典型硫鐵礦礦渣微生物群落組成和環境驅動因子

摘要：以中國廣東省云浮市（GD）、安徽省合肥市（AH）和陜西省安康市（SX）3個硫鐵礦礦渣為研究對象，系統研究了不同地區硫鐵礦礦渣理化性質特征和微生物群落多樣性、物種組成及其環境驅動因子。結果顯示：不同地區硫鐵礦礦渣pH、NAG-pH、重金屬全量及有效態含量存在顯著差異（Plt;0.05），GD硫鐵礦礦渣微生物Shannon指數顯著高于AH和SX（Plt;0.05），不同地區微生物群落組成差異顯著（Plt;0.05）；AH、GD和SX的優勢門為變形菌門（Proteobacteria）和放線菌門（Actinomycetota），優勢屬為羅爾斯通菌屬（Ralstonia）、硫化芽孢桿菌屬（Sulfobacillus）和鉤端螺旋菌屬（Leptospirillum），均具有耐酸、耐重金屬和鐵硫氧化等功能；影響礦渣微生物群落結構和組成的主要環境驅動因子包括年均氣溫、年均降水量、pH、γ、DTPA-Zn、DTPA-Cr和Cu等。研究結果可為硫鐵礦礦渣治理和環境修復提供理論依據。

關鍵詞：硫鐵礦礦渣；理化因子；16S rRNA測序；微生物群落；群落多樣性；環境驅動因子

中圖分類號：TD167""""""""" 文章編號：1001-1277（2024）12-0031-06

文獻標志碼：Adoi：10.11792/hj20241206

引 言

中國硫鐵礦儲量十分豐富，約占全世界硫鐵礦總儲量的10 %［1］。硫鐵礦開采帶來巨大經濟效益的同時，也嚴重損害了礦區及其周邊生態環境。據統計，中國硫鐵礦礦渣排放量超過2 000萬t，堆存面積超過1 000萬m2［2］。硫鐵礦礦渣在水、氧氣和微生物的共同作用下，會形成低pH、高含量硫酸根離子（SO2-4）和重金屬的酸性礦山廢水（Acid mine drainage，AMD）［3-4］，AMD不僅嚴重污染周邊地表水體和地下水，使水體生態功能喪失，還會造成土壤重金屬污染，破壞區域土壤物理結構，造成營養元素流失，影響周邊農田作物產量和質量［5］。因此，對硫鐵礦礦渣進行生態修復和環境治理，是生態文明建設的重要任務。

硫鐵礦礦渣中殘存較多的金屬硫化物，而黃鐵礦（FeS2）的氧化是形成AMD的主要原因［6-7］，其化學反應過程［8-9］包括：①FeS2氧化，FeS2+7/2O2+H2O Fe2++2SO2-4+2H+；②Fe2+在有氧環境中氧化生成Fe3+，4Fe2++O2 +4H+" 4Fe3+ +2H2O；③FeS2被Fe3+氧化，FeS2+14Fe3++8H2O15Fe2++2SO2-4+16 H+。黃鐵礦的氧化產酸過程可分為2部分：一是黃鐵礦和水、氧氣發生氧化反應，生成的主要產物為硫酸和硫酸亞鐵，若氧氣充足，亞鐵離子被氧化為高價鐵，此過程較為緩慢；二是當pH值降至4.5以下，嗜酸微生物（如氧化亞鐵硫桿菌等）參與亞鐵離子的氧化過程，反應速度可提高6個數量級［10-11］。微生物驅動的黃鐵礦氧化是AMD形成的主要過程。

在黃鐵礦氧化過程中，硫氧化微生物（Acidithiobacillus、Thiobacillus等）通過將金屬硫化物氧化為硫酸根離子獲得能量［12］。酸性條件下，游離態Fe（Ⅱ）為數量龐大的鐵氧化細菌和古菌（Ferrovum myxofaciens、Ferroplasma等）提供電子供體和能量來源［13］。同時，鐵硫氧化與碳氮循環緊密耦合以適應極端寡營養環境［14］。硫化礦物和AMD的極端環境，為微生物生態與進化的研究提供了模式系統，也促進了濕法冶金和礦山環境治理技術的發展［15］。近年來，在AMD環境中發現的氧化亞鐵硫桿菌（Thiobacillus ferrooxidans）可通過酶促作用溶解礦物中的部分重金屬，獲得有價金屬原料［16］。另外，嗜酸硫酸鹽還原菌（Sulfate-Reducing Bacteria，SRB）同樣被應用于AMD治理，目前已發現的具有硫酸鹽還原功能的細菌多達60個屬，220多種，其具有在厭氧環境中將硫酸鹽、亞硫酸鹽和硫代硫酸鹽還原為硫化物（S2-、HS-和H2S）的能力［17］，成為了AMD微生物治理及礦山生態修復的關鍵功能微生物。

多項研究表明，環境理化性質，如pH、氧化還原電位和營養元素含量等，是影響微生物群落組成及其硫鐵循環功能的主要因素；此外，由于緯度、溫度和降水等差異，微生物也常呈現出生物地理分布模式，不同區域氣溫和降水量對土壤微生物物種多樣性、群落結構和代謝功能存在較大影響［18］。硫鐵礦及其礦渣堆場廣泛分布，而不同區域硫鐵礦產酸的主控因子及其微生物作用機制尚不明晰。

本文選取了廣東省云浮市（GD）、安徽省合肥市（AH）和陜西省安康市（SX）3個典型酸性硫鐵礦礦渣堆場，研究中國華南、華中和西北地區硫鐵礦礦渣堆場原核微生物多樣性和群落結構，以及環境驅動因子和氣候對原核微生物群落組成的影響，為硫鐵礦礦渣的環境治理和生態修復提供科學依據。

1 材料和方法

1.1 樣品采集

選擇中國華南、華中和西北3個典型硫鐵礦區的廢棄礦渣堆場進行研究，3個采樣點分別位于廣東省云浮市云浮硫鐵礦（N 22.915 6° ，E 112.044 8°）、安徽省合肥市鐘山鐵礦（N 31.863 9°，E 117.280 8°）和陜西省安康市白河硫鐵礦（N 32.809 5°，E 110.112 5°）。GD樣品于2023年10月采集自礦渣堆場，該地區屬亞熱帶季風氣候，年平均氣溫23.1 ℃，年降水量1 306.2 mm。AH樣品于2020年10月采集自礦渣堆場，該地區屬亞熱帶季風氣候，年平均氣溫15.6 ℃，年降水量1 216 mm。SX樣品于2021年3月采集自桂花村硫鐵礦廢棄渣堆，該地區屬大陸性季風濕潤氣候，年平均氣溫14.4 ℃，年降水量787.4 mm。

采用五點取樣法在礦渣堆場內隨機采集表層（0～15 cm）樣品并混合均勻，每個點采集5個平行樣，一部分用塑封袋保存，在4 ℃下運輸，用于礦渣理化性質分析；一部分保存于無菌管，干冰保護條件下運輸至實驗室-80 ℃冰箱，用于后續DNA提取和高通量測序。

1.2 理化性質分析

采集的礦渣經自然風干后，過20目篩和100目篩，用于后續理化因子測定。礦渣過20目篩后，與純水按照質量體積比1∶2.5混合后，分別使用pH計（PB-10，Sartorious，德國哥廷根）和電導率儀（DDSJ-308F，Rex Electric Chemical，中國上海）測定pH和電導率γ；采用過氧化氫氧化法測定凈產酸能力（Net acid generation capacity，NAG）和NAG-pH。礦渣總有機碳（TOC）采用總有機碳分析儀（TOC-VCSH）測定。樣品經王水消解后采用原子吸收分光光度計（AA-7000，日本島津）測定重金屬全量。樣品經DTPA溶液（質量體積比1∶2）浸提后，采用原子吸收分光光度計（AA-7000，日本島津）測定有效態重金屬含量［19］。

1.3 礦渣DNA提取與高通量測序

使用FastDNA Spin kit試劑盒（MP Biomedicals，美國）提取3個礦區礦渣樣品DNA。利用引物515F（5’-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’）和806R（5’- GGACTACVSGGGTATCTAAT-3’）對16S rRNA基因的V4高變區進行PCR擴增，并在廣東美格基因科技有限公司完成擴增子測序。原始序列采用QIIME2平臺（version QIIME 2-202202）進行分析和處理，采用DADA2模塊對低質量和錯誤序列進行去噪，隨后使用Silva數據庫進行物種注釋，并除去線粒體和葉綠體，最終得到不含線粒體和葉綠體的ASV表和物種注釋表［18］。

1.4 統計學分析

本研究所有統計分析及圖形繪制均在R軟件（v4.3.0）中進行。使用vegan包繪制稀釋曲線以確定稀釋深度，得到重抽樣的ASV表。使用vegan包計算不同地區廢棄礦渣樣品的微生物α多樣性（Shannon、PD），利用基于Bray-Curtis相異度的置換多變量方差分析（PERMANOVA）和主坐標分析（Principal Co-ordinates Analysis，PCoA）明確不同地區礦渣微生物群落差異。使用CCA分析計算環境驅動因子對微生物群落結構的影響。使用dplyr包對ASV表中相對豐度＞0.05 %的屬水平物種進行篩選，并通過ggplot2包和pheatmap包繪制門水平相對豐度圖和屬水平熱圖。使用vegan包對土壤理化性質與微生物群落組成之間的相關性進行Mantel檢驗，使用Linket包對Mantel檢驗結果進行可視化。

2 結果與分析

2.1 礦渣理化性質

硫鐵礦礦渣經過長時間堆存后，均存在不同程度的水解風化，黃鐵礦等金屬硫化物氧化產酸是造成區域生態退化和環境污染的重要原因。通過對華南、華中和西北3個典型硫鐵礦區廢棄礦渣pH進行分析（見表1），發現AH、GD和SX樣品的pH存在顯著性差異（Plt;0.05），其平均值分別為2.30±0.22，3.17±0.42，2.70±0.11，遠低于正常土壤pH范圍，極端酸性是造成區域植被退化和生態功能喪失的關鍵原因。AH、GD和SX樣品的產酸潛力均較大，NAG-pH值分別為2.51±0.28，2.95±0.29和2.73±0.11，表明在自然條件下，3個礦區的廢棄礦渣將會持續產酸，造成周邊土壤和水體酸化。AH、GD和SX樣品的γ分別為（3.98±1.52）mS/cm、（1.79±1.87）mS/cm和（1.86±0.83）mS/cm，三者間無顯著差異（Pgt;0.05）。3個地區礦渣在重金屬有效態含量上具有較大的差異。GD礦渣DTPA-Zn、DTPA-Cu和DTPA-Cr質量分數均最高，分別為（0.13±0.67）mg/kg、（4.72±2.21）mg/kg和（0.22±0.06）mg/kg，而SX礦渣DTPA-Fe質量分數為（3 412±1 922）mg/kg，顯著高于其他2個區域。3個地區Zn、Cu和Cr的全量具有顯著差異（Plt;0.05），AH礦渣Cu、Cr和Zn的全量均最高，分別為（51.99±17.02）mg/kg、（111.0±10.5）mg/kg和（145.6±76.8）mg/kg。

3個地區硫鐵礦礦渣在產酸特性和重金屬含量上均存在顯著差異，這可能是由礦石類型、加工工藝、堆存條件和氣候等原因造成的［19-20］。礦石中金屬硫化物含量、種類及加工工藝等會顯著影響礦渣產酸和重金屬溶出，而氣候（如溫度和降水）和堆存條件（導致氧化還原電位差異）會影響功能性微生物（如鐵硫氧化微生物等）的代謝活性，改變礦渣的氧化產酸過程［21］。

2.2 礦渣原核微生物多樣性

3個地區的原核微生物樣品中共含有2 502 483條16S rRNA序列和4 224個ASV。繪制稀釋曲線后，確定以最小樣本的序列數（51 259）進行重抽樣（見圖1-a）），并使用重抽樣后的ASV表進行后續分析。

從α多樣性指數上看，GD樣品原核微生物Shannon指數顯著高于AH樣品（Plt;0.05，見圖1-b）），而3個地區礦渣原核生物譜系多樣性（Phylogenetic diversity，PD）不存在顯著差異（見圖1-c））。雖然GD樣品的物種多樣性相對豐富，但譜系多樣性在3個地區的典型硫鐵礦礦渣中無明顯差異，表明在極端環境中礦渣的物種組成相對穩定，受到一定的自然環境或選擇的篩選［21］。硫鐵礦礦渣及其產生的AMD是極端生境的一種，具有極端酸性、營養貧瘠和重金屬含量高等特點［21-23］。在極端生境中，研究者們發現了大量的古菌、細菌和真菌等微生物，它們逐漸適應極端環境并進化出相應的生存策略［15］。例如：微生物細胞膜通過限制質子進入細胞質或通過二次轉運排出過量質子，從而緩沖細胞內pH，穩定或修復蛋白質結構［23］。在重金屬脅迫環境下，微生物可以通過排出、轉化、絡合等方法增強對重金屬的抗性［24］。由于地理位置、氣候、礦渣組分等差異，硫鐵礦礦渣環境中的微生物群落往往表現出明顯的差異性。在本研究中，GD、AH和SX 3個典型硫鐵礦礦渣中均發現了豐富度較高的原核微生物群落，低緯度地區（GD）礦渣中原核微生物群落的Shannon指數均顯著高于緯度較高的AH和SX地區（Plt;0.05），且GD樣品pH顯著更高（Plt;0.05），說明緯度和pH可能是影響礦渣原核微生物群落Shannon指數的主要因素［25-26］。

2.3 原核微生物群落組成

PCoA分析結果顯示：3個地區礦渣微生物群落組成差異顯著（見圖2，R2 =0.174，Plt;0.001）。3個地區礦渣原核微生物的優勢門水平類群為變形菌門（Proteobacteria）、熱原體門（Thermoplasmatota）和放線菌門（Actinomycetota）（見圖3），其相對豐度分別為15.2 %～61.1 %、4.1 %～41.8 %和9.3 %～15.2 %。此外，AH礦渣厚壁菌門（Firmicutes）相對豐度較高，而GD礦渣中綠彎菌門（Chloroflexi）、泉古菌門（Crenarchaeota）和酸桿菌門（Acidobacteriota）相對豐度較高，SX礦渣硝化螺旋菌門（Nitrospirota）相對豐度較高。不同地區礦渣優勢屬物種（見圖4）為羅爾斯通菌屬（Ralstonia）、硫化芽孢桿菌屬（Sulfobacillus）和鉤端螺旋菌屬（Leptospirillum），均表現出較高相對豐度；GD地區Cupriavidus、Acidiphilium、Acidibacter和Acidothermus等微生物的豐度明顯高于其他地區。

微生物群落的組成往往與其功能密切相關。通過對GD、AH和SX 3個典型硫鐵礦礦渣中微生物群落組成進行分析，發現礦渣中的原核微生物群落以放線菌門（Actinomycetota）和變形菌門（Proteobacteria）為主，這2類門水平微生物包含了較多具有鐵硫氧化及硫還原功能的物種［26］。在好氧環境中，鐵硫氧化細菌氧化黃鐵礦產酸；而在厭氧環境中，黃鐵礦經過硫還原細菌作用生成硫酸鹽，使得礦渣pH有所升高［15］。此外， Ralstonia是酸性礦山環境中的常見嗜酸菌屬，含有豐富的重金屬抗性基因，具有較強的重金屬耐性。Sulfobacillus具有嗜酸和耐高溫等特點，可通過氧化金屬硫化物獲得能量。研究表明，從熱泉中分離出的2株Sulfobacillus細菌可以在45 ℃時氧化黃鐵礦，氧化速率分別達到了63.0 mg/（L·d）和56.8 mg/（L·d），同時還具有較強的氧化單質硫和耐受極端酸性的能力［27-29］。Leptospirillum是一類重要的亞鐵氧化菌，不具有硫氧化能力，在浸礦體系的亞鐵氧化和氧化還原電勢方面發揮重要作用。菌株Leptospirillum ferriphilum Dx-m與Sulfobacillus benefaciens DSM 2705T、Acidithiobacillus caldus DSM 8584T混合后，可以使浸出環境微生物保持更高的活性，提高鉛、鋅浸出效率［30］。

2.4 原核微生物群落組成與環境驅動因子的關系

CCA分析結果表明：第一排序軸和第二排序軸分別解釋了GD、SX、AH樣品細菌群落結構差異的22.92 %和21.26 %，共解釋了44.18 %（見圖5）。DTPA-Cu、DTPA-Cr、DTPA-Zn和pH對GD樣品原核微生物群落的影響較大，呈正相關性，而DTPA-Fe對SX樣品原核微生物群落影響較大，Cr、Zn、Cu、DTPA-Fe和γ與AH樣品原核微生物群落呈正相關。Mantel檢驗結果表明，pH、γ、DTPA-Zn、DTPA-Cr、Cu、年均降水量和年均氣溫顯著影響3個地區的原核微生物群落組成（Plt;0.01）（見圖6）。

pH會影響微生物細胞膜的內外滲透壓、膜表面電荷和蛋白功能，導致不同物種對pH的適應情況存在差異，是影響微生物群落結構的關鍵因素之一［31］。Cr、Zn和Cu等重金屬元素對微生物群落的影響也十分顯著，這是由不同物種對重金屬毒性的耐受性差異導致的［32］。有研究表明，細菌對重金屬的敏感性明顯高于真菌，原核微生物中的變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinomycetota）、厚壁菌門（Firmicutes）和綠彎菌門（Chloroflexi）等對重金屬耐受性更強［31，33］，這也與本文的物種組成情況相呼應。

微生物群落組成存在顯著的生物地理分布模式，降水量和溫度是主要影響因素。有研究發現，降水量會直接影響土壤的水分條件，進而影響微生物的活性和多樣性。降水增加可能會提高土壤水分的可用性，促進微生物生長，而降水減少則可能導致土壤干旱，抑制微生物活動，降低微生物多樣性［34］；此外，溫度會顯著影響土壤微生物代謝活性，尤其是生長和呼吸作用［29］。

3 結 論

本研究將安徽、廣東和陜西作為華中、華南和西北3個地區的典型硫鐵礦區，分析了不同地區礦渣的理化性質和原核微生物多樣性及其群落組成，同時揭示了影響硫鐵礦礦渣微生物群落結構的環境驅動因子。

1）3個地區礦渣都具有較強的酸性，且都具有較強的產酸能力。不同地區pH、NAG-pH、重金屬全量及有效態含量存在顯著差異（Plt;0.05），表明礦渣的理化性質受地理位置、氣候和礦石類型等因素影響。

2）GD地區硫鐵礦礦渣微生物Shannon指數顯著高于AH和SX（Plt;0.05），不同地區微生物群落組成差異顯著（Plt;0.05）；AH、GD和SX地區的優勢門物種為變形菌門（Proteobacteria）和放線菌門（Actinomycetota），優勢屬物種為羅爾斯通菌屬（Ralstonia）、硫化芽孢桿菌屬（Sulfobacillus）和鉤端螺旋菌屬（Leptospirillum）。變形菌門（Proteobacteria）的羅爾斯通菌屬（Ralstonia）具有耐重金屬的特性；厚壁菌門（Firmcutes）的硫化芽孢桿菌屬（Sulfobacillus）和硝化螺旋菌門（Nitrospirota）的鉤端螺旋菌屬（Leptospirillum）均具有耐酸和鐵或硫氧化等功能。

3）在影響礦渣微生物群落結構形成和組成的過程中，作為主要驅動力的環境因子包括年均氣溫、年均降水量、pH、γ、DTPA-Zn、DTPA-Cr和Cu等（Plt;0.05）。不同微生物對重金屬和環境pH的耐受效果不同，溫度和降水則會影響到微生物的活性。

4）研究分析了典型硫鐵礦礦渣的微生物群落組成及其與環境驅動因子的關系，有助于開發基于微生物的生態修復策略，為硫鐵礦礦渣的環境治理和生態修復提供了理論依據。

［參 考 文 獻］

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Microbial community composition and environmental drivers in typical pyrite tailings

Abstract：This study investigates the physicochemical properties，microbial community diversity，species composition，and environmental drivers of pyrite tailings from 3 locations：Yunfu City in Guangdong （GD），Hefei City in Anhui （AH），and Ankang City in Shaanxi （SX） in China.Results indicate significant differences （Plt;0.05） in pH，NAG-pH，and total and available heavy metal contents among regions.GD pyrite tailings exhibit a significantly higher microbial Shannon index compared to AH and SX （Plt;0.05），and distinct microbial community compositions （Plt;0.05）.Dominant phyla include Proteobacteria and Actinomycetota，while key genera such as Ralstonia，Sulfobacillus，and Leptospirillum demonstrate acid tolerance，heavy metal resistance，and iron-sulfur oxidation.The main environmental drivers influencing microbial community structure and composition include average annual temperature，average annual precipitation，pH，γ，DTPA-Zn，DTPA-Cr，and Cu.These findings provide theoretical support for pyrite tailings management and environmental restoration.

Keywords：pyrite tailings;physicochemical factors;16S rRNA sequencing;microbial community;community diversity;environmental driver