生防菌對油茶病害防治效果的分析

一、概述

油茶原產于中國，是我國第一大木本食用油料樹種，也是世界四大木本食用油料樹種之一。2022年中央一號文件《中共中央國務院關于做好2022年全面推進鄉村振興重點工作的意見》明確指出，支持擴大油茶種植面積，促進木本糧油和林下經濟發展。油茶病害是制約油茶高產、優質的主要問題之一。目前，已經報道了42種油茶病害，對這些病害的防治仍然以化學防治手段為主，容易引起一系列的“3R”問題，包括抗性、殘留和再猖獗。同時，還會造成人畜傷害、環境污染、油茶產量降低等多方面的問題。因此，開展油茶病害生物防治方面的研究是保障油茶產業綠色健康發展的有效途徑。

近年，我國研究人員開始考慮從微生物或植物中尋找對油茶炭疽病有防治功能的生物農藥，篩選和利用拮抗微生物成為防治油茶炭疽病研究的新方向。2010年，游嘉研究分析殼聚糖對油茶炭疽病菌的生長有一定的抑制作用，且發現增大殼聚糖的濃度可增強抑菌活性。2019年，喻錦秀研究發現拮抗細菌發酵液中主要是脂肽類物質對油茶炭疽病起拮抗作用。在油茶炭疽病拮抗放線菌的研究方面，鄧雷通過篩選及對抑菌譜的研究發現3個抑制作用較強的菌株。周盈等報道了1種對胡蘿卜軟腐歐文氏菌具有抑菌活性的枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）BSn5及其產生的抑菌蛋白APn5，但該菌僅能拮抗胡蘿卜軟腐歐文氏菌亞種，其生防范圍較窄。宋光桃發現短芽孢桿菌Z26能有效抑制油茶炭疽病病菌、根腐病病菌、半邊瘋病菌等病原菌的生長，該生防菌劑對油茶炭疽病的最大抑制率達到83.4%。徐睿等發現枯草芽孢桿菌YL13和球孢鏈霉菌球孢亞種（Streptomyces globisporus subsp. Globisporus） F10對油茶炭疽病菌具有明顯的抑制作用，可以用于生物防治藥劑的開發。

錐毛殼菌（Coniochaeta velutina）屬于真菌界子囊菌門（Ascomycota），糞殼菌綱（Sordariomycetes）。該真菌常以內生菌存在于健康植物組織中或土壤中。2015年，Xie在杉木的莖組織中分離到內生菌C. velutina。該研究發現，C. velutina在馬鈴薯葡萄糖培養基（PDA）、燕麥培養基（Oatmeal agar，OA）等培養基上均可生長。菌落表面干燥、起皺，中心呈深褐色或鮮黃色，邊緣呈白色至琥珀色。掃描電子顯微鏡（Scanning electron micrographs，SEM）觀察到菌絲在培養基表面長成圓形。菌絲體逐漸交織、成熟，形成深褐色的外皮層。包殼外壁由深褐色的棱角紋理組成，剛毛，中央有孔口，直徑可達143 μm。子囊孢子透明、壁光滑，大小為（3～4.5 ）μm×（4.5～7 ）μm。剛毛棕色，圓柱形，逐漸變細到一個圓形尖端，通常是直的、有隔膜、光滑的壁或疣狀，寬2.0～4.5 μm，最長25 μm。營養菌絲透明，寬1.5～2.5 μm。分生孢子梗減少為分生孢子細胞。分生孢子細胞是腸胚細胞，透明，帶有離散的圓瓶，從圓柱形到心室，頸部長1～3 μm，頸圈開口1～2 μm寬。孢子形成豐富。分生孢子透明，單細胞，壁光滑，圓柱形，末端圓形或一端略尖，（1.0～2.0）μm×（2.0～6.5）μm。PDA表面形成一些疣狀、不規則的孢子。

2022年，研究團隊從油茶健康葉片中分離獲得內生真菌C. velutina。在PDA培養基上證明該真菌能夠顯著抑制膠胞炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）、鏈格孢菌（Alternaria alternata）和葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）。但是該生防菌在田間對以上3種致病菌的防治效果仍未測定。因此，本研究利用盆栽油茶苗，在人工接種3種致病菌的基礎上，將生防菌C. velutina制備成發酵液，按照50%發酵液、100%發酵液（原液）分別噴灑到人工接菌的油茶植株上，以噴灑無菌水作為對照。通過測量油茶葉部病斑的直徑和病情指數來檢測生防菌的田間生物防治效果。通過該研究可以為生防真菌的開發利用奠定基礎。

二、試驗材料與方法

（一）試驗材料

菌株保存在信陽農林學院林學院林木病理學實驗室。生防真菌為錐毛殼菌，致病真菌為鏈格孢菌、葡萄座腔菌、膠孢炭疽菌（見圖1）。

油茶苗選用3年生長林4號品種油茶苗。篩選健壯、無病蟲害且長勢大小一致的油茶苗進行栽植。

（二）試驗方法

1.發酵液制備。在超凈工作臺中，使用打孔器對實驗室保存好的生防真菌C. velutina菌種進行打孔（打孔器直徑5 mm），用挑針挑取菌餅放至含PD培養基的錐形瓶內，每個瓶內放5個菌餅，共制作9瓶（見圖2）。錐形瓶用透氣的封口膜蓋好，把錐形瓶固定在搖床內進行培養。搖床設定溫度27 ℃，轉速為150 rpm。

2.油茶人工接種致病菌。首先，把PDA培養基上培養好的鏈格孢菌、葡萄座腔菌和膠孢炭疽菌使用打孔器（直徑為5 mm）進行打菌餅。其次，選取長勢大小相同的油茶苗，每盆植株上挑取10片健康的油茶葉片，用注射器把葉片主脈的左右兩側分別輕扎3個小孔（表皮刺破即可）。最后，利用已滅菌的挑針挑取菌餅，并將這些菌餅貼緊在油茶葉片的針孔處。為了保濕培養，使用塑料薄膜緊密地纏繞住葉片。

3.噴施生防菌的發酵液。接菌3 d后，按照生防菌發酵液100%（原液）、發酵液50%（稀釋1倍）、無菌水（對照組）分別噴灑到人工接菌的油茶植株上。每個濃度的菌液分別噴灑在3棵植株上，并且每隔5 d進行1次噴灑，共噴施3次。經過20 d的持續觀察，記錄不同濃度發酵液對發病植株葉斑大小直徑的影響。最后，將這些數據進行統計學分析。

三、結果與分析

（一）生防菌C. velutina的發酵液

生防菌C. velutina在PD培養基內振蕩培養20 d后（見圖3），錐形瓶內發酵液中有試驗中獲得的生防菌C. velutina發酵液較多的菌絲體球，同時PD培養基也變得清澈透明，說明生防菌C. velutina在PD培養基中進行生長、繁殖，生長過程中吸收了PD培養基中的營養物質。打開錐形瓶的封口膜能夠聞到明顯真菌發酵的氣味，這種氣味可能是由于C. velutina在生長過程中產生的特定代謝產物或揮發性化合物。

（二）發酵液對油茶葉部病害的防治效果

隨著發酵液濃度的提高，從50%發酵液到100%發酵液，油茶葉部的病斑直徑均逐漸減小，病情指數下降，抑菌率也呈上升趨勢（見表1）。對于膠孢炭疽菌引起的油茶葉部病斑，在第3次噴50%發酵液時病斑直徑為2.58 cm，抑菌率為19.12%，而100%發酵液處理的病斑直徑僅為2.33 cm，抑菌率達到26.96%。對于鏈格孢菌引起的油茶葉部病斑，在第3次噴50%發酵液時病斑直徑為2.03 cm，抑菌率為16.80%，而100%發酵液處理的病斑直徑僅為1.90 cm，抑菌率達到22.13%。對于葡萄座腔菌引起的油茶葉部病斑，在第3次噴50%發酵液時病斑直徑為2.19 cm，抑菌率為15.76%，而100%發酵液處理的病斑直徑僅為2.11 cm，抑菌率為18.84%。

四、討論

油茶是我國生產油料的原材料之一，常因為病害的發生導致其產量和質量有所降低，其中，油茶葉部病害是油茶病害中發生最多的。這些病害的病原菌主要由真菌引起，如黑盤孢目中炭疽菌屬（Colletotrichum spp.）、叢梗孢目中鏈格孢屬（Alternaria spp.）、葡萄座腔菌目。因此，該研究選用實驗室前期從油茶葉斑病中分離的致病菌（膠孢炭疽菌、葡萄座腔菌、鏈格孢菌）作為本次油茶人工接菌的菌株材料，選用這3種致病菌使油茶葉片發病，發病情況更接近田間自然發病情況，從而能夠更準確地檢測生防菌株的防治效果。

生防菌在室內環境條件下進行試驗時，其防治效果表現很好，當移至田間環境時，其防治效果未能達到室內效果。當前，國內篩選和鑒定油茶葉斑病生防真菌的主要手段為平板對峙法和室內離體葉片抑菌率試驗。然而，這些方法僅基于理想條件下的試驗結果，與實際應用場景及自然環境條件之間存在顯著差異。例如，王義勛等人關于解淀粉芽孢桿菌WH1發酵液防治油茶炭疽菌藥效調查，發現該發酵液在室內培養72 h，抑菌率為100%，培養96 h，抑菌率為83.2%。在田間施用時解淀粉芽孢桿菌WH1發酵液防效為74.4%。在多變的環境條件，如溫度、濕度、光照及pH等因素的綜合作用下，生防菌的防治效果發生變化。因此，生防菌的實際防治效果與植物所處環境及生防菌的定殖能力有關。同時，Rajkumar等通過篩選生防菌株的試驗發現，使用盆栽進行生防效果測定，相較于離體葉片篩選出的生防菌更準確。因此，本研究使用盆栽油茶苗，先進行人為接種致病菌，然后進行生物防治效果測定，這一方法更易于檢測出生防菌C. velutina的防治效果，也為該菌進一步開發利用奠定理論基礎。

五、結論

通過室內盆栽種植油茶苗進行大田模擬試驗，系統分析了C. velutina發酵液對膠孢炭疽菌（C. gloeosporioides）、鏈格孢菌（A. alternata）和葡萄座腔菌（B. dothidea）3種病原菌所致的油茶葉斑病的防治效果。試驗結果表明，該發酵液對這些油茶葉部病害具有顯著的抑制效果，且隨著發酵液濃度的增加和噴灑次數的增多，防治效果逐漸提升，連續多次噴灑該發酵液能夠顯著提高防治效果。與化學農藥相比，生防菌C. velutina作為一種生物防治劑，具有較低的環境風險和更好的生態兼容性，這對于推動農業的綠色發展具有重要意義。

基金項目：河南省重點研發與推廣專項（科技攻關）（232102110050），河南省高等學校重點科研項目（23B220001），2023年河南省本科高校大學生創新創業訓練項目（202311326004）。

作者簡介：李卓琪（2002—），男，河南三門峽人，碩士在讀，主要從事林業病理研究。