不同生物炭對巨大芽孢桿菌與銅綠假單胞菌解磷能力的影響

摘要：為探究生物炭添加對解磷菌生長及其解磷能力的影響，本研究選取土壤中廣泛存在的巨大芽孢桿菌與銅綠假單胞菌兩種解磷菌為研究對象，系統探究在300、500 ℃和700 ℃下制備的雞骨、水葫蘆和水稻生物炭對兩種解磷菌單菌體系及混合體系中可溶磷含量的影響。結果表明，在巨大芽孢桿菌的單菌體系中，添加700 ℃雞骨生物炭解磷效果最好；在銅綠假單胞菌的單菌體系中，添加300 ℃水稻生物炭解磷效果最好。在混合體系中，當巨大芽孢桿菌與銅綠假單胞菌的體積比為1∶1、1∶3時，添加300 ℃水葫蘆生物炭解磷效果最好；而當體積比為3∶1時，添加300 ℃水稻生物炭解磷效果最好。皮爾遜相關性分析結果表明，生物炭的總有機碳（TOC）、碳（C）和氮（N）含量越高及孔徑越大，越有助于提升解磷菌的解磷能力。因此，選擇在300 ℃熱解植物類生物質制備生物炭，有助于優化其碳、氮含量和孔隙結構，提升解磷菌解磷能力，從而在土壤改良和農業生產中發揮重要作用。

關鍵詞：生物炭；解磷菌；單菌體系；混菌體系；溶磷

中圖分類號：S154.3；S156.2 文獻標志碼：A 文章編號：1672-2043（2024）11-2668-12 doi：10.11654/jaes.2024-0367

磷是植物生長與代謝必需的三大營養素之一[1]，磷素的缺乏會嚴重影響植株的生長發育，如抑制葉綠體能量的轉化和代謝，降低作物產量。然而，土壤中約95%的磷素難以被植物直接吸收利用[2]，這主要是因為土壤中的磷大部分以難溶性磷形式存在，生物有效性低[3]。傳統磷肥的大量施用不僅會導致磷礦資源的枯竭，還易產生二次污染。尋找一種綠色高效的土壤磷素利用率提升方法仍是當前研究的一個難點。

解磷菌廣泛存在于土壤中，可通過分泌有機酸、磷酸酶及質子將土壤中的難溶性磷轉化為植物可吸收利用的磷[4]，在維持土壤磷平衡，促進作物生長等方面發揮著重要作用[5]。生物炭是生物質在缺氧或無氧條件下熱解產生的富碳物質[6]，因其獨特的結構特征和理化性狀已被廣泛應用到土壤改良中[7]。有研究表明，生物炭的添加可通過增加營養物質和生存空間來提高微生物在土壤中的生物量[8]和多樣性[9]。此外，生物炭與解磷微生物的協同應用也可以顯著提高土壤磷的有效性[10]，這主要是因為大多數生物炭比表面積大，孔隙度高，且擁有豐富的礦質元素和有機質[11]。其施用不僅可以為解磷微生物提供碳氮源，還可以提供充足的生存空間，從而增強解磷微生物的活性、增加土壤中有效磷的含量，提高農作物的產量和品質[12]。例如，玉米秸稈生物炭的施用可增強巨大芽孢桿菌、曲霉菌、歐文氏菌等解磷微生物的豐度與活性，這些微生物通過分泌有機酸、磷酸酶和植酸酶將土壤中的難溶性無機磷轉化為可被作物吸收利用的有效態磷[13]。然而，不同類型土壤中解磷菌的種類和數量可能存在較大差異。例如，農田土壤系統中的芽孢桿菌約占土壤微生物總量的80%，而林地土壤中以假單胞菌（58.8%）為優勢菌種[14]。土壤類型的差異導致了不同的解磷菌群落結構、相對豐度及種間關系，生物炭作用下解磷菌的解磷效果是否也會因解磷菌菌群結構的不同而導致較大差異等一系列問題仍不清晰。

因此，本文擬選取常見的解磷菌，即巨大芽孢桿菌和銅綠假單胞菌為研究對象，通過添加不同裂解溫度（300、500、700 ℃）下制備的不同生物炭（雞骨、水葫蘆、水稻秸稈生物炭），系統探究生物炭作用下上述兩種解磷菌單菌體系和混合體系中可溶磷含量的變化，尋找不同解磷菌配比下最優的生物炭添加種類，為土壤磷素活化提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 生物炭的制備與表征

將雞骨、水葫蘆和水稻秸稈去除雜質后洗凈曬干并粉碎過10 目篩。取各原料約（50±0.05）g 置于烘箱，105 ℃烘干至質量恒定。預處理后的雞骨、水葫蘆、水稻秸稈放入馬弗爐內通入流速為100 mL·min-1的氮氣30 min 后，以10 ℃ · min-1 的速率升溫至300 ℃、500 ℃和700 ℃并分別維持4 h，冷卻后取出生物炭，并將所得生物炭研磨后過100目篩，干燥避光保存。

采用總有機碳分析儀（Vario TOC，Elementar，德國）測定生物炭中的TOC；采用有機元素分析儀（Vario EL Cube，Elementar，德國）測定生物炭中C、H、O、N和S元素的含量；使用全自動比表面及孔隙度分析儀（ASAP 2460，Micromerities，美國）測定生物炭的比表面積、孔體積及孔徑；使用掃描電子顯微鏡（TES?CAN MIRA LMS，捷克）對生物炭進行微觀形貌分析；使用傅里葉紅外光譜儀（Nicolet iN10，Thermo FisherScientific，美國）測定生物炭的表面官能團；使用電子順磁共振波譜儀（EMXplus-6/1，Bruker，德國）分析生物炭上的環境持久性自由基信號強度。

1.2 菌種的活化、保存與培養

解磷微生物，即巨大芽孢桿菌（Bacillus megathe?rium，1.10466）和銅綠假單胞菌（Pseudomonas aerugi?nosa，1.926）均購買于中國普通微生物菌種保藏管理中心。解磷微生物菌株經斜面培養基活化處理后使用一次性接種環取一環菌株劃線于溶菌肉湯（LB）平板培養基，置于30 ℃的恒溫培養箱中培養，5 d一次平板接種保存。

先用一次性接種環自LB平板取一環巨大芽孢桿菌（或銅綠假單胞菌）菌種接種至裝有30 mL LB液體培養基的三角瓶中，于30 ℃恒溫條件下振蕩（200 r·min-1）培養18 h作種子液。再取1 mL種子液接種至盛有30 mL LB培養基的三角瓶中，于30 ℃恒溫條件下振蕩（200 r·min-1）培養，最后使用O.D. 600 測量法[15]，即0～56 h 內每隔4 h 取樣，在紫外分光光度計（UV-vis，UV-2600，SHIMADZU，日本）600 nm的波長下測定不同時段培養液的吸光度，并以此為依據繪制生長曲線。結果發現（圖1），巨大芽孢桿菌的遲緩期、對數期、穩定期和衰亡期依次為0～10、10～24、24～36、36～56 h；而銅綠假單胞菌的遲緩期為0～8 h，對數期為8～20 h，穩定期為20～36 h，衰亡期為36～56 h。此外，兩種解磷菌在生長過程中的pH值呈先降低后增長再降低的趨勢。

1.3 生物炭與菌種混合體系暴露實驗

向兩瓶裝有滅菌的LB 培養基的150 mL 錐形瓶內各接種巨大芽孢桿菌和銅綠假單胞菌4環，在30 ℃恒溫條件下振蕩（200 r·min-1）培養14 h至對數期，作為兩種菌的種子液。分別投加不同種類生物質（雞骨、水葫蘆、水稻秸稈）在不同制備溫度下（300、500、700 ℃）制備的生物炭至裝有30 mL無機磷液體培養基的錐形瓶內，生物炭的投加劑量依次為30、60、90、120 mg 和150 mg，將生物炭和培養基混合后進行高溫滅菌處理。以總體積為4 mL的接種量依次添加巨大芽孢桿菌∶銅綠假單胞菌為1∶0、0∶1、1∶1、1∶3、3∶1的細菌種子液至加入生物炭并滅菌的無機磷液體培養基中，在30 ℃恒溫下振蕩（200 r·min-1）培養31 h至衰亡期。反應結束后取上清液，按照GB 11893—1989 鉬酸銨分光光度法，用紫外分光光度計（UV-2600，日本）于700 nm處測定其吸光度，計算培養液中磷酸鹽含量。實驗以超純水代替試樣，并加入與測定時相同體積的試劑作為空白試驗，每組3個平行。

1.4 生物炭對磷的吸附修正實驗

分別投加90 mg 的不同熱解溫度（300、500、700 ℃）下制備的不同種類生物炭（雞骨、水葫蘆、水稻生物炭）于100 mL 錐形瓶中，加入100 mL 濃度為50 mg·L-1 的磷酸鹽溶液，用0.5 mol·L-1 的HCl（或NaOH）調節溶液pH值在7±0.2。將樣品置于25 ℃的恒溫振蕩機上，以160 r·min-1的頻率進行連續振蕩，分別于1、3、5、9、12、24、48 h 時，在各錐形瓶中取出0.5 mL 的樣品，用0.45 μm 微濾膜過濾0.25 mL 到25mL比色管中，用超純水稀釋至標線。每組設置3個平行，分別測定雞骨、水葫蘆和水稻生物炭上清液中的正磷酸鹽含量。并使用準一級動力學方程和準二級動力學方程對數據進行擬合。最后，計算得到的平衡吸附量，代表解磷菌解磷后被生物炭吸附的正磷酸鹽含量減去生物炭自身析出的磷酸鹽含量，與暴露實驗處理中對應測得的溶液中的磷酸鹽含量相加，即為解磷菌轉化的可溶磷含量。

準一級動力學方程：

Qt = Qe ×（1- e-K1 × t ）

準二級動力學方程：

Qt =（ K2 × Q2e× t ） / （1+ K2 × Qe × t ）

式中：Qt 為t 時刻溶液中磷酸鹽的吸附量，mg·g-1；Qe為吸附平衡時溶液中磷酸鹽的吸附量，mg·g-1；K1為準一級吸附速率常數，h-1；K2為準二級吸附速率常數，g·mg-1·h-1。

1.5 數據分析與處理

本研究采用Excel 2019 對相關實驗數據進行記錄與整理，采用SPSS 26.0進行單因素方差分析、相關性分析以及差異顯著性檢驗，并結合Origin 2022進行圖形繪制。

2 結果與討論

2.1 生物炭的表征分析

由表1可知，隨著熱解溫度的增加，三種生物炭的產率、總有機碳（TOC）、碳（C）、氮（N）含量和氫碳比（H/C）皆逐漸降低。這是因為高溫熱解導致生物炭中的脂肪族含量和含氧官能團分解揮發，從而使生物炭濃縮和芳香化程度增加[16]。此外，雞骨生物炭的產率高于水稻生物炭和水葫蘆生物炭，然而其碳含量卻低于水葫蘆生物炭和水稻生物炭。這可能是因為水稻和水葫蘆均為植物類生物質，主要以纖維素、半纖維素和木質素為主，這些組分在熱解過程中絕大部分會分解為CO、CO2和H2O等氣體產物，因此其生物炭的產率相對較低。同時，水稻和水葫蘆生物質中的纖維素含有大量的含氧官能團（如OH），隨著熱解溫度升高，生物質會發生脫水、脫羰基的反應，造成H、O元素丟失，C含量升高[17]。

由表2可知，在700 ℃時，水葫蘆和水稻生物炭的比表面積和孔體積快速增大，而雞骨生物炭的比表面積則隨著溫度的升高呈先增加后減小的趨勢。這主要是因為低溫下水葫蘆和水稻秸稈中的纖維素、半纖維素和木質素分解不完全，而高溫使纖維素、半纖維素和木質素等主要組分通過脫水、裂解和芳香化等熱分解作用，形成H2O、CO和CO2等氣體，且隨著有機物結構的破壞和氣體釋放，生物炭表面形成了更豐富的孔隙結構和更大的比表面積[18]。另外，由于雞骨當中的低分子有機化合物和骨膠原在450 ?C以上高溫不穩定，容易分解，熱解后生物炭中部分孔隙被鈣的氧化物堵塞，導致其比表面積先增加后減小，而平均孔徑先下降后維持基本不變[19]。

由圖2可知，300 ℃雞骨生物炭形貌粗糙，幾何形狀不明，表面孔隙很少或沒有；當溫度增加至500 ℃時，由于雞骨當中的低分子有機化合物脫水揮發，其表面紋理變得更加粗糙和多孔，而在700 ℃，由于炭結構的收縮和重新排列[20]，其表面相對500 ℃時平坦，表面積有所減少。300 ℃水葫蘆生物炭表面較粗糙，并堆積很多不規則的片狀物，這是因為生成了較多木焦油沉積[21]；500 ℃時，水葫蘆和木焦油等物質進一步被熱解，生物炭表面逐漸光滑，700 ℃時，生物炭的微孔結構增多。300 ℃水稻生物炭表面規則，呈管狀結構；溫度升至500 ℃時，其孔隙結構更加致密規則，孔數量明顯增加；而在700 ℃時，由于凝聚芳香結構的沉積和內部孔隙結構的坍塌[22]，其表面變形，部分孔隙被堵塞，孔隙體積減少。

由圖3可知，隨著熱解溫度的升高，3種生物炭的各種含氧官能團如羥基（ OH）、醚鍵（C O C）和羰基（C O）的吸收峰強度均有明顯的降低。300 ℃的雞骨生物炭、水稻生物炭和水葫蘆生物炭均有明顯的生物高分子聚合物上的脂肪族C H（2 922～2 924cm-1），而其他熱解溫度的生物炭則沒有此峰。這是因為隨著溫度升高，生物炭中的有機質逐漸分解，且較高的熱解溫度使得脫氫反應加劇，生物炭的芳香化程度逐漸增強[23]。此外，只有雞骨生物炭在563 cm-1有較高磷酸鹽振動的峰值，這是因為羥基磷灰石是雞骨的主要無機成分[24]。

由圖4 可知，3 種生物炭的環境持久性自由基（EPFRs）信號強度呈現先增強（300～500 ℃）后降低（700 ℃）的趨勢。這是因為生物質中的木質素、纖維素、半纖維素和酚類化合物等有機化合物是生物炭中EPFRs 形成的主要前體，在300～500 ℃，這些組分在熱解過程中可能被分解形成芳香族分子前體，暴露于空氣后轉化為EPFRs，而當熱解溫度進一步升高至600 ℃時，生物質中的有機化合物（EPFRs形成所需的主要成分）分解，環境持久性自由基信號強度顯著降低[25-26]。

2.2 單菌體系中不同種類生物炭對解磷菌解磷能力的影響

試驗結果（圖5、圖6）表明，除700 ℃水葫蘆生物炭外，添加生物炭均不同程度地提高了培養基中的可溶磷含量。在巨大芽孢桿菌單菌體系中，與對照組（CK1）相比，300、500、700 ℃雞骨生物炭處理的可溶磷含量分別提升了2.64、1.92、2.91 倍；300、500 ℃水葫蘆生物炭處理分別提升了0.69、0.40倍；300、500、700 ℃水稻生物炭處理分別提升了0.71、0.62、0.66倍。故在巨大芽孢桿菌體系中700 ℃雞骨生物炭解磷效果最佳。在銅綠假單胞菌體系中，相應的提升倍數為：雞骨生物炭0.56、0.53、0.53 倍；水葫蘆生物炭0.54、0.17 倍；水稻生物炭0.59、0.57、0.54 倍，其中300 ℃水稻生物炭解磷效果最優。

研究表明，生物炭的添加極大地提高了解磷菌的解磷量。這可能是因為生物炭在解磷菌的解磷過程中具有重要的緩沖作用，促進了解磷菌的產酸能力[27]，而酸化已被報告為微生物溶解磷的主要模式[28]。同時，巨大芽孢桿菌的解磷能力顯著優于銅綠假單胞菌，一方面，這可能是因為巨大芽孢桿菌在生長發育過程中的pH值低于銅綠假單胞菌（圖1），pH值越低，說明解磷菌分泌的有機酸越多[29]。而銅綠假單胞菌和巨大芽孢桿菌主要通過排泄有機酸，如檸檬酸、蘋果酸和羧酸將難溶性磷轉化為可溶磷[30]，因此pH值越低解磷量越高。這與大多數文獻報道情況一致，即微生物的高磷溶解通常與它們生長的培養基的pH值降低有關。如Wani等[31]發現pH值與無機磷（磷酸鈣）的增溶之間存在顯著的負相關。另一方面，巨大芽孢桿菌作為革蘭氏陽性菌，其細胞壁（30～100nm）比作為革蘭氏陰性菌的銅綠假單胞菌（幾納米）厚得多[32]，可能對生物炭中的重金屬、EPFRs等物質有較強的抗逆性。

2.3 不同種類生物炭對混合菌種配比解磷能力的影響

由圖7可知，與CK1組相比，300、500 ℃和700 ℃的雞骨、水葫蘆、水稻生物炭處理可溶磷含量分別提升了0.87、0.85、0.80倍，0.88、0.86、0.60倍；0.80、0.75、0.62倍。同樣地，圖8也顯示出相似的結果，300 ℃水葫蘆生物炭的平均解磷量最高。因此，在巨大芽孢桿菌∶銅綠假單胞菌為1∶1及1∶3的體系中，300 ℃水葫蘆生物炭處理后可溶磷含量提升效果最佳。而由圖9可知，在巨大芽孢桿菌∶銅綠假單胞菌為3∶1的體系中，300 ℃水稻生物炭處理后可溶磷含量提升效果最佳，相比CK1組提升了0.89倍。此外，可以看出混合體系中解磷菌的解磷能力低于單菌體系。這可能是因為假單胞菌和芽孢桿菌這兩個屬的成員之間存有競爭的相互作用，一般觀點認為假單胞菌通常是具有進攻性的[33]。如Bassarello等[34]發現假單胞菌的環狀脂肽（CLP）具有致命性和特異性，其丁香素22A、丁香霉25A、蝴蝶素等均能抑制巨大芽孢桿菌。

2.4 不同種類生物炭對磷酸鹽的吸附特征

在濃度為50 mg·L-1 的磷酸鹽溶液中，300、500、700 ℃的水葫蘆、水稻生物炭及700 ℃雞骨生物炭的準一級動力學模型展現出比準二級動力學模型更高的擬合度（R2，表3），而對于300 ℃和500 ℃的雞骨生物炭，準二級動力學模型則展現出比準一級動力學模型更高的擬合度（R2）。因此，準二級動力學方程更適合描述300 ℃和500 ℃雞骨生物炭的磷吸附動力學特征，其余生物炭則適用準一級動力學模型來擬合參數。這表明300 ℃和500 ℃雞骨生物炭對磷的吸附主要是化學反應，其余生物炭對磷的吸附主要是物理吸附[35]。此外，不同生物炭對磷的吸附容量差異較大，其中，水稻和水葫蘆生物炭的吸附容量整體優于雞骨生物炭。這可能是因為不同原料制成的生物炭具有不同的吸附強度和親和力，且熱解條件也會影響生物炭的化學性質，如比表面積，這是影響磷吸附的主要因素之一[36]。

2.5 相關性分析

相關分析表明，解磷菌的解磷量與生物炭的孔徑、TOC、C、N呈正相關，與比表面積、孔體積、EPFRs信號呈負相關。然而，由于生物炭眾多組分的綜合影響，很難確定與解磷菌解磷量顯著相關的單一組分。如生物炭的表面官能團可能是一個重要影響因素，因為羧基和羥基等基團的存在促進了細菌細胞的黏附和增殖，進而影響解磷效果[37]。

生物炭孔徑與解磷量為正相關，理論上孔徑大小為微生物尺寸的2～5倍時有利于微生物生存。一方面，較大的孔徑可以起到儲存微生物代謝所需的水分和營養物質的作用，另一方面，豐富的孔隙結構可以為微生物提供有利的生態位，使微生物的多樣性及解磷菌的phoC 和phoD 基因豐富度、均勻度皆顯著上升[38]，有助于提高解磷菌的解磷量。TOC、C、N 均與解磷量為正相關關系，這是因為碳源和氮源是微生物的主要營養物質，供給不同的碳源、氮源會影響微生物的生長與代謝，繼而影響其解磷能力[39]。如Nauti?yal等[40]報道，當葡萄糖被用作碳源時，微生物會產生更多的有機酸，這會導致更多的不溶性磷溶解，而大多數芽孢桿菌在以淀粉為碳源時解磷能力最差。同時，氮可以通過參與氨基酸、蛋白質和核苷酸的合成等影響磷的溶解[41]。解磷菌解磷量與比表面積、孔體積、EPFRs信號呈負相關，這是因為生物炭較大的比表面積會吸附許多無機營養物質（如NH+4，HPO-2）和溶解性的有機碳[42]，而生物炭中的半醌、環戊二烯基等EPFRs可誘導產生羥基自由基、超氧自由基和過氧化氫等活性氧，并通過氧化應激降低細胞過氧化物酶和超氧化物歧化酶活性，使解磷菌細胞活性降低甚至失活[43]。

鑒于芽孢桿菌與假單胞菌在實際環境中常共存，本文著重探討混合菌種中生物炭性質與解磷菌解磷量之間的關系。在巨大芽孢桿菌∶銅綠假單胞菌為1∶1及1∶3的體系中，添加300 ℃水葫蘆生物炭解磷效果最佳，這是因為該體系下生物炭性質與解磷菌解磷量的相關性順序依次為TOCgt;元素Ngt;孔徑gt;元素C，水葫蘆生物炭的TOC含量與解磷菌解磷量的相關性最強，這可能是因為水葫蘆生物質中纖維素（55%）和半纖維素（19%）是其主要成分[44]，熱解以后的主要產物左旋葡聚糖能直接被微生物代謝或經水解為葡萄糖后被微生物代謝[45]，提供有效的碳源促進解磷菌的生長與解磷。同理，300 ℃水稻生物炭在巨大芽孢桿菌∶銅綠假單胞菌為3∶1的體系中表現出最優的解磷效果，也是因為其TOC 與解磷菌解磷量之間依然存在著最強的相關性，而水稻秸稈中纖維素（39.96%±3.19%）和半纖維素（14.68%±1.96%）也比較豐富[46]，熱解產物同樣能為解磷菌生長代謝提供有效碳源。

3 結論

（1）添加適量的不同熱解溫度制備的生物炭可以顯著提高巨大芽孢桿菌和銅綠假單胞菌的解磷量。其中，生物炭對解磷菌解磷能力產生促進作用的主要影響因子為生物炭的TOC、C、N含量和孔徑。

（2）在單菌體系中，巨大芽孢桿菌的解磷效果最好，然而，由于巨大芽孢桿菌和銅綠假單胞菌之間存在拮抗作用，混合體系的解磷效果則顯著低于單菌體系。

（3）在混合體系中，不同菌種比例皆添加300 ℃熱解的植物類生物質制備的生物炭時解磷菌解磷效果最佳。因此，在實際應用中，建議選擇纖維素含量高的植物類生物質，并采用300 ℃的低溫熱解，以優化生物炭的碳、氮含量和孔隙結構，同時減少自由基生成，降低對解磷微生物的毒害作用，從而有效促進解磷菌的生長和解磷。

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（責任編輯：葉飛）