Ⅰ型膠原C末端肽1（C-terminal"telopeptide"of"typeⅠcollagen"1，CTX-1）的相關性。方法"選取2022年2月至2023年2月于浙江中醫藥大學附屬第二醫院就診的49例絕經后骨質疏松患者為研究對象，根據測得T值將其分為骨質疏松（osteoporosis，OP）組（T≤–2.5SD，26例）和骨量減少（osteopenia，OPn）組（–2.5SDlt;Tlt;–1.0SD，23例）。檢測并比較兩組患者的血清miR-27b-3p、PINP、CTX-1表達水平，分析血清P1NP和CTX-1與miR-27b-3p的相關性。結果"OP組患者的血清miR-27b-3p、PINP/CTX-1水平均顯著低于OPn組，PINP和CTX-1水平均顯著高于OPn組（Plt;0.05）；Pearson分析結果顯示，血清PINP和CTX-1水平與miR-27b-3p均呈負相關（Plt;0.05），PINP/CTX-1與miR-27b-3p呈正相關（Plt;0.05）。結論"血清miR-27b-3p水平可作為絕經后女性骨形成的潛在標志物。

[關鍵詞]"miR-27b-3p；骨代謝；絕經后骨質疏松；Ⅰ型前膠原氨基端前肽；Ⅰ型膠原C末端肽1

[中圖分類號]"R274.9""""""[文獻標識碼]"A""""""[DOI]"10.3969/j.issn.1673-9701.2024.34.001

Expression"and"significance"of"serum"miR-27b-3p"in"patients"with"postmenopausal"osteoporosis

YE"Baisheng1，"YUAN"Yifeng2，"ZHOU"Hang1，"HUANG"Zhen1，"HUANG"Xudong1，"LI"Jinkun1，"SHI"Xiaolin2，"TANG"Binbin2

1.The"Second"School"of"Clinical"Medicine，"Zhejiang"Chinese"Medical"University，"Hangzhou"310053，"Zhejiang，"China;nbsp;2.Department"of"Orthopedics，"the"Second"Affiliated"Hospital，"Zhejiang"Chinese"Medical"University，"Hangzhou"310000，"Zhejiang，"China

[Abstract]"Objective"To"investigate"the"correlation"between"serum"miR-27b-3p"and"N-terminal"propeptide"of"type"Ⅰ"procollagen"（PINP）"and"C-terminal"telopeptide"of"typeⅠcollagen"1"（CTX-1）"in"postmenopausal"women."Methods"Forty-nine"patients"with"postmenopausal"osteoporosis"treated"in"the"Second"Affiliated"Hospital，"Zhejiang"Chinese"Medical"University"from"February"2022"to"February"2023"were"selected"as"study"objects."They"were"divided"into"osteoporosis"（OP）"group"（T≤–2.5SD，"26"cases）"and"osteopenianbsp;（OPn）"group"（–2.5SD"lt;"T"lt;"–1.0SD，"23"cases）."The"expression"levels"of"serum"miR-27b-3p，"PINP"and"CTX-1"in"two"groups"were"detected"and"compared，"and"the"correlation"between"serum"P1NP"and"CTX-1"and"miR-27b-3p"was"analyzed."Results"The"levels"of"serum"miR-27b-3p"and"PINP/CTX-1"in"OP"group"were"significantly"lower"than"those"in"OPn"group，"and"the"levels"of"PINP"and"CTX-1"were"significantly"higher"than"those"in"OPn"group"（Plt;0.05）."Pearson"analysis"showed"that"serum"PINP"and"CTX-1"levels"were"negatively"correlated"with"miR-27b-3p"（Plt;0.05），"while"PINP/CTX-1"was"positively"correlated"with"miR-27b-3p"（Plt;0.05）."Conclusion"Serum"miR-27b-3p"levels"may"serve"as"a"potential"marker"for"bone"formation"in"postmenopausal"women.

[Key"words]"miR-27b-3p;"Bone"metabolism;"Postmenopausal"osteoporosis;"N-terminal"propeptide"of"type"Ⅰ"procollagen;"C-terminal"telopeptide"of"type"Ⅰ"collagen"1

絕經后骨質疏松（postmenopausal"osteoporosis，PMOP）主要是由于女性卵巢功能衰退，雌激素缺乏，成骨細胞（osteoblast，OB）和破骨細胞（osteoclast，OC）的骨代謝紊亂所致[1-2]。研究表明中醫藥可通過多種信號通路同時調控OC和OB分化，改善骨代謝紊亂，防治PMOP[3-4]。雙能X射線吸收法是目前公認的診斷骨質疏松（osteoporosis，OP）的金標準，而骨轉換標志物可更早反映骨轉換的動態[5]。骨轉換標志物分為骨形成標志物和骨吸收標志物，國際骨質疏松基金會首推Ⅰ型前膠原氨基端前肽（N-terminal"propeptide"of"type"Ⅰ"procollagen，PINP）和Ⅰ型膠原C末端肽（C-terminal"telopeptide"of"type"Ⅰ"collagen，CTX）這兩項指標[6]。PINP可監控OP的治療效果，其檢測結果不受激素干擾[7]。CTX作為骨吸收標志物對OP有顯著的預測作用[8]。一系列微RNA（microRNA，miRNA）已被證實與骨轉換標志物中的PINP和CTX存在相關性[9-10]。研究發現OC來源外泌體（osteoclast"derived"exosome，OC-Exo）內miR-214-3p水平升高可抑制OB分化[11]。Tang""""等[12]報道OB來源外泌體內的miR-433-3p可抑制Dickkopf-1蛋白表達以促進OB分化。筆者前期研究發現miR-27b-3p可抑制OB內Dickkopf-1蛋白表達來促進成骨分化，強骨飲含藥血清可上調OC-Exo內miR-27b-3p表達，減弱OC-Exo對OB的抑制作用[13]。為更好地將研究結果轉化到臨床實踐，本研究觀察絕經后女性血清miR-27b-3p水平與骨代謝指標的相關性，探討miR-27b-3p是否可作為PMOP的參考標志物。

1""資料與方法

1.1""試劑和儀器

1.1.1""試劑""Trizol試劑（Invitrogen，上海，15596026），PINP酶聯免疫吸附試驗（enzyme"linked"immunosorbent"assay，ELISA）試劑盒（mlbio，上海，ml038554），人CTX-1"ELISA試劑盒（mlbio，上海，ml028171），血清總RNA提取試劑盒（mlbio，上海，ml095275），RevertAid"First"Strand"cDNA"Synthesis"Kit（Thermo，上海，K1622），SYBR"Green"qPCR"Master（Roche，上海，4943914001-SR）。

1.1.2""儀器""pH計（Metter-Toledo"GmbH，LP115），電子天平（北京賽多利斯，CPA），磁力攪拌器（江蘇中大，T8-1），酶標儀（Thermo，mμ1ISKANMK3），離心機（湖南湘儀實驗室，HI650），全自動酶標儀（Thermo"scientific，Multiskan"MK3），多功能電熱鍋（廣州PHEPELI，CRJ-130D-1）。

1.2""研究方法

1.2.1""臨床血清標本收集""選取2022年2月至2023年2月于浙江中醫藥大學附屬第二醫院就診的絕經后骨質疏松患者為研究對象。參照世界衛生組織推薦的OP診斷標準，通過雙能X射線吸收法測量患者T1～T4椎體骨密度，根據中國人正常參考值計算T值，4個椎體骨密度T值取平均值，若T≥–1.0SD屬正常；若–2.5SDlt;Tlt;–1.0SD為骨量減少（osteopenia，OPn）；若T≤–2.5SD為OP；T≤–2.5SD且伴有骨折者為嚴重OP。納入標準：①絕經后女性，年齡51～91歲；②雙能X線骨密度儀（法國MEDILINK，MEDIXDR）測量髖部及腰部骨密度結果提示OP或OPn；③對本研究方案知曉并簽署知情同意書。排除標準：①近5年內患有糖尿病、冠心病、惡性腫瘤及其他嚴重疾病者；②長期服用激素者；③拒絕采血者。研究共納入49例患者，根據測得T值將其分為OP組（T≤–2.5SD，26例）和OPn組（–2.5SDlt;Tlt;–1.0SD，23例）。本研究經浙江中醫藥大學附屬第二醫院倫理委員會審查并備案（倫理審批號：浙中醫大二院倫審2022研第043號-01）。

1.2.2""聚合酶鏈反應""采集患者清晨空腹靜脈血2～3ml，離心，取上清液–80℃保存備用。通過血清總RNA提取試劑盒提取血清RNA。通過Quantus"Fluorometer測定RNA濃度。通過RevertAid"First"Strand"cDNA"Synthesis"Kit進行逆轉錄，然后將互補DNA通過SYBR"Green"qPCR"Master進行實時熒光定量聚合酶鏈反應，最后通過2-ΔΔCt計算相對水平。引物序列見表1。

1.2.3""ELISA檢測""分別采用PINP"ELISA試劑盒和CTX-1"ELISA試劑盒檢測血清PINP和CTX-1含量。設置標準品孔、樣本孔和空白孔。標準品孔加標準品50μl，空白孔加入50μl樣品稀釋液，樣本孔中加樣品稀釋液40μl及樣品10μl。用封板膜封板后置37℃溫育30min。棄液甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30s后棄去，重復5次，拍干。之后每孔加入酶標試劑50μl，空白孔除外。用封板膜封板后置37℃溫育30min。洗滌，每孔加入顯色劑A"50μl，再加入顯色劑B"50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15min。最后每孔加終止液50μl，終止反應。空白孔調零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。

1.3""統計學方法

采用SPSS"22.0和Prism"9軟件分析數據。計量資料符合正態分布的以均數±標準差（"）表示，兩組間比較采用t檢驗；采用Pearson法分析數據相關性。Plt;0.05為差異有統計學意義。

2""結果

2.1""兩組患者的血清miR-27b-3p水平比較

OP組患者的血清miR-27b-3p水平顯著低于OPn組（Plt;0.05），見圖1。

2.2""兩組患者的血清PINP和CTX-1水平比較

OP組患者的血清PINP和CTX-1水平均顯著高于OPn組（Plt;0.05），見圖2。

2.3""血清PINP和CTX-1水平與miR-27b-

3p的相關性分析

Pearson分析結果顯示，血清PINP和CTX-1水平與miR-27b-3p均呈負相關（Plt;0.05），見圖3。

2.4""血清PINP/CTX-1與miR-27b-3p的相關性分析

OPn組患者的PINP/CTX-1水平顯著高于OP組（Plt;0.05），提示OPn組患者具有成骨分化能力。Pearson分析結果顯示，PINP/CTX-1與miR-27b-3p呈正相關（Plt;0.05），見圖4。

3""討論

本研究對血清骨代謝標志物PINP和CTX-1與miR-27b-3p進行相關性分析。PINP反映成骨細胞合成骨的能力，不易受晝夜節律、飲食的影響，在靜脈穿刺后的血清中非常穩定[14]。PINP可監控OP的治療效果，判斷是否需要繼續或重啟抗OP治療[15]。CTX-1則必須在清晨空腹狀態下采集，其水平反映OC的骨吸收活性[14]。

近年來，對骨代謝或骨轉換標志物與骨密度值、成骨或破骨活性因子的相關報道較多。本研究結果顯示miR-27b-3p表達水平間接反映成骨分化能力，通過與OPn患者比較，發現OP患者血清miR-27b-3p水平明顯更低。相關性分析提示miR-27b-3p與破骨分化標志物和成骨分化標志物均呈負相關，符合PMOP女性骨代謝異常的表現。研究報道PMOP患者的血清β-CTX、PINP水平較高[16-17]；束婷婷[18]"發現血清25羥維生素D水平降低及抗酒石酸酸性磷酸酶5b、PINP、β-CTX水平升高可能是發生PMOP的影響因素。PMOP患者血清內骨硬化蛋白水平與PINP、β-CTX呈正相關，提示PMOP患者的wnt/β-"catenin通路被抑制[19-20]。Mosti等[21]發現力量訓練可提高PMOP患者骨量，PINP/CTX-1升高提示骨形成。

然而PINP和CTX無法反映骨細胞活動或骨膜沉積，且不能反映骨組織的質量[22]。隨著技術的進步，miRNA可能成為骨代謝的新型標志物。近年來，研究報道miRNA作為骨代謝標志物具有臨床意義，miRNA可調節骨形成和骨吸收，有助于維持骨穩態，參與細胞骨重塑[23]。異常的miRNA信號傳導可導致OP發生和發展[23-24]。骨代謝相關的miRNA在診斷PMOP中的作用初步體現，如hsa-miR-144-5p、hsa-miR-506-3p和hsa-miR-8068等可用作骨代謝的新型生物標志物，參與骨代謝[25]。Perksanusak等[26]發現PMOP患者血清miR-21與骨轉換標志物無關，但與骨密度水平呈正相關。參考Perksanusak等的研究，何至等[16]發現血清miR-21表達與血清β-CTX、PINP水平均呈負相關，miR-21參與PMOP的發生、發展。鮑鋒元等[27]報道PMOP組的miRNA-17/92a基因簇含量顯著低于OPn組和對照組，血清PINP、β-CTX水平顯著高于OPn組和對照組。miRNA-"17/92a基因簇與PINP和β-CTX均呈顯著負相關。Ramírez-Salazar等[28]對754個miRNA進行研究，發現miR-140-3p和miR-23b-3p可作為PMOP的潛在標志物。Lu等[29]報道miR-206/HDAC4通過調控OC增殖和凋亡，可作為新的診斷標志物。Pepe等[30]通過觀察絕經后OP、OPn和健康女性體內細胞外泌體數量和質量，發現OP患者的OC-Exo數量增加，間充質干細胞成骨分化水平減弱。

綜上，PMOP患者血清miR-27b-3p水平降低，其可作為絕經后女性骨形成的潛在標志物。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

[參考文獻]

[1] LEVIN"V"A，"JIANG"X，"KAGAN"R."Estrogen"therapy"for"osteoporosis"in"the"modern"era[J]."Osteoporos"Int，"2018，"29（5）："1049–1055.

[2] 中華中醫藥學會."絕經后骨質疏松癥（骨痿）中醫藥診療指南（2019年版）[J]."中醫正骨，"2020，"32（2）："1–13.

[3] TELLA"S"H，"GALLAGHER"J"C."Prevention"and"treatment"of"postmenopausal"osteoporosis[J]."J"Steroid"Biochem"Mol"Biol，"2014，"142："155–170.

[4] LIN"J，"ZHU"J，"WANG"Y，"et"al."Chinese"single"herbs"and"active"ingredients"for"postmenopausal"osteoporosis："From"preclinical"evidence"to"action"mechanism[J]."Biosci"Trends，"2017，"11（5）："496–506.

[5] 田琳琳，"馮正平."骨轉換生化標志物的研究進展[J]."中國骨質疏松雜志，"2022，"28（5）："755–759.

[6] 中華中醫藥學會."骨質疏松性骨折中醫診療指南[J]."中醫正骨，"2023，"35（1）："1–9.

[7] KREGE"J"H，"LANE"N"E，"HARRIS"J"M，"et"al."PINP"as"a"biological"response"marker"during"teriparatide"treatment"for"osteoporosis[J]."Osteoporos"Int，"2014，"25（9）："2159–2171.

[8] 翁睿，"李峰."骨轉換生化標志物預測骨質疏松性骨折的研究進展[J]."老年醫學研究，"2023，"4（3）："53–56.

[9] KOCIJAN"R，"MUSCHITZ"C，"GEIGER"E，"et"al."Circulating"microRNA"signatures"in"patients"with"idiopathic"and"postmenopausal"osteoporosis"and"fragility"fractures[J]."J"Clin"Endocrinol"Metab，"2016，"101（11）："4125–4134.

[10] ZARECKI"P，"HACKL"M，"GRILLARI"J，"et"al."Serum"microRNAs"as"novel"biomarkers"for"osteoporotic"vertebral"fractures[J]."Bone，"2020，"130："115105.

[11] LI"D，"LIU"J，"GUO"B，"et"al."Osteoclast-derived"exosomal"miR-214-3p"inhibits"osteoblastic"bone"formation[J]."Nat"Commun，"2016，"7："10872.

[12] TANG"X，"LIN"J，"WANG"G，"et"al."MicroRNA-433-3p"promotes"osteoblast"differentiation"through"targeting"DKK1"expression[J]."PLoS"One，"2017，"12（6）："e0179860.

[13] 唐彬彬，"劉康，"吳連國，"等."強骨飲調節破骨細胞外泌體影響成骨細胞分化的初步研究[J]."中國骨質疏松雜志，"2020，"26（11）："1598–1603.

[14] SZULC"P，"NAYLOR"K，"HOYLE"N"R，"et"al."Use"of"CTX-1"and"PINP"as"bone"turnover"markers："National"Bone"Health"Alliance"recommendations"to"standardize"sample"handling"and"patient"preparation"to"reduce"pre-analytical"variability[J]."Osteoporos"Int，"2017，"28（9）："2541–2556.

[15] GILLETT"M"J，"VASIKARAN"S"D，"INDERJEETH"C"A."The"role"of"PINP"in"diagnosis"and"management"of"metabolic"bone"disease[J]."Clin"Biochem"Rev，"2021，"42（1）："3-10.

[16] 何至，"顏端國，"嚴林."絕經后骨質疏松癥患者血清miR-21和Smad7表達變化及其臨床意義[J]."山東醫藥，"2022，"62（1）："67–69，"77.

[17] WEN"Y，"LI"H，"ZHANG"X，"et"al."Correlation"of"osteoporosis"in"patients"with"newly"diagnosed"type"2"diabetes："A"retrospective"study"in"Chinese"population[J]."Front"Endocrinol"（Lausanne），"2021，"12："531904.

[18] 束婷婷."血清25羥維生素D、TRACP-5b、PINP、β-CTX在絕經期骨質疏松病人中的檢測意義[J]."實用老年醫學，"2022，"36（12）："1273–1276.

[19] 梁升，"李俊輝，"申晟."絕經后骨質疏松癥婦女血清骨硬化蛋白、護骨素與骨密度、骨代謝指標的相關性研究[J]."風濕病與關節炎，"2022，"11（12）："12–15.

[20] 趙鵬飛，"許平安."絕經后骨質疏松癥患者血清SOST、OPN、Semaphorin3A水平與骨密度及骨代謝指標的關系[J]."海南醫學，"2021，"32（9）："1136–1139.

[21] MOSTI"M"P，"KAEHLER"N，"STUNES"A"K，"et"al."Maximal"strength"training"in"postmenopausal"women"with"osteoporosis"or"osteopenia[J]."J"Strength"Cond"Res，"2013，"27（10）："2879–2886.

[22] GARNERO"P."New"developments"in"biological"markers"of"bone"metabolism"in"osteoporosis[J]."Bone，"2014，"66："46–55.

[23] BALOUN"J，"PEKACOVA"A，"WENCHICH"L，"et"al."Menopausal"transition："Prospective"study"of"estrogen"status，"circulating"microRNAs，"and"biomarkers"of"bone"metabolism[J]."Front"Endocrinol"（Lausanne），"2022，"13："864299.

[24] 王佳瑤，"王春慶."微小RNA作為骨質疏松癥的診斷工具及治療靶標的研究進展[J]."中國現代醫藥雜志，"2018，"20（12）："99–104.

[25] ZHAO"S"L，"WEN"Z"X，"MO"X"Y，"et"al."Bone-"metabolism-"related"serum"micrornas"to"diagnose"osteoporosis"in"middle-aged"and"elderly"women[J]."Diagnostics"（Basel），"2022，"12（11）："2872.

[26] PERKSANUSAK"T，"PANYAKHAMLERD"K，"HIRANKARN"N，"et"al."Correlation"of"plasma"microRNA-21"expression"and"bone"turnover"markers"in"postmenopausal"women[J]."Climacteric，"2018，"21（6）："581–585.

[27] 鮑鋒元，"徐繼平，"吳鳴，"等."miRNA-17/92a基因簇、P1NP和β-CTX在診斷絕經后骨質疏松癥中的應用價值[J]."實用藥物與臨床，"2018，"21（12）："1350–1352.

[28] RAMíREZ-SALAZAR"E"G，"CARRILLO-PATI?O"S，"HIDALGO-BRAVO"A，"et"al."Serum"miRNAs"miR-140-"3p"and"miR-23b-3p"as"potential"biomarkers"for"osteoporosis"and"osteoporotic"fracture"in"postmenopausal"Mexican-"Mestizo"women[J]."Gene，"2018，"679："19–27.

[29] LU"Z，"WANG"D，"WANG"X，"et"al."MiR-206"regulates"the"progression"of"osteoporosis"via"targeting"HDAC4[J]."Eur"J"Med"Res，"2021，"26（1）："8.

[30] PEPE"J，"ROSSI"M，"BATTAFARANO"G，"et"al."Characterization"of"extracellular"vesicles"in"osteoporotic"patients"compared"to"osteopenic"and"healthy"controls[J]."J"Bone"Miner"Res，"2022，"37（11）："2186–2200.

（收稿日期：2024–06–25）

（修回日期：2024–11–10）