韭菜珠芽高效離體再生體系的建立

摘要以田間發現的韭菜植株花托上部特異性芽體（稱其為珠芽）為外植體，對其進行組織培養，通過對不同激素配比的研究，建立韭菜珠芽的再生體系。結果表明，使用10%次氯酸鈉溶液消毒7min，消毒效果最佳，無菌率可達82.32%，MS+1.5mg/L6-BA+0.4mg/L2，4-D為最佳不定芽誘導培養基，其不定芽誘導率為78.52%，MS+2.0mg/L6-BA+0.5mg/LNAA為最佳不定芽伸長培養基，不定芽伸長率可達86.63%，1/2MS+0.5mg/LIBA為最佳生根培養基，生根頻率為88.20%，其移栽成活率可達95%以上。

關鍵詞韭菜；特異性芽體；珠芽；組織培養

中圖分類號S633.3"文獻標識碼A"文章編號0517-6611（2024）24-0042-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.24.010

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

EstablishmentofanEfficientinvitroRegenerationSystemofBulbelofChinesechive

ZHANGZi-juan，WANGChang-hao，ZHANGGui-hai"etal

（LangfangAcademyofAgriculturalandForestrySciences，Langfang，Hebei065000）

AbstractInthisstudy，thespecificbudontheupperpartofthereceptacleofChinesechiveplant（calledbulbil）foundinthefieldwasusedastheexplantfortissueculture.Throughthestudyofdifferenthormoneratio，theregenerationsystemofChinesechivebulbilwasestablished.Theresultsshowedthatusing10%sodiumhypochloritesolutionfor7minhadthebestdisinfectioneffectandthesterilityratewas82.32%，MS+1.5mg/L6-BA+0.4mg/L2，4-Dwasthebestmediumforadventitiousbudinduction，andtheadventitiousbudinductionratewas78.52%.MS+2.0mg/L6-BA+0.5mg/LNAAwasthebestmediumforadventitiousbudelongation，andtheelongationofadventitiousbudreached86.63%，and1/2MS+0.5mg/LIBAwasthebestrootingmedium，therootingfrequencywas88.20%，thesurvivalrateoftransplantingwasmorethan95%.

KeywordsChinesechive;Specificbud;Bulbil;Tissueculture

韭菜，又名草鐘乳、起陽草，為百合科蔥屬多年生宿根草本植物，原產于中國，在我國已有3 000多年的栽培歷史^［1］。韭菜的葉片、花葶、假莖、花均可食用，其以獨特的辛辣味、豐富的營養物質、較多的粗纖維而深受消費者喜愛^［2-3］。我國是韭菜種植生產大國，目前韭菜育種方式多為常規育種，如雜交育種、優勢育種等，育種周期較長，所需人力物力相對較多^［4］。相對于傳統的育種方式，將組織培養技術與育種技術相結合，利用韭菜器官組織培養獲得再生植株，對于種質材料的保存、拯救瀕危資源、縮短育種年限、提高育種效率都有積極意義^［5-6］。在韭菜組織培養研究中，有以韭菜根尖^［7］、葉片^［8］、花托^［9-10］等器官為外植體的相關研究，而筆者以田間偶然發現的韭菜植株花托上部特異性芽體（稱其為珠芽）為外植體，其外觀為紫紅色、形態飽滿，以這種田間發現的材料為外植體，旨在探究出一套適合其組織培養的快速繁殖體系，為以后田間發現的變異株、特異株進行留種、保種、育種提供一種可行的方法。

1材料與方法

1.1基本培養基

選用MS（全配）培養基，pH調至5.8；所有培養基經120℃滅菌20min，植物激素經過濾滅菌后添加到受試培養基。接種后均放到培養間中進行組織培養。

1.2試驗材料

供試材料來源于河北省廊坊市農林科學院蔬菜研究所，韭菜品種為蔬菜研究所培育的PX系列。試驗材料為試驗基地田間偶然發現的、花盤上長出的特異性芽體。于晴天上午對長勢健壯、無病害的韭菜植株進行取材。

1.3試驗方法

1.3.1無菌外植體的獲得。

將花托基部順著珠芽長勢將其逐一分開，用手術刀片將其表面刮干凈。先于自來水下沖洗1～2h，再在超凈工作臺上，用75%乙醇消毒4～5min，然后采用以下不同消毒處理：10%次氯酸鈉溶液消毒3min（A）；10%次氯酸鈉溶液消毒5min（B）；10%次氯酸鈉溶液消毒7min（C）；10%次氯酸鈉溶液消毒9min（D）。10%次氯酸鈉溶液消毒后均用無菌水沖洗4～6次，再用無菌濾紙吸干珠芽表面水分，將消毒后萎蔫的苞片剝去，切去基部變腐部位，將剩余材料進行接種。7～14d后，統計外植體的無菌率。

1.3.2不定芽誘導。

將確認無菌的珠芽，接種至附含不同濃度6-BA（1.0、1.5、2.0mg/L）和2，4-D（0.2、0.4、0.6mg/L）的MS培養基中進行不定芽誘導。21～28d后統計不定芽誘導率。

1.3.3

不定芽伸長。將經不定芽誘導后的材料接種至不定芽伸長培養基中，使其伸長到一定高度，便于后期生根與移栽。以不同濃度的6-BA和NAA進行不定芽伸長研究，以確定不定芽有效伸長的最佳配方。

將誘導出的不定芽轉接至附含不同濃度6-BA（1.0、1.5、2.0mg/L）和NAA（0.5、1.0、1.5mg/L）組合的MS培養基上。10～15d后統計不定芽伸長率。

1.3.4不定根誘導。

選取長勢健壯的試管苗（3.0～4.0cm），通過MS（A）、1/2MS（B）、1/2MS+0.5mg/LIBA（C）進行不定根誘導，15d后開始統計每種方法的生根情況，25d后統計生根率，探索出生根頻率較高的方法。

1.3.5煉苗與移栽。

當試管苗的根長至4.0～5.0cm時，去掉組培瓶瓶蓋，倒入少量無菌水，煉苗3～4d后將試管苗移栽到棚室中進行栽培，觀察生長情況。

1.4數據統計

無菌率=無菌外植體數/接種數×100%

不定芽誘導率=誘導出不定芽的外植體數/接種數×100%

不定芽伸長率=伸長的不定芽數/接種數×100%

生根率=生出根系的幼苗數/接種數×100%

2結果與分析

2.1無菌外植體的獲得

設置4種不同消毒方式進行消毒，以探究珠芽最佳消毒方式。由圖1可知，使用10%次氯酸鈉溶液消毒3min的方法A珠芽無菌率較低，為16.98%，珠芽表面狀態較好。此方法中，雖然次氯酸鈉溶液對芽體傷害較小，但無法獲得有效的無菌外植體。使用10%次氯酸鈉溶液消毒5min的方法B，其消毒效果相對于方法A，無菌率有所提升，珠芽表面苞皮軟化。使用10%次氯酸鈉溶液消毒

7min的方法C消毒效果最佳，無菌率達82.32%，芽體變軟，將表面苞皮去除后，里面部分仍保留完好（圖2C）。使用10%次氯酸鈉溶液消毒9min的方法D消毒效果最差，芽體腐爛程度較嚴重，即使去除苞皮后，可用材料較少。因此，使用10%次氯酸鈉溶液消毒7min，消毒效果最佳，為珠芽的最佳消毒方式。

2.2不定芽誘導

將獲得的無菌外植體，進一步轉接至不定芽誘導培養基中，以提高誘導率。將植物激素6-BA與2，4-D結合，可使外植體在誘導不定芽的同時，芽體基部與培養基接觸部位也伴隨著愈傷的形成，在愈傷組織上會長出較多的不定芽，可提高誘導效率（圖2D、E）。由表1可知，當6-BA濃度為1.0mg/L時，不定芽誘導率隨著2，4-D濃度升高而升高，整體不定芽誘導效果欠佳，基部愈傷組織較少；當6-BA濃度為1.5mg/L時，不定芽誘導率隨著2，4-D濃度升高先升高后降低，不定芽誘導率在2，4-D濃度為0.4mg/L時達到最大，為78.52%，高于2，4-D0.6mg/L時的不定芽誘導率（74.24%），誘導出的不定芽翠綠，基部愈傷組織致密，芽點較多；當6-BA濃度為2.0mg/L時，不定芽誘導率隨著2，4-D濃度升高而呈降低趨勢，不定芽較少，基部愈傷組織較疏松，有些呈水漬狀，芽點較少。因此，MS+1.5mg/L6-BA+0.4mg/L2，4-D條件下誘導不定芽效果最好，其不定芽誘導率為78.52%。

2.3不定芽伸長

將上述誘導出的長至1～2cm的不定芽轉入不定芽伸長培養基中，進行伸長培養。結果發現，若將長出的不定芽切下，直接插入不定芽伸長培養基中，不定芽會變軟、變黃，直至枯萎；若將誘導出的不定芽連同基部愈傷組織一同轉入伸長培養基中，葉片伸長效果較好，顏色翠綠，生長旺盛（圖2F）。

將6-BA與NAA結合，可有效促進韭菜不定芽的伸長。由表2可知，當6-BA濃度為1.0與1.5mg/L時，隨著NAA濃度的升高，不定芽伸長率呈升高趨勢；當6-BA濃度為2.0mg/L時，隨著NAA濃度的升高，不定芽伸長率呈下降趨勢，但整體伸長率仍較高，伸長的葉片長勢也較好，在6-BA濃度為2.0mg/L、NAA濃度為0.5mg/L時，不定芽伸長率最高，可達86.63%，不定芽長勢較健壯，伸長的葉片形態寬，顏色深綠，長勢良好。在6-BA濃度為2.0mg/L和NAA濃度為1.5mg/L時，2種激素濃度均較高的情況下，雖然不定芽伸長率仍較高，但部分組培苗葉片會發生矮化現象，在基部

呈螺旋狀生長，與市場對韭菜直立性的要求不符。因此，不定芽伸長的最佳培養基配方為MS+2.0mg/L6-BA+0.5mg/LNAA。

2.4不定根誘導

為了探究韭菜組培苗的最佳生根方法，設計了3種不同的生根方式。將長至3.0～4.0cm的組培苗轉接至不定根誘導培養基中，13d后，基部有乳白色點狀凸起，30d時可見大部分組培苗均生根（圖3A、B）。由表3可知，采用不加任何植物激素的MS（全配）培養基的方法A，生根頻率最低，生根啟動最慢，長出的根較細、白。采用不加任何植物激素的1/2MS（全配）培養基的方法B，生根頻率大幅提高，為84.77%。采用1/2MS（全配）培養基，并添加0.5mg/LIBA的方法C，生根頻率有所提高，為88.20%，雖然方法C與方法B中的生根頻率相差較小，但生根啟動時間明顯縮短，且根長勢健壯，有利于提高后期的移栽存活率。因此，不定根誘導的最佳方法為C，即1/2MS+0.5mg/LIBA。在生產中采用方法B或者方法C2種生根方式均可，方法C雖然啟動天數較短，但方法B操作簡單，免去了添加植物激素的步驟，可根據實際所需進行選擇。

2.5煉苗與移栽

煉苗是組培苗對脫離組培環境進入到大田環境的一個過渡適應期，尤其是對環境中有菌的一種適應。當組培苗的根生長到一定長度時（4～6cm），打開組培瓶瓶蓋，倒入少量無菌水，進行3～4d煉苗。煉苗后將組培苗從瓶中取出，洗凈培養基，在自來水中浸泡2～4h，再將其移栽到大田中，澆透水，在其生長過程中注意對水分的控制。經此過程，韭菜組培苗移栽成活率可達95%以上，需注意的是在移栽過程中，要盡量減少對根系的損傷（圖3C、D）。

3結論與討論

該試驗以田間發現的韭菜植株花托上部特異性芽體為外植體，研究不同植物激素對其不定芽誘導的影響。結果發現，可采用10%次氯酸鈉溶液消毒7min的消毒方法，此方法無菌率最高，可以獲得有效的無菌外植體以滿足試驗需求。此芽體在MS+1.5mg/L6-BA+0.4mg/L2，4-D條件下誘導不定芽效果最好，不定芽誘導率可達78.52%，在MS+2.0mg/L6-BA+0.5mg/LNAA條件下誘導不定芽伸長效果最佳，組培苗長勢也較好，該研究3種生根方法均可，可根據生產需要選擇適合的生根方式，經煉苗后，韭菜組培苗移栽成活率可達95%以上，可滿足生產需求。

研究發現，以田間發現的韭菜植株花托上部特異性芽體為外植體，對其進行組織培養，進而獲得了再生植株，為今后韭菜相似特殊材料的保種、留種提供了可行方法。該研究中，對于外植體的消毒，沒有使用組培研究中常用的氯化汞消毒的方式^{［7-8，11］}，而是采用對人體、環境無害的次氯酸鈉溶液進行消毒，在獲得無菌外植體的同時達到了更安全、更環保的目的。研究發現，韭菜組培苗在培養過程中若采用單株且不帶基部愈傷部分進行培養時，在后期培養過程中大多數材料會出現變黃、枯萎的現象，為了避免此現象的發生，可以適當調節激素配比，在誘導不定芽的同時促進愈傷的發生，提高誘導效率。

參考文獻

［1］張明，呂愛琴，陳中府，等.我國韭菜資源研究現狀和種質創新研究建議［J］.植物遺傳資源學報，2016，17（3）：503-506，516.

［2］張寶海，韓向陽，何偉明，等.日光溫室韭菜輕簡化高效栽培技術［J］.中國蔬菜，2019（11）：101-103.

［3］周福君，翟瑩，魏源，等.不同光質對韭菜各茬生長及營養品質的影響［J］.東北農業大學學報，2017，48（11）：52-62.

［4］王貞，喬保建，王利亞，等.韭菜育種的研究進展［J］.江蘇農業科學，2014，42（3）：116-117.

［5］王利亞，王貞，馬培芳，等.韭菜大孢子誘導培養再生植株及移栽技術研究［J］.農業科技通訊，2017（10）：157-158.

［6］李冰冰.韭菜單倍體培養技術研究［J］.現代農業科技，2016（9）：67，69.

［7］葉青雷，馬云橋，劉海軍，等.野韭菜組織培養及快速繁殖研究［J］.安徽農學通報，2021，27（11）：36-37.

［8］胡永軍，林桂玉，田素波，等.壽光馬藺韭組織培養快繁體系的研究［J］.蔬菜，2013（9）：5-8.

［9］李勇，楊樺，龍蔚，等.韭菜組織培養及快速繁殖技術研究［J］.江西農業學報，2006，18（4）：106-107.

［10］王茜，龍驪豐，韋鵬霄，等.野韭菜花器官脫分化影響因子研究［J］.安徽農業科學，2014，42（31）：10861-10863.

［11］劉宏敏，馬培芳，張明.韭菜組織培養研究進展［J］.陜西農業科學，2011，57（5）：175-177.