牛羊布魯氏菌天然半抗原瓊脂擴散試驗的建立與應用

摘 要：【目的】建立并優化布魯氏菌天然半抗原瓊脂擴散試驗（Native hapten agar gel immuno-diffusion test，NH-AGID），檢測臨床樣品。

【方法】建立NH-AGID方法，評價方法特異性、敏感性及重復性；檢測免疫地區2 287份、非免疫地區252份牛、羊血清。

【結果】建立了NH-AGID方法，檢測穩定，重復性好，具有較高的特異性；對自然感染陽性動物檢測敏感性低于80%，對排菌動物的檢測敏感性高于90%，檢出布病陽性抗體的閾值高于RBT。免疫地區血清NH抗體平均檢出率17.8%，LPS抗體平均檢出率52.3%；非免疫地區血清NH抗體平均檢出率40.9%，LPS抗體平均檢出率54.8%。

【結論】應用NH-AGID方法可鑒別區分免疫地區牛、羊布病感染動物和免疫動物。檢出NH抗體動物處于布魯氏菌活動期或排菌期為布病感染動物，應及時剔除出群。

關鍵詞：布魯氏菌病；半抗原-瓊脂擴散試驗；診斷

中圖分類號：S855 ""文獻標志碼：A ""文章編號：1001-4330（2024）08-2063-08

收稿日期（Received）：2024-01-18

基金項目：新疆維吾爾自治區重點研發專項（2022B03013-1）；新疆生產建設兵團重點領域科技攻關計劃項目（2020AB015）

作者簡介：劉麗婭（1984-），女，安徽阜陽人，副研究員，碩士，研究方向為動物疫病防控，（Ｅ-mail）286238083@qq.com

通訊作者：易新萍（1970-），女，湖北公安人，研究員，博士，研究方向為動物疫病防控，（E-mail）821489803@qq.com

李巖（1966-），男，山東人，研究員，碩士生導師，研究方向為動物疫病預防控制，（E-mail）bt4641862@ 163.com

0 引 言

【研究意義】布魯氏菌病Brucellosis（簡稱布病）是人畜共患病［1］。自2000年以來，我國布病發病率呈逐年上升趨勢，且上升速度很快［2］。該病影響畜牧業可持續發展［3］。疫苗免疫是防控布病的重要手段［4］，雖然牲畜免疫后可產生一定的免疫保護效果，但也存在感染風險，以及免疫后無法區分免疫抗體和自然感染抗體，干擾血清檢測等缺陷［5-6］。建立并優化布病鑒別診斷的方法，對準確早期鑒別及診斷牛、羊該病有實際意義。【前人研究進展】目前我國尚無對疫苗免疫動物和自然感染動物進行有效鑒別診斷的血清學方法［7］。有研究采用酶聯免疫吸附試驗或虎紅平板凝集試驗進行初篩，再通過NH-AGID確診，區分了布魯氏菌疫苗Rev.1株免疫抗體和感染抗體［8］，也可應用NH-AGID對布病自然感染牛和免疫S19株疫苗牛進行鑒別診斷［9］。還有使用NH-AGID方法對血清檢測陽性動物區分自然感染抗體和疫苗抗體，實現了布病的凈化［10］。【本研究切入點】有關牛羊布魯氏菌天然半抗原瓊脂擴散試驗的建立與應用文獻研究較少，需研究鑒別診斷布病疫苗免疫背景下區分自然感染動物和疫苗免疫動物的NH-AGID方法。【擬解決的關鍵問題】建立布魯氏菌NH-AGID試驗方法，優化檢測條件，并應用建立的方法檢測不同免疫背景和自然感染的牛、羊血清樣本，為畜間布病鑒別診斷提供可選擇的方法及相關研究臨床檢測數據。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 試劑

布病虎紅平板凝集試驗（RBT）、試管凝集試驗（SAT）和補體結合試驗（CFT）抗原購自青島立見生物科技有限公司；2×PCRmix、無水乙醇、硼酸、氯化鉀、NaOH、瓊脂糖購自生工生物工程（上海）股份有限公司。引物合成自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.1.2 NH和LPS抗原

由青島瑞爾唯特生物技術有限公司提供。

1.1.3 血清樣品

1.1.3.1 布病陽性血清

在無布病疫苗接種史的羊群采集布病陽性血清共6份：RBT、SAT 和CFT檢測均為陽性，其中牛、羊強陽性血清各1份、中陽性各1份、弱陽性血清各1份；布病PCR診斷陽性、RBT診斷陽性牛、羊血清各24份；經RBT、SAT 檢測均為陽性的無布病疫苗接種史牛、羊血清各50份。

1.1.3.2 布病陰性血清

采集自無布病疫苗接種史的牛群和羊群，經RBT、SAT和CFT檢測均為陰性的牛、羊血清各20份。

1.1.3.3 其他陽性血清

口蹄疫O型抗體陽性血清、A型抗體陽性血清、牛支原體抗體陽性血清、牛分枝桿菌抗體陽性血清、大腸桿菌抗體陽性血清均為新疆畜牧科學院獸醫所保存血清。

1.1.3.4 臨床樣品

收集布病疫苗免疫后一年內經RBT、SAT檢測均為陽性的血清共2 287份，其中布魯氏菌A19-ΔVirB12疫苗免疫牛血清342份、A19疫苗免疫牛血清1 688份、M5株疫苗免疫羊血清257份；非免疫地區經RBT、SAT檢測均為陽性的血清共252份，其中牛血清55份、羊血清197份。

1.2 方 法

1.2.1 診斷抗原的制備

參照WOAH陸生動物疾病診斷和疫苗手冊在生物安全三級實驗室條件下，將培養的羊種布魯氏菌16M菌液進行滅活；12 000 r/min、4 ℃離心10 min，棄上清后將沉淀物加ddH2O重懸，12 000 r/min、4℃離心10 min，洗滌2次；按1∶4體積比加ddH2O重懸沉淀物，121℃高壓30 min后12 000 r/min 4℃離心20 min，取上清加入3倍體積無水乙醇，4℃攪拌過夜；15 000 r/min、4℃離心20 min，取沉淀物用適量雙蒸水重懸，透析12 h、凍干、稱重，重量應不低于5 mg，所得產物為NH和LPS抗原混合物，-20℃保存備用。

1.2.2 瓊脂平板的制備

配制硼酸緩沖液：分別稱取硼酸6.2 g、氯化鉀7.25 g，加入ddH2O 800 mL，攪拌至藥品完全溶化。用1 mol/L的NaOH溶液調pH至8.3后，定容至1 000 mL。每100 mL硼酸緩沖液中加入不同濃度的瓊脂糖，水浴加熱至完全溶解。在直徑為60 mm的一次性平皿中加入5 mL瓊脂溶液，凝固后用孔徑4 mm、孔距3 mm的7孔梅花型打孔器打孔，加熱封底。4℃保存備用。

1.2.3 操作及判定

中心孔加抗原，側面孔加被檢血清。LPS沉淀線靠近中心抗原孔端，出現LPS沉淀線判定為免疫動物；NH沉淀線靠近側面加樣孔端，同時出現NH、LPS兩條沉淀線或只出現NH沉淀線均判定為感染動物。圖1

1.2.4 條件優化

1.2.4.1 NH和LPS混合抗原濃度

將NH和LPS抗原混合物用ddH2O分別稀釋至0.5、1.0、1.5、2.0、 2.5和3.0 mg/mL等6個不同濃度，取15 μL加入中央孔，周邊6個孔各加入15 μL羊布病陽性血清（2份強陽性、2份中陽性、2份弱陽性），放置濕盒中，連續觀察，記錄結果。

1.2.4.2 瓊脂濃度

依次配制0.6%、1.0%、1.2%、1.5%、1.7%和2.0%等6種不同濃度的瓊脂平板，中央孔加入15 μL最佳濃度抗原，周邊6個孔各加入15 μL羊布病陽性血清，放置濕盒中，連續觀察記錄。

1.2.4.3 孵育溫度和孵育時間

瓊脂平板中央孔加入15 μL最佳濃度抗原，周邊6個孔各加入15 μL陽性血清。將平板置于濕盒中，分別放在18、22、25、30和37℃ 5個溫度條件下，孵育4、8、16及24 h，連續觀察記錄。

1.2.5 敏感性檢測

1.2.5.1 與RBT方法敏感性比對

將布病強陽性血清1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128和1∶256倍稀釋后，應用建立的NH-AGID方法和RBT方法同時檢測，比較NH-AGID方法與RBT方法的敏感性差異。

1.2.5.2 自然感染血清

檢測50份自然感染牛、50份自然感染羊血清樣品，評價該方法對自然感染血清檢測敏感性。

1.2.5.3 病原學陽性樣品

檢測25份布病PCR診斷陽性牛血清、25份布病PCR診斷陽性羊血清樣品，評價該方法檢測NH抗原的敏感性。

1.2.6 特異性

應用建立的NH-AGID方法檢測口蹄疫O型抗體陽性血清、A型抗體陽性血清、牛支原體抗體陽性血清、牛分枝桿菌抗體陽性血清、大腸桿菌抗體陽性血清和布病陰性血清，評價該檢測方法的特異性。

1.2.7 重復性

按照優化后的NH-AGID最佳抗原濃度和瓊脂濃度，制備3批檢測平板，分別檢測布病陽性血清和布病陰性血清，評價方法的重復性。

1.2.8 臨床血清樣品

應用建立的NH-AGID方法檢測收集自免疫地區和非免疫地區的2 539份牛、羊陽性血清進行。

2 結果與分析

2.1 試驗條件優化

2.1.1 最佳抗原濃度

研究表明，當混合抗原濃度為1.0和1.5 mg/mL時，布病強陽、中陽、弱陽性血清均能形成NH沉淀線和LPS沉淀線，選定最佳抗原濃度為1.0 mg/mL。表1

2.1.2 最佳瓊脂濃度

研究表明，當瓊脂平板濃度為1.2%時，布病強陽、中陽、弱陽性血清均能夠形成NH沉淀線和LPS沉淀線，并且此時弱陽性血清出現的NH沉淀線最清晰。選定瓊脂糖平板最佳濃度為1.2%。表2

2.1.3 最佳孵育溫度和孵育時間

研究表明，在22、25和30℃條件孵育4 h時強陽血清出現NH抗原沉淀帶；8 h時中等陽性血清出現NH抗原沉淀帶；16 h時出現LPS抗原沉淀帶，且弱陽性血清出現NH抗原沉淀帶；24 h以上弱陽性NH沉淀帶最為完整、清晰。最終選定最佳孵育溫度為（25±3）℃，最佳孵育時間為24 h。表3

2.2 敏感性檢測

2.2.1 應用NH-AGID方法

研究表明，布病強陽性血清在1∶64稀釋時檢測為陽性。RBT檢測敏感性高于NH-AGID方法。表4

2.2.2 布病自然感染陽性動物對應血清NH-AGID方法檢測

研究表明，牛、羊血清NH和LPS沉淀線檢出率均在80%以下，牛、羊LPS沉淀線檢出率分別為88%、94%。NH-AGID方法對自然感染動物檢測敏感性為72%。表5

2.2.3 布病PCR診斷陽性動物對應血清NH-AGID方法檢測

研究表明，牛、羊血清NH和LPS沉淀線檢出率均在90%以上，LPS沉淀線檢出率為100%。表明NH-AGID方法對PCR陽性動物檢測敏感性為93.8%。表6

2.3 特異性及重復性檢測

研究表明，對口蹄疫O型抗體陽性血清、A型抗體陽性血清、牛支原體抗體陽性血清、牛分枝桿菌抗體陽性血清、大腸桿菌抗體陽性血清和布病陰性血清進行檢測，均未檢測到NH沉淀線和LPS沉淀線。

應用3批布魯氏菌NH半抗原瓊脂擴散檢測平板，分別進行敏感性和特異性檢測，檢測結果符合率在97%以上。表7

2.4 臨床樣品檢測

2.4.1 布病不同疫苗免疫后血清檢測

研究表明，A19-VirB12株免疫牛NH抗體檢出率為5.6%，LPS抗體檢出率為78.7%；A19株免疫牛NH抗體檢出率為18.5%，LPS抗體檢出率為46.4%；M5株免疫羊NH抗體檢出率為28.8%，LPS抗體檢出率為55.3%。免疫地區血清NH抗體平均檢出率為17.8%，LPS抗體平均檢出率為52.3%。表8

2.4.2 布病自然感染血清

研究表明，牛血清LPS抗體檢出率為60%，NH抗體檢出率為34.5%；羊血清LPS抗體檢出率為53.3%，NH抗體檢出率為42.6%。非免疫地區血清NH抗體平均檢出率為40.9%，LPS抗體平均檢出率為54.8%。表9

3 討 論

3.1

瓊脂擴散試驗又稱為雙向雙擴散試驗，原理是通過抗原、抗體在瓊脂凝膠中由近及遠不斷地自由擴散形成濃度梯度，在適當比例處相遇形成沉淀線，以此來對抗體或抗原進行鑒定、區分的一種試驗方法［11］。NH-AGID是基于光滑型布魯氏菌表面天然半抗原（NH）和脂多糖（S-LPS）的免疫原性差異所建立的瓊脂擴散試驗方法，可對布病免疫動物和感染動物進行鑒別診斷。LPS抗原免疫原性強，無論是自然菌還是疫苗菌均能刺激機體產生LPS抗體［12］；NH抗原免疫原性弱［13-15］，只有在布魯氏菌感染，尤其是活動期、排菌期，持續強烈刺激機體才能產生NH抗體［16］。檢測時根據形成不同的沉淀線對免疫動物和感染動物進行鑒別區分。

3.2

試驗結果表明，NH-AGID方法檢測穩定，重復性好，與其他5種疫病陽性血清無非特異性反應，布病陰性血清檢測也均為陰性，檢測特異性較高。但該方法的檢測敏感性低于RBT，對布病自然感染牛、羊血清NH抗體的檢出率低于80%，與楊珍等［17］研究結果一致，NH-AGID方法具有較好的特異性，但敏感性略低。因NH抗體的出現與布魯氏菌排出情況有關［18］，試驗表明該方法對排菌動物的檢測敏感性高于90%，進一步驗證了NH抗體的出現與布魯氏菌排出情況的密切相關性。

3.3

試驗結果表明，免疫地區M5株疫苗免疫羊血清NH抗體檢出率最高，達28.8%，可能和M5疫苗是我國目前使用疫苗中毒力最強的毒株，易引起動物機體毒力過高有關［19］。A19-VirB12株標記疫苗缺失了VirB12毒力基因，免疫保護力與親本株A19無顯著差異，但毒力減弱［20-21］。應用NH-AGID方法檢測A19-VirB12株免疫牛血清效果較為理想，NH抗體檢出率為5.6%，LPS抗體檢出率為78.7%。免疫地區血清NH抗體平均檢出率達17.8%。

4 結 論

建立NH-AGID方法檢測穩定，重復性好，具有較高的特異性。在免疫地區可應用NH-AGID方法鑒別區分牛、羊布病感染動物和免疫動物。先用常規布病血清學方法進行初篩，初篩陽性血清再用NH-AGID方法進行鑒別診斷。

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Establishment and application of natural hapten agar diffusion

test for brucella

LIU Liya1， YAN Wenliang2， CAO Rui3， YE Feng1， MA Xiaojing1， GU Wenxi1， ZHAO Jiangshan4，

ZHANG Zirong5， SONG Jie6， LI Yan2， YI Xinping1

（1.Xinjiang Key Laboratory of Animal Infectious Diseases， Institute of Veterinary Medicine， Xinjang Academy of Animal Sciences， Urumqi 830011，China; 2. The General Station of Animal Husbandry and Veterinary of Xinjiang Production and Construction Corps， Urumqi 830021， China ;3.Qingdao Real Bio-Technology Co.， Ltd， Qingdao Shandong 266000， China ;4. Centre for Disease Control and Prevention of Xinjiang Uygur Autonomous Region， Urumqi 830000，China; 5. Animal Husbandry and Veterinary Work Station of the Sixth Division， Xinjiang Production and Construction Corps， Wujiaqu Xinjiang 831304，China;6.Xinjiang Tianrun Dairy limited Co.，Ltd， Urumqi 830000， China）

Abstract：【Objective】 To establish and optimize the natural hapten agar gel immuno-diffusion test （NH-AGID） for Brucella abortus in clinical samples.

【Methods】 The NH-AGID method was established to evaluate the specificity， sensitivity and reproducibility of the method; 2，287 bovine and sheep sera from immunized areas and 252 from non-immunized areas were tested.

【Results】 The NH-AGID method with stable and reproducible assay and high specificity was successfully established; The sensitivity of the assay for naturally infected positive animals was lower than 80%; The sensitivity of the assay for releasing animals was higher than 90%; The threshold for detecting bruclosis-positive antibodies was higher than RBT. The average detection rate of serum NH antibodies in immunized areas was 17.8%， and the average detection rate of LPS antibodies was 52.3%; the average detection rate of serum NH antibodies in non-immunized areas was 40.9%， and the average detection rate of LPS antibodies was 54.8%.

【Conclusion】 The NH-AGID method can be applied to identify and distinguish bovine and sheep brucellosis-infected animals from immunized animals in immunized areas. Animals detected with NH antibodies in the active or excretory phase of Brucella abortus are brucellosis-infected animals and should be removed from the herd in time.

Key words：brucellosis; native hapten-agar gel immuno diffusion; diagnosis

Fund projects：Key Ramp;D Special Project of Xinjiang Uygur Autonomous Region" （2022B03013-1） ;The Project of Tackling Hard-Nut Problems in Science and Technology of XPCC （2020AB015）

Correspondence author：YI Xinping（1970-）， female， from Gongan， Hubei， PhD， researcher， research direction： animal disease prevention and control research， （E-mail）821489803@qq.com

LI Yan（1966-）， male， from Shandong， researcher，Master's supervisor， research direction： animal disease prevention and control， （E-mail）bt4641862@ 163.com