庫爾勒香梨開花前后花藥細(xì)菌多樣性分析

摘 要：【目的】研究庫爾勒香梨花藥細(xì)菌的多樣性，分析庫爾勒香梨開花前后花藥細(xì)菌變化，為新疆南疆梨樹常見病害的防治提供菌種資源。

【方法】采用平板涂布法分離和純化香梨開花前后花藥細(xì)菌，分析細(xì)菌多樣性，并借助16S rDNA基因序列分析技術(shù)對其進(jìn)行分子鑒定，確定其分類地位。

【結(jié)果】香梨開花前后花藥所攜帶的細(xì)菌種類具有多樣性。對開花前后花藥分離的菌株分別隨機(jī)挑選9株和7株進(jìn)行分子鑒定，篩選的9株開花前花藥細(xì)菌全部歸屬于芽孢桿菌屬，其中包括枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌和貝萊斯芽孢桿菌。篩選的7株開花后花藥細(xì)菌除了有芽孢桿菌屬細(xì)菌，也包括鞘氨醇桿菌屬細(xì)菌，開花后花藥細(xì)菌多樣性大于開花前。

【結(jié)論】開花前花藥所攜帶的細(xì)菌其中有5株為枯草芽孢桿菌，2株為解淀粉芽孢桿菌，2株為貝萊斯芽孢桿菌。開花后花藥所攜帶的細(xì)菌其中有3株為枯草芽孢桿菌，2株為解淀粉芽孢桿菌，1株為副炭疽芽孢桿菌，1株為多食鞘氨醇桿菌。

關(guān)鍵詞：庫爾勒香梨花藥；細(xì)菌；多樣性

中圖分類號：S661.2 ""文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A ""文章編號：1001-4330（2024）08-1976-07

收稿日期（Received）：2024-01-25

基金項(xiàng)目：新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)財(cái)政科技計(jì)劃項(xiàng)目-南疆重點(diǎn)產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新發(fā)展支撐計(jì)劃（2020DB006）

作者簡介：王慶朋（1998-），男，新疆人，碩士研究生，研究方向?yàn)橹参锊±韺W(xué)，（E-mail）184879943@qq.com

通訊作者：郝海婷（1986-），女，陜西人，副教授，博士，碩士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹参锱c微生物互作，（E-mail）Haohaiting213@taru.edu.cn

0 引 言

【研究意義】庫爾勒香梨（ 簡稱香梨）是薔薇科梨屬植物，其葉子卵形，花朵白色［1］。庫爾勒香梨是新疆獨(dú)有的梨類品種。蘋果枝枯病是新疆在香梨上普遍發(fā)生較嚴(yán)重的植物病害，主要危害花、葉、嫩枝及果實(shí)、樹枝和樹干。該病害是一種細(xì)菌性病害，可通過花期蜜腺侵染。細(xì)菌植物病害防病機(jī)制主要包括競爭、抗生作用，以及誘導(dǎo)植物抗性等多種方式?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】孫旺旺等［3］發(fā)現(xiàn)貝萊斯芽胞桿菌BPC6對軟腐病菌的生長均具有抑制效果。Rashid等［4］發(fā)現(xiàn)接種枯草芽孢桿菌48 h對馬鈴薯軟腐病具有一定的抑制作用。李磊等［5］從芹菜根際土壤分離篩選得到一株解淀粉芽胞桿菌ZF75對芹菜軟腐病具有良好防治效果?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】有關(guān)庫爾勒香梨開花前后花藥細(xì)菌多樣性的研究較少，需采用平板涂布法分離和純化香梨開花前后花藥細(xì)菌，分析細(xì)菌多樣性，確定其分類地位?！緮M解決的關(guān)鍵問題】設(shè)計(jì)不同時(shí)間、地點(diǎn)，分批次取下香梨花苞、花朵，采用平板涂布法對香梨花藥細(xì)菌進(jìn)行分離、純化，通過分子擴(kuò)增測序手段初步鑒定其分類地位。通過細(xì)菌多樣性的鑒定，分析香梨開花前、后花藥攜帶細(xì)菌多樣性。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 香梨花藥

選用塔里木大學(xué)校內(nèi)外梨園，2021年于香梨開花前共采集3批，開花后共采集5批。表1、表2

1.1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基（g/L）：胰蛋白胨10 g/1 000 mL，酵母提取物5 g/1 000 mL，瓊脂粉15 g/1 000 mL，氯化鈉10 g/1 000 mL，水1 000 mL。

1.1.3 主要試劑和儀器

試劑：甘油、Taq Master Mix、ddH2O；16S rDNA細(xì)菌基因通用引物 27F/1492R；瓊脂糖等，購于上海生工生物工程股份有限公司。

儀器：2×TSINGKE Mater Mix恒溫培養(yǎng)振蕩器；BXM-75VE立式壓力蒸汽滅菌器；SPX型智能生化培養(yǎng)箱；PCR儀；電泳儀和凝膠成像分析儀等。

1.2 方 法

1.2.1 花藥細(xì)菌的分離、保存

用牙簽將新鮮香梨開花前的花藥和開花后的花藥挑下分別置于離心管中。采用平板涂布法分離細(xì)菌。稱取0.10 g開花前花藥、開花后花藥放入滅菌后的超凈工作臺后，分別倒入滅菌后的離心管中，用無菌水沖洗1次，倒掉無菌水。加入酒精30s，倒去酒精使用無菌水沖洗2～3次，接著用滅菌的塑料研磨棒研磨。最后用移液槍向離心管中分別加入5 mL無菌水震蕩搖勻，放置于試管架靜置10 min，待離心管中液體澄清后，吸取上清液60 μL滴在LB培養(yǎng)基表面，用75％酒精浸泡后再經(jīng)過酒精燈灼燒滅菌的玻璃涂布棒進(jìn)行平板涂布，涂布均勻。

將涂布好的培養(yǎng)基置于27℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，12 h觀察一次，當(dāng)菌落長出時(shí)，用平板劃線法分離純化，在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)并編號，得到純化菌落。

用滅菌槍頭挑取單菌落接種于液體LB培養(yǎng)基中，放入恒溫振蕩培養(yǎng)箱中，設(shè)定溫度為30℃培養(yǎng)時(shí)間為12 h，培養(yǎng)好的發(fā)酵液與滅菌后的50%甘油1∶1混合各800 μL加入無菌微量離心管中，先置于-20℃冰箱5 h，之后置于-60℃冰箱保存。

1.2.2 花藥攜帶細(xì)菌的分子鑒定

（1） 花藥攜帶細(xì)菌基因組DNA的提?。禾羧【?，與5 μL無菌水混合，取1 μL作為DNA模板。

（2）以細(xì)菌基因組DNA為模板，利用細(xì)菌16S rDNA基因通用引物 27F/1492R 擴(kuò)增目的片段，正向引物27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；反向引物1492R：5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR采用25 μL 反應(yīng)體系含。表3

PCR反應(yīng)條件：在94℃預(yù)變性3 min的基礎(chǔ)上，將PCR反應(yīng)進(jìn)行30次94℃變性、51℃退火和72℃復(fù)性1 min的循環(huán)，最終在72℃延伸10 min，并使用1%瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測，確認(rèn)符合要求后，將由生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.3 數(shù)據(jù)處理

通過PCR技術(shù)，在NCBI網(wǎng)站上使用BLAST和GenBank數(shù)據(jù)庫中的相似序列確定同源關(guān)系［6］。運(yùn)用BioEdit，MEGA7鄰接法（Neighbour-Joining，NJ）等軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 香梨花藥攜帶細(xì)菌分離情況

研究表明，香梨開花前后花藥所攜帶的細(xì)菌大小、顏色、形狀等各不相同。挑選出形態(tài)特點(diǎn)不同的菌株進(jìn)行純化。菌株的分類是基于培養(yǎng)基中形成的菌落的形狀特點(diǎn)和邊緣形狀、菌落的粘稠度、菌落的厚度以及菌落的顏色和透明度。共分離獲得80株細(xì)菌，花苞花藥分離獲得59株菌，花朵花藥分離獲得21株菌。多數(shù)菌落形態(tài)呈圓形，乳白色，表面光滑，有鋸齒狀邊緣。圖1、圖2，表4

2.2 香梨花藥細(xì)菌的分子鑒定

研究表明，從分離獲得80株細(xì)菌中篩選16株進(jìn)行分子鑒定，開花前花藥分離獲得59株，其中進(jìn)行鑒定的有9株，其中有9株屬于芽孢桿菌屬，編號為4、8、12、16、22、A-11、A-18、A-26、A-35，4菌株16S序列和解淀粉芽孢桿菌Bacillus amyloliquefaciens 菌株16S序列同源性96.10％（登錄號km823957.1），8菌株16S序列和枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis序列同源性99.37％（登錄號MF957285.1），12菌株16S序列和貝萊斯芽孢桿菌Bacillus velezensis 16S序列同源性98.91％（登錄號MW926959.1），16菌株16S序列和枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis 16S序列同源性99.54％（登錄KM234223.1），22菌株16S序列和枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis 16S序列同源性99.29％（登錄號MW714642 .1），A-11菌株16S序列和枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis 16S序列同源性99.64％（登錄號KM234223.1），A-18菌株16S序列和桿菌 （在細(xì)菌中）菌株 Bacillus subtilis 16S序列同源性98.67％（登錄號MW812268.1），A-26菌株16S序列和解淀粉芽孢桿菌Bacillus amyloliquefaciens 菌株16S序列同源性98.79％（登錄AB813716.1），A-35菌株16S序列和貝萊斯芽孢桿菌Bacillus velezensis 16S序列同源性99.44％（登錄號MT383653.1）。

開花后花藥分離獲得21株菌，鑒定的有7株，其中有6株屬于芽孢桿菌屬，編號為X2、X3、X6、X7、X13、X16、Z1，X2菌株16S序列和枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis 16S序列同源性94.55％（登錄號DQ383271.1），X3菌株16S序列和枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis 16S序列同源性96.84％（登錄號JQ900635.1），X6菌株16S序列和副炭疽芽孢桿菌Bacillus paranthracis 16S序列同源性99.27％（登錄號MT509411.1），X7菌株16S序列和解淀粉芽孢桿菌Bacillus amyloliquefaciens 菌株16S序列同源性99.28％（登錄號KR063202.1），X13菌株16S序列和解淀粉芽孢桿菌Bacillus amyloliquefaciens 菌株16S序列同源性99.28％（登錄號KR063202.1），X16菌株16S序列和枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis 菌株16S序列同源性99.72％（登錄號MW345828.1），Z1菌株16S序列和解淀粉芽孢桿菌Bacillus amyloliquefaciens 菌株16S序列同源性97.77％（登錄號KF836532.1），其中有1株屬于鞘氨醇桿菌屬，X16菌株16S序列和多食鞘氨醇桿菌Sphingobacterium multivorum 菌株16S序列同源性99.15％（登錄號KT614052.1）。圖3，表5

香梨開花前花藥攜帶細(xì)菌主要為有益菌芽孢桿菌屬（Bacillus），其中有枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、貝萊斯芽孢桿菌等有益菌。香梨開花后花藥除了有益菌芽孢桿菌屬（Bacillus），還出現(xiàn)了其它屬的細(xì)菌鞘氨醇桿菌屬（Sphingobium），相對香梨開花前出現(xiàn)了2種新菌種副炭疽芽孢桿菌、多食鞘氨醇桿菌。圖4

2.3 香梨花藥攜帶細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

研究表明，15株與芽孢桿菌屬（Bacillus）親緣關(guān)系接近，其中1株與鞘氨醇桿菌屬（Sphingobium）親緣關(guān)系接近。開花前后花藥攜帶細(xì)菌屬于2個(gè)屬。圖5

3 討 論

3.1

枯草芽孢桿菌在梨花藥攜帶的細(xì)菌中能夠有效地抵抗各種病原菌，并廣泛分布于土壤、湖泊、海洋以及動植物的體表［7］?？莶菅挎邨U菌（B. subtilis）不僅僅是一種普通的益生菌，而且還可以應(yīng)用于畜牧業(yè)。作為革蘭氏陽性菌，其具備出色的氧化性和厭氧性，因此成為全球范圍內(nèi)應(yīng)用最廣泛的益生菌之一。此外，其孢子形態(tài)也受到關(guān)注［8］。

3.2

解淀粉芽孢桿菌在所占比例中位居第二。解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens）對植物土傳病害具有抑制作用［9］。另外，枯草芽孢桿菌對小麥紋枯病菌［10］、黃瓜枯萎病致病菌［11］以及甜瓜霜霉病致病菌［12］均有抑制作用，而解淀粉芽孢桿菌對蘋果葉枯病菌的抑制效果也顯著［13］。

3.3

貝萊斯芽孢桿菌位居第三，貝萊斯芽孢桿菌（B. velezensis）功能包括產(chǎn)生植物激素、促進(jìn)植物生長以及生成大量次級代謝產(chǎn)物［14］。

副炭疽芽孢桿菌（B. paranthracis）兼具煙堿降解和促植物生長的作用，多食鞘氨醇桿菌（S. multivorum ）在活性去污方面有著卓越表現(xiàn)，能夠有效降解水中的甾體雄激素，在環(huán)保領(lǐng)域具有重要作用［15］。此外，多食鞘氨醇桿菌還具備降解農(nóng)藥的能力［16-17］，對農(nóng)藥殘留修復(fù)也起到一定的作用［18］。

4 結(jié) 論

試驗(yàn)分離出了80株細(xì)菌，其中59株來自開花前花藥，而21株來自開花后花藥。這些細(xì)菌主要分屬于芽孢桿菌屬（Bacillus）和鞘氨醇桿菌屬（Sphingobium）。開花前花藥所攜帶的細(xì)菌其中有5株為枯草芽孢桿菌，2株為解淀粉芽孢桿菌，2株為貝萊斯芽孢桿菌。開花后花藥所攜帶的細(xì)菌其中有3株為枯草芽孢桿菌，2株為解淀粉芽孢桿菌，1株為副炭疽芽孢桿菌，1株為多食鞘氨醇桿菌。其中，枯草芽孢桿菌具有抵抗病原菌的能力。

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Anther bacterial diversity of Korla Fragrant Pear before

and after flowering

WANG Qingpeng， YAN Chengcai， WANG Zhe， GOU Changqing， WANG Lan，

FENG Hongzu， HAO Haiting

（Key Laboratory of Integrated Pest Management （IPM） of Xinjiang Production and Construction Corps in Southern Xinjiang / Aral Crop Pest Science Observation and Experiment Station of the Ministry of Agriculture and Rural Affairs /College of Agronomy， Tarim University，" Aral Xinjiang 843300， China）

Abstract：【Objective】 The study investigated the bacterial presence in the anthers of Korla Fragrant pear blossoms， analyzing the changes in bacterial populations before and after flowering， to provide microbial resources for the prevention and control of common diseases in Fragrant pear trees in southern Xinjiang.

【Methods】 The flat-plate coating method was employed to isolate and purify the bacteria from the anthers of Fragrant pear blossoms before and after flowering. The bacterial diversity was analyzed， and molecular identification was conducted using 16S rDNA gene sequencing to determine their taxonomic status.

【Results】 The bacterial species carried by the anthers of korla Fragrant pear blossoms before and after flowering exhibited diversity. Nine strains were randomly selected for molecular identification from the bacteria isolated from the anthers before flowering， all of which were categorized under the Bacillus genus， including Bacillus subtilis， Bacillus amyloliquefaciens， and Bacillus velezensis. Additionally， seven strains were randomly selected from the bacteria isolated after flowering; these included not only Bacillus genus but also bacteria from the Sphingobium genus， indicating greater diversity in the bacteria after flowering compared to before.

【Conclusion】 Among the bacteria carried by the anthers before flowering， five strains were identified as Bacillus subtilis， two as Bacillus amyloliquefaciens， and two as Bacillus velezensis. After flowering， the bacteria included three strains of Bacillus subtilis， two strains of Bacillus amyloliquefaciens， one strain of Bacillus paranthracis， and one strain of Sphingobacterium multivorum.

Key words：Korla Fragrant pear anther; Bacteria; Diversity

Fund projects：The Fiscal Science and Technology Program Project of Xinjiang Production and Construction Corps （2020DB006）

Correspondence author：HAO Haiting（1986-）， female， from Shaanxi，Ph.D.， associate professor， research direction：plant microbial interaction， （E-mail）Haohaiting213@taru.edu.cn