不同耐旱性肥披堿草干旱脅迫下生理響應和轉錄組學分析

摘要：肥披堿草（Elymus excelsus Turcz.）是禾本科披堿草屬多年生草本植物，具有生長茂盛、葉片寬厚、營養價值高和適口性好等特點，是一種優質牧草。為探討肥披堿草的耐旱性，本研究以前期從東北8個野生資源中篩選的耐旱型和干旱敏感型肥披堿草為試驗材料，采用20%PEG-6000模擬干旱脅迫對幼苗（5周齡）處理0（對照），3，7和14 d，觀察植株表型、測定滲透調節物質、活性氧代謝和抗氧化酶活性等生理指標的變化，并進行轉錄組測序，以探究肥披堿草在干旱脅迫下的生理響應及內在調控機制。結果表明：干旱脅迫下，與干旱敏感型相比，耐旱型肥披堿草的脯氨酸（Pro）、超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）、可溶性糖（SS）含量均顯著升高（Plt;0.05），其中在脅迫14 d時脯氨酸含量和可溶性糖含量達到最高，比干旱敏感型分別提高20.39%和19.11%。轉錄組分析表明，耐旱型和干旱敏感型差異表達基因分別為3463個和2651個，其中有795個共同調控基因，上調633個，下調159個。耐旱差異表達基因主要富集在抗氧化活性、轉移酶活性、精氨酸和脯氨酸代謝等途徑中，其中proB、rocF和ALDH基因可能參與肥披堿草抵御干旱脅迫過程。本研究為進一步挖掘肥披堿草響應干旱脅迫的候選基因和耐旱育種提供了理論基礎。

關鍵詞：干旱脅迫；肥披堿草；轉錄組測序；生理響應；差異表達基因

中圖分類號：Q756""" 文獻標識碼：A""""" 文章編號：1007-0435（2024）09-2718-10

doi：10.11733/j.issn.1007-0435.2024.09.005

收稿日期：2024-01-18；修回日期：2024-03-15

基金項目：草優異新種質創制與利用（2023YFD1200304）資助

作者簡介：

高志強（1999-），男，漢族，內蒙古多倫縣人，碩士研究生，主要從事分子植物育種研究，E-mail：gaozhiqiang202108@163.com;*通信作者Author for correspondence，E-mail：cgw603@163.com

引用格式：

高志強， 烏漢夫， 徐" 文，等.不同耐旱性肥披堿草干旱脅迫下生理響應和轉錄組學分析［J］.草地學報，2024，32（9）：2718-2727

GAO Zhi-qiang， WU Han-fu， XU Wen，et al.Physiological Responses and Transcriptomic Analysis of Elymus excelsus Turcz. with Different Drought Tolerances under Drought Stresses［J］.Acta Agrestia Sinica，2024，32（9）：2718-2727

Physiological Responses and Transcriptomic Analysis of Elymus excelsus Turcz.

with Different Drought Tolerances under Drought Stresses

GAO Zhi-qiang， WU Han-fu， XU Wen， YUAN Yu-ying， LI Bing， TULUHONG Mu-zhapaer，

CUI Guo-wen*

（College of Animal Science and Technology， Northeast Agricultural University， Harbin，Heilongjiang Province 150030， China）

Abstract：Elymus excelsus Turcz. is a perennial herbaceous plant of the genus Elymus of the Poaceae family. It exhibits traits of vigorous growth，broad foliage，high nutritional value，and favorable palatability，rendering it a superior quality pasture species. In order to explore the drought tolerance of Elymus excelsus，this study used drought resist and drought sensitive Elymus excelsus previously screened from 8 wild resources in Northeast China as test materials，and used 20% PEG-6000 to simulate drought stress. Seedlings （5 weeks old） were treated for 0 （control），3，7 and 14 days. Phenotypes changes were observed，changes in physiological indicators were measured，such as osmotic regulatory substances，reactive oxygen metabolism and antioxidant enzyme activity. And transcriptome sequencing was performed to explore the physiological response and internal regulatory mechanism of Elymus excelsus under drought stress. The results showed that，under drought stress，the drought-tolerant Elymus excelsus exhibited significantly increased contents of proline （Pro），superoxide dismutase （SOD），catalase （CAT），and soluble sugar （SS） compared to the drought-sensitive type （P lt; 0.05）. Increased，among which the proline content and soluble sugar content reached the highest on the 14th day of stress，increasing by 20.39% and 19.11% respectively compared with the drought sensitive type. Transcriptome analysis showed that there were 3 463 and 2 651 differentially expressed genes of drought resist and drought sensitive response genes respectively，of which 795 were co-regulated genes，633 were up-regulated and 159 were down-regulated. Drought-tolerant differentially expressed genes are mainly concentrated in pathways such as antioxidant activity，transferase activity，and arginine and proline metabolism. Among them，proB，rocF，and ALDH genes may be involved in the process of Elymus excelsus resisting drought stress. The research results provide a theoretical basis for further exploration of candidate genes and drought resist breeding of Elymus excelsus.

Key words：Drought stress;Elymus excelsus;Transcriptome sequencing;Physiological response;Differentially expressed gene

在全球生態平衡遭受破壞和氣候異常的背景下，我國干旱地區面積逐年擴大，2021年以后我國干旱地區在1.27億公頃的耕地面積中占50.33%［1］。干旱是影響植被生長的氣候災害之一，嚴重限制植物的生長發育，進而給農業及生態環境帶來災難性后果［2］，已成為我國牧草生長最普遍的限制因子［3］。因此，揭示牧草耐旱性特征，培育耐旱性強的優良牧草，對草地生產力提高和人工草地建植具有重要意義。

肥披堿草（Elymus excelsus Turcz.）是禾本科披堿草屬（Elymus L.）多年生的叢生型草本植物，主要分布在東北、華北、西北地區的草原和森林平原等地［4］，具有耐旱、耐寒、春季返青早、葉量較豐富、分蘗拔節持續時間長和生長前期草質較好等優點，為各種家畜所喜食，是一種優質牧草，也是干旱半干旱地區很有栽培前景的草種［5］。但現階段對披堿草屬的研究多集中在老芒麥（Elymus sibiricus）、垂穗披堿草（Elymus nutans）、短芒披堿草（Elymus breviaristatus）等牧草的抗性研究［6-8］和生產性能研究［9-12］方面，而對肥披堿草的耐旱性及其響應機制研究較少，嚴重限制其在干旱半干旱地區的推廣應用。目前，關于肥披堿草轉錄組學分析的研究鮮有報道。轉錄組學技術可實現種質資源和育種材料基因型的快速精準鑒定，實現對重要農藝性狀關鍵調控基因的快速鑒定與挖掘［13］。這有助于了解植物適應逆境脅迫的機制，從而發現植物逆境脅迫相關基因。

本文以前期實驗篩選東北8個野生資源得到的耐旱型（E6）和干旱敏感型（E7）肥披堿草品種為試驗材料，通過比較其在干旱脅迫條件下表型特征、活性氧積累、抗氧化酶活性、滲透調節物質的變化，結合轉錄組分析，進而揭示肥披堿草在幼苗期的耐旱機制，為我國肥披堿草耐旱品種選育提供理論依據和基因資源。

1" 材料與方法

1.1" 試驗材料與處理

基于前期對東北地區8個野生肥披堿草（Elymus excelsus Turcz.）種質資源的耐旱性篩選，本研究選取耐旱型（E6）和干旱敏感型（E7）2種肥披堿草作為試驗材料（表1）。種子由東北農業大學牧草種質資源與育種省級重點實驗室提供，用2%次氯酸鈉溶液消毒10 min，用蒸餾水沖洗5～6次。試驗在溫室中進行，將飽滿種子播撒在裝有等量蛭石花盆（高10 cm，直徑12 cm）內，光周期為16 h/8 h，溫度為20℃～25℃，每2 d澆灌等量1/5 Hoagland營養液［14］。當幼苗生長5周時，使用20%濃度PEG-6000模擬干旱脅迫，并設置4個時間梯度（0 d，3 d，7 d和14 d）進行觀察，每個處理重復3盆，作3次生物學重復。分別采集脅迫不同時間點的植株地上部分，液氮速凍后貯存于-80℃冰箱內以備后續試驗。

1.2" 生理指標測定方法

植株的高度用直尺測量，每個處理測量30株。將植物地上部分置于烘箱105℃殺青30 min，60℃烘干至恒重，天平測量鮮重和干重。超氧化物歧化酶（SOD）含量用WTS-8法測定［15］，過氧化物酶（POD）含量用愈創木酚比色法測定［16］，過氧化氫酶（CAT）含量用鉬酸銨比色法測定［17］，丙二醛（MDA）含量用硫代巴比妥酸法測定［18］，脯氨酸（Pro）含量用酸性茚三酮法測定［19］，可溶性糖（SS）含量用蒽酮比色法測定［20］，超氧陰離子（O-·2）含量用α-萘胺比色法測定［21］，過氧化氫（H2O2）含量用硫酸鈦比色法測定［22］。

1.3" 轉錄組測序

取肥披堿草葉片進行無參轉錄組測序，每個處理設置3個生物學重復。提取處理7 d的肥披堿草RNA后，建立cDNA文庫，再利用Illumina高通量測序平臺進行測序，無參轉錄組測序由北京諾禾致源生物科技有限公司完成。采用RSEM軟件得到每個基因上的readcount數目以分析基因的表達水平，使用DESeq2軟件篩選不同處理間的差異表達基因（Differentially Expressed Genes，DEGs），篩選條件設置為以|log2（FoldChange）| gt; 1的readcount數據且padj lt; 0.05。并在諾禾云平臺上進行GO和KEGG功能注釋統計，選取Top20富集分析term進行后續分析。實時熒光定量PCR差異基因引物序列見表2。在DEGs中隨機挑選10條基因以TUE2為內參進行實時熒光定量PCR分析。

1.4" 統計學分析

采用Excel 2019進行數據整理，雙因素方差分析利用SPSS 22.0軟件，顯著性差異水平為Plt;0.05，數據繪圖采用Graph Prism 8.0.2 繪圖軟件。

2" 結果與分析

2.1" 干旱脅迫下肥披堿草表型及生長變化

本試驗設置不同干旱時間處理肥披堿草，分析植株的表型變化過程。由圖1A可知，耐旱型肥披堿草E6在干旱7 d時，表型狀態良好；在干旱14 d時，葉片發黃。然而干旱敏感型肥披堿草E7在干旱3 d后，葉片已枯黃卷曲，干旱7 d時，整株萎蔫；干旱14 d時，全株呈枯死狀。如圖1B可知，2種肥披堿草在干旱3～14 d內，株高無顯著變化；與干旱敏感型E7相比，耐旱型E6的株高較大。隨著干旱脅迫時間延長，與對照（干旱0 d）相比，E6與E7的鮮重（圖1C）和干重（圖1D）都顯著降低（Plt;0.05）。在干旱脅迫14 d時，E6鮮重和干重的降幅分別為38.30%和54.73%，而E7鮮重和干重的降幅分別為65.98%和70.95%，與干旱敏感型E7相比，耐旱型E6的鮮重和干重降幅較小。由此可知干旱脅迫下，耐旱型E6的表型變化較小，而干旱敏感型E7則表現明顯萎蔫和生長受阻的狀態，說明E6比E7具有更強的抗旱性。

2.2" 干旱脅迫下肥披堿草生理指標的變化

為探究干旱脅迫下2種肥披堿草表型變化的內在機制，本研究進一步測定其生理指標的變化。如圖2所示，干旱脅迫使2種肥披堿草的H2O2含量（Plt;0.05）和O-·2含量（Plt;0.05）呈上升趨勢，SOD、CAT和POD酶活性呈現先上升后下降的趨勢，MDA含量（Plt;0.05）、SS含量（Plt;0.05）和Pro含量（Plt;0.05）均呈現上升趨勢。其中，干旱14 d時耐旱型E6的H2O2顯著低于干旱敏感型E7（Plt;0.05），而SOD和CAT酶活性則顯著高于E7（Plt;0.05），且耐旱型E6的Pro含量達752.55 nmol·g-1，比干旱敏感型（625.11 nmol·g-1）顯著提高了20.39%；SS含量則比干旱敏感型顯著提高了19.11%。

2.3" 干旱脅迫下肥披堿草轉錄組分析

2.3.1" 測序數據質量分析" 為了深入探究肥披堿草在干旱脅迫下分子調控機制的差異，本研究對2種不同耐旱性的肥披堿草種質資源進行無參轉錄組測序。考慮到轉錄組測序需要新鮮組織，并且干旱敏感型肥披堿草在干旱14 d時已呈枯死狀，故選擇對照（0 d）和干旱7 d的肥披堿草進行后續測序分析。對原始數據進行篩選后的堿基識別準確率在99%以上的堿基（Q20）在97.65% ～ 98.04%之間，堿基識別準確率在99.9%以上的堿基（Q30）在93.80%～94.65%，GC （%）均在理論值50%左右，隨后進行轉錄本拼接和基因功能注釋（表3，表4）。本研究測序建庫結果較為理想，為后續深入分析提供了有力支持。

2.3.2" 差異表達基因數量統計" 采用DESeq2軟件進一步篩選比較了2種肥披堿草之間的差異表達基因（DEGs）。耐旱肥披堿草（E6-7 vs E6-0）在干旱脅迫下共有2 346個DEGs上調、1 117個DEGs下調（圖3A）；而干旱敏感型肥披堿草（E7-7 vs E7-0）在干旱脅迫下僅檢測到1797個DEGs上調、854個DEGs下調（圖3B），干旱脅迫下差異表達基因耐旱型顯著多于干旱敏感型。差異基因韋恩圖結果表明，在E6-7 vs E6-0組中檢測到2 346個DEGs上調、1 117個DEGs下調，；在E7-7 vs E7-0組中檢測到1 797個DEGs上調、854個DEGs下調；在E7-7 vs E6-7組中檢測到4817個DEGs上調、4377個DEGs下調。在E6-7 vs E6-0、E7-7 vs E7-0組中檢測到795個DEGs，其中633個DEGs上調、159個DEGs下調。在E6-7 vs E6-0、E7-7 vs E7-0、E7-7 vs E6-7組中檢測到37個DEGs，其中32個DEGs上調、5個DEGs下調（圖4）。

2.3.3" 差異表達基因GO富集分析" 對干旱脅迫下不同肥披堿草的差異表達基因進行GO富集分析，發現耐旱型和干旱敏感型在遭受干旱逆境和對照條件下的生物過程（BP）和分子功能（MF）方面存在較大差異（圖5）。在生物過程方面，耐旱型差異表達基因主要富集在蛋白質加工過程和碳水化合物代謝過程途徑（圖5A）。而干旱敏感型差異表達基因主要富集在跨膜運輸過程和膜質代謝過程途徑（圖5B）。耐旱型和干旱敏感型的差異表達基因均富集在蛋白質磷酸化、DNA整合和磷酸化過程等途徑（圖5C）。在分子功能方面，耐旱型差異表達基因主要富集在氧化還原酶活性、催化活性、作用于蛋白質的催化活性、抗氧化活性、轉移酶活性途徑（圖5A）。而干旱敏感型差異表達基因主要富集在氧化還原酶活性、催化活性、轉運蛋白活性途徑（圖5B）。耐旱型和干旱敏感型的差異表達基因均富集在蛋白激酶活性、ADP綁定、磷酸轉移酶活性和腺苷酸核糖核苷酸結合等途徑（圖5C）。

2.3.4" 差異表達基因的KEGG富集分析" 通過差異表達基因KEGG分析，發現耐旱型和干旱敏感型在對照和干旱脅迫條件下生理代謝途徑差異表達基因數量差異大（圖6）。在耐旱型中，干旱脅迫下顯著富集了MAPK信號通路、谷胱甘肽代謝、卟啉和葉綠素代謝以及精氨酸和脯氨酸代謝等途徑，另外耐旱型在二萜生物合成、氰基氨基酸代謝、抗壞血酸和丙二酸代謝等通路均有富集（圖6A）。而干旱敏感型主要集中在一些次生代謝物途徑如亞油酸代謝、次生代謝物的生物合成等通路（圖6B）。耐旱型和干旱敏感型的差異表達基因在苯丙素生物合成、植物激素信號轉導等通路中均有富集（圖6C）。這表明干旱脅迫下，谷胱甘肽代謝和精氨酸和脯氨酸代謝等可能增加植物抗氧化和滲透調節能力，也可能是耐旱型肥披堿草具有較強耐旱調節適應的重要原因。其中，根據readcount數目進行篩選后發現，5-谷氨酸激酶（proB）、精氨酸酶（rocF）和NAD（H）-谷氨酸脫氫酶（ALDH）在耐旱型E6中差異倍數較大，而在干旱敏感型E7中差異倍數較小。這表明proB，rocF和ALDH可能是耐旱型肥披堿草響應干旱脅迫的關鍵調控基因。

2.3.5" 差異基因熒光定量PCR驗證" 為了驗證轉錄組結果的準確性，隨即選取10個差異基因進一步進行實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測。qRT-PCR檢測到的基因表達水平與測序數據（RNA-seq）的整體差異趨勢基本一致，這表明轉錄組數據是準確可靠的（圖7）。

3" 討論

干旱脅迫下，植物通過形態、生理和基因表達等方面的多種調節反映來適應脅迫［23］。株高是反映植株生長發育的重要指標［24］，鮮重和干重可以反映植物的生長速率。于思敏等［25］發現干旱脅迫使植株的新陳代謝過程受到水分限制減緩，阻礙植株的生長發育。本研究觀察到耐旱型肥披堿草的表型變化較小，保持較好的生長狀態，而干旱敏感型則出現明顯萎蔫和生長受阻的現象。這說明不同肥披堿草之間存在生理功能和代謝過程的差異。

植物受到干旱脅迫時，體內首先產生大量O-·2和H2O2等活性氧，導致膜脂過氧化加劇。隨后，植物收到干旱信號時，其快速啟動活性氧清除系統包括SOD、POD和CAT，從而降低活性氧含量［26］。楊偉等［27］發現，在干旱條件下，耐旱性強的老芒麥材料活性氧積累較少和膜脂過氧化程度較低，表現出較強的抗氧化防御能力。本文對肥披堿草活性氧物質和抗氧化酶活性等指標測定發現，耐旱型E6比干旱敏感型E7表現出較低的活性氧含量和較高的抗氧化物活性，與周潔儀等［28］的研究相一致。這說明干旱脅迫下耐旱型肥披堿草細胞內的活性氧清除系統反應更快速，能夠及時清除植物體內的活性氧有害物質以提高植物的抗旱性。同時富集分析發現，耐旱型肥披堿草的分子功能差異顯著作用于抗氧化活性和轉移酶活性。結合H2O2含量、O-·2含量及相關抗氧化酶活性等生理指標，我們推測肥披堿草通過調控氧化—抗氧化途徑響應干旱脅迫。

滲透調節是植物響應干旱脅迫的一種重要機制，植物通過增加Pro和SS含量，提高溶質濃度、降低滲透勢以抵御逆境脅迫［29］。呂玉茹等［30］發現干旱脅迫下Pro含量在披堿草體內明顯增加，這有助于保持細胞或組織的持水能力，從而保證一定時間段下植物細胞生理過程的正常進行。本研究結果與前人［31］一致。轉錄分析發現脯氨酸代謝途徑參與了植物逆境脅迫響應過程。Zhang等［32］也推測脯氨酸分解代謝過程、精氨酸和脯氨酸代謝中富集的大量基因在植物抗旱性中發揮重要作用。同時，可溶性糖的重要組成之一是蔗糖，謝芳等［33］發現淀粉與蔗糖代謝也是植物響應干旱脅迫的重要富集途徑。本試驗發現，干旱脅迫后，耐旱材料的Pro和SS增量大于敏旱材料，且葉片萎蔫程度較輕。這可能因為Pro積累促進光合作用和蛋白質合成等代謝過程，調節細胞的滲透平衡，提高植物的耐旱性。Liu等［34］研究發現，bHLH122在擬南芥的干旱和滲透脅迫抗性中起重要作用，它調節參與非生物脅迫耐受的基因表達。Wang等［35］研究中發現大多數參與蔗糖和淀粉生物合成過程的基因在耐旱品種中顯著上調，表明更多的蔗糖和淀粉含量可能歸因于其對干旱脅迫的抗性。本研究GO和KEGG富集分析發現，基因顯著富集在精氨酸和脯氨酸代謝途徑等途徑，差異基因的表達模式與生理變化的趨勢一致，這說明Pro和SS等滲透調節物質響應了肥披堿草的干旱脅迫，植物響應干旱脅迫可以通過復雜的轉錄調控網絡和代謝網絡共同實現［36］。

4" 結論

本研究發現肥披堿草通過影響植物形態、減少活性氧產生、增加抗氧化酶活性并積累更多滲透調節物質來緩解干旱脅迫對植株的傷害，其中耐旱型Pro和SS含量在脅迫14 d時比干旱敏感型顯著升高。在轉錄水平上，肥披堿草調控抗氧化活性、轉移酶活性、精氨酸和脯氨酸代謝等途徑中相關基因的表達，提高了肥披堿草幼苗對干旱脅迫的抗性。本研究豐富了肥披堿草轉錄組數據信息，為今后肥坡堿草的轉錄組測序、挖掘耐旱基因和選育品種提供了一定的理論基礎。

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（責任編輯" 彭露茜）