油莎豆CePIP2;1的克隆、亞細胞定位與表達分析

摘""要：油莎豆是一種在塊莖中高水平積累油脂的草本油料作物，其未成熟塊莖的含水量高達85%，水分平衡對于塊莖的發育與代謝至關重要。質膜內在蛋白（PIP）是介導細胞間水分跨膜運輸的主要通道。本研究報道1個塊莖高水平表達的PIP基因CePIP2;1，該基因含有3個內含子，預測編碼288個氨基酸（aa），其理論分子量（MW）為30.34"kDa，等電點（pI）為8.60，總平均疏水指數（GRAVY）為0.529，不穩定系數（Ⅱ）為29.60，屬于典型的穩定、堿性、疏水型蛋白。CePIP2;1含有保守的MIP結構域，ar/R選擇性濾器為F-H-T-R，Froger位點為Q-S-A-F-W，符合高水分轉運活性PIP的特征。進化分析顯示，CePIP2;1與OsPIP2;1、OsPIP2;2和OsPIP2;3聚在一起，序列相似性分別為91.72%、90.31%和84.98%，支持其歸為PIP2亞類。亞細胞定位分析顯示，CePIP2;1定位在煙草葉片的細胞膜。進一步的表達分析顯示，雖然CePIP2;1為主要的塊莖表達PIP基因，但其在葉片、葉鞘、匍匐莖和根等組織中的表達豐度更高，最高的為葉片，而在芽尖中的表達豐度與塊莖相當；在塊莖的4個典型發育時期（S1～S4）中，CePIP2;1基因呈現先升后降的鐘形趨勢，表達豐度最高的是S2。這些結果為解析油莎豆的水分平衡機制奠定基礎。

關鍵詞：油料作物；塊莖；水通道蛋白；質膜內在蛋白；亞細胞定位；表達模式中圖分類號：S565.9""""""文獻標志碼：A

Cloning，"Subcellular"Localization，"and"Expression"Analysis"of"CePIP2;1，"an"Aquaporin"Gene"from"Tigernut"（Cyperus"esculentus"L.）

ZOU"Zhi，"ZHENG"Yujiao，"CHANG"Lili，"ZHAO"Yongguo

National"Key"Laboratory"for"Tropical"Crop"Breeding"/"Institute"of"Tropical"Biosciences"and"Biotechnology，"Chinese"Academy"of"Tropical"Agricultural"Sciences"/"Sanya"Research"Institute"of"Chinese"Academy"of"Tropical"Agricultural"Sciences，"Haikou，"Hainan"571101，"China

Abstract："Tigernut"（Cyperus"esculentus"L.）"is"an"herbaceous"oil"crop"uniquely"accumulating"a"high"level"of"oil"in"the"underground"tubers."Water，"which"accounts"for"approximately"85%"of"immature"tubers，"is"essential"for"tuber"development"and"metabolism."Plasma"membrane"intrinsic"proteins"（PIPs）"represent"the"main"channel"that"mediates"the"efficient"water"transport"across"the"cell"membrane."This"study"presents"the"characterization"of"CePIP2;1，"a"PIP"gene"highly"abundant"in"tigernut"tubers."This"gene"with"three"introns"was"shown"to"encode"288"amino"acids"with"the"theoretical"molecular"weight"of"30.34"kDa，"the"isoelectric"point"of"8.60，"the"grand"average"of"hydropathicity"of"0.529，"and"the"instability"index"of"29.60，"implying"it’s"stable，"basic"and"hydrophobic"characteristics."The"protein"was"shown"to"possess"one"conservative"MIP"（major"intrinsic"protein）"domain，"and"presence"of"the"F-H-T-R"ar/R"selectivity"filter"and"Q-S-A-F-W"Froger’s"positions"implies"a"putatively"efficient"water"transport"activity."Phylogenetic"analysis"revealed"that"CePIP2;1"clusters"with"OsPIP2;1，"OsPIP2;2，"and"OsPIP2;3"with"the"similarities"of"91.72%，"90.31%"and"84.98%，"respectively，"supporting"its"assignment"into"the"PIP2"group"of"the"PIP"subfamily."Subcellular"localization"analysis"showed"that"CePIP2;1"was"localized"to"the"cell"membrane"of"Nicotiana"benthamiana"leaves."Although"CePIP2;1"was"characterized"as"a"dominant"isoform"in"tubers，"expression"analysis"indicated"that"its"transcripts"were"relatively"more"in"leaves，"leaf"sheaths，"rhizomes，"and"roots"with"the"most"in"leaves，"in"contrast"to"a"comparable"level"to"that"in"shoot"apexes."Among"four"typical"stages"（S1–S4）"of"tuber"development"examined"in"this"study，"CePIP2;1"was"shown"to"exhibit"a"bell-shaped"expression"pattern，"peaking"at"S2."These"results"laid"a"solid"foundation"for"further"uncovering"the"mechanism"of"water"balance"in"tigernut.

Keywords："oil"crop;"tuber;"aquaporin;"plasma"membrane"intrinsic"protein;"subcellular"localization;"expression"profile

DOI："10.3969/j.issn.1000-2561.2024.07.005

質膜內在蛋白（plasma"membrane"intrinsic"protein，"PIP）隸屬于水通道蛋白（aquaporin，"AQP）家族，其以定位在細胞膜且具有高效的水分轉運活性而著稱[1]。除水分外，PIP還可以轉運尿素、硼酸、CO2、H2O2、O2和Na+[2]。在高等植物中，PIP亞族的成員數介于2～28個不等，可以分為PIP1和PIP2兩個進化小組[3-9]。目前晶體結構已解析的有菠菜（Spinacia"oleracea）PIP2;1、擬南芥（Arabidopsis"thaliana）PIP2;1（PIP2或PIP2A）和AtPIP2;4（PIP2F）[10-12]。研究表明，PIP在細胞膜上以四聚體的形式起作用，每個單體包含6個跨膜螺旋（TM1～TM6）和5個連環（LA、LB、LC、LD和LE），其中，LB、LD、N端和C端位于胞質，而LA、LC和LE位于胞外；LB和LE折向膜內形成2個半螺旋，半螺旋的頂端含有高度保守的NPA基序，起排斥質子并決定通道大小的作用；位于TM2、TM5和LE上的4個保守殘基（H2、H5、LE1和LE2）決定了底物特異性，因H2和LE2分別為芳香氨基酸和精氨酸而被稱為ar/R選擇性濾器[10]。此外，FROGER等[13]從甘油通道蛋白（glyceroporin，"GLP）中鑒定到區別于AQP的5個殘基，即P1為芳香氨基酸、P2為酸性氨基酸、P3為堿性氨基酸、P4為脯氨酸以及P5為非芳香氨基酸。除轉錄外，PIP還受翻譯后修飾（如磷酸化、甲基化、乙酰化、泛素化、糖基化、脫酰胺基）、二聚化、轉運、門控（如二價陽離子、pH、磷酸化）和蛋白互作等調控[10-11，"14]。位于SoPIP2;1"LA的C69為二聚體的形成所必須；位于LD的H193和L197為門控位點；位于LB的S115、LD的S188以及位于C端的S274為門控調控磷酸化位點[10]。

油莎豆（Cyperus"esculentus"L.），俗稱黃色道格拉斯（yellow"nutsedge）、虎堅果（tigernut），是一種隸屬于禾本目莎草科的新型草本油料作物[15-19]。不同于傳統油料作物在種子中積累油脂，油莎豆是迄今唯一已知在塊莖中高水平積累油脂的作物，這使其成為研究營養組織油脂代謝與調控的模式[20-23]。塊莖起源于地下匍匐莖，其發育過程可分為起始、膨大和成熟等3個主要階段；前2個階段的含水量高達85%，而在成熟期發生類似種子的脫水過程，含水量逐漸降低到45%以下[17，"20]。水分平衡對于塊莖的發育乃至油脂和淀粉等儲藏物的積累至關重要[20]，因而挖掘塊莖中的關鍵PIP基因具有重要的理論意義和應用價值。本研究對1個塊莖高水平表達的PIP基因進行了克隆和初步鑒定，以期為揭示塊莖的水分平衡機制奠定基礎。

1""材料與方法

1.1""材料

研究所用油莎豆品系為熱研3號，植株種植于中國熱帶農業科學院文昌實驗基地[21]，待塊莖起始后分別采集1"d（起始期，S1）、20"d（膨大中期，S2）、25"d（膨大晚期，S3）和35"d（成熟期，S4）的樣本，每樣本3次生物學重復。本氏煙草（Nicotiana"benthamiana）用小缽種在中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所溫室[24]。大腸桿菌（Escherichia"coli）DH5α和含pSoup-P19的農桿菌（Agrobacterium"tumefaciens）GV3101感受態均由本實驗室制備和保存；亞細胞定位載體pNC-HbPIP2;3-RFP[25]和pNC-Cam1304-SubN由本實驗室保存；各類酶、試劑盒和生化試劑購自相應的試劑公司。本研究所用數據庫、軟件及其網址詳見表1。

1.2""方法

1.2.1""總RNA的提取與反轉錄""采用天根植物多糖多酚RNA提取試劑盒提取上述塊莖的總RNA，經濃度和完整性檢測合格后用賽默飛反轉錄試劑盒合成cDNA第一鏈，用于后續的基因克隆與表達分析。

1.2.2""基因克隆與載體構建""前期通過分析油莎豆的轉錄組數據[21]，發現1個在塊莖中高水平表達的PIP基因，根據序列特征和進化關系將其命名為CePIP2;1。為克隆該基因，采用Primer"Premier"5.0設計如表2所示的引物對，首先用CePIP2;1F/R擴增其1127"bp的全長cDNA，接著以稀釋100倍的首輪PCR產物作為模板、CePIP2;1HF/R為引物擴增907"bp的全長編碼區（CDS）。反應體系：模板0.5"μL、引物各0.5"μL、PrimeSTAR"Max"DNA"Polymerase"12.5"μL，加ddH2O至25"μL。PCR擴增程序：95"℃預變性1"min；94"℃變性30"s、50"℃退火2"min，35個循環；72"℃延伸5"min。亞細胞定位載體pNC-Cam1304-CePIP2;1的構建參照NC克隆試劑盒說明書。

1.2.3""基因和蛋白結構分析""采用BLASTn將基因的轉錄本序列比對到基因組，然后用GSDS"2.0軟件展示基因結構。分別采用Protparam、CDD、SOPMA、SWISS-MODEL、WoLF"PSORT等軟件分析CePIP2;1編碼蛋白的理化特性、保守結構域、二級結構、3D結構和亞細胞定位。跨膜螺旋和半螺旋區及保守氨基酸基于與SoPIP2;1、AtPIP2;1和AtPIP2;4的序列比對進行確定。

1.2.4""多序列比對和進化分析""多序列比對采用MUSCLE軟件，選用默認參數；進化樹的構建采用MEGA"6.06軟件，選用最大似然法，1000次重復，其他用默認參數。

1.2.5""亞細胞定位分析""以先前報道的pNC-"HbPIP2;3-RFP[25]為陽性對照，參照文獻[24]進行農桿菌的轉化、培養及浸染液的制備。將含pNC-Cam1304-CePIP2;1的實驗組與陽性對照菌液等量混合后采用微量注射器注射4周齡的煙草葉片，轉化48"h后用激光共聚焦顯微鏡Zeiss"LMS880觀察熒光在細胞內的位置。

1.2.6""基因表達分析""為分析基因的組織特異性，參照文獻[23]，采用StringTie（v2.2.0）軟件將不同組織的轉錄組數據（PRJNA703731）比對到基因組，基因的相對表達豐度用FKPM（fragments"per"kilobase"of"exon"per"million"fragments"mapped）法進行均一化。熒光定量分析以先前報道的CeUCE2和CeTIP41[18]作為內參基因，利用引物對CePIP2;1Fq/Rq進行qRT-PCR分析，數據分析采用2-△△CT法，統計分析采用SPSS"20軟件，采用鄧肯法進行單因素多樣本間差異顯著性方差分析。

2""結果與分析

2.1""CePIP2;1基因的克隆與序列分析

經過2輪巢式PCR擴增，成功分離到CePIP2;1的CDS序列，并采用無縫克隆技術將其克隆到亞細胞定位載體，構建重組質粒pNC-Cam1304-CePIP2;1。通過將克隆到的序列比對到基因組，發現其與CePIP2;1基因的對應區域完成一致；CePIP2;1位于Scaffold9正向鏈的879960～884243位，基于轉錄組的轉錄區界定顯示基因全長為5752"bp，包含3個內含子，其長度分別為806、1745、866"bp；5'和3'"UTR分別為119、1349"bp（圖1A）。

序列分析顯示，CePIP2;1編碼288個氨基酸（表3），其中，A和G的含量最高，分別占12.50%和12.20%，這與SoPIP2;1、AtPIP2;1和AtPIP2;4類似（圖1B）；CePIP2;1的理論分子量（MW）為30.34"kDa、等電點（pI）為8.60、脂肪族指數（AI）為103.02、總平均疏水指數（GRAVY）為0.529、不穩定系數（Ⅱ）為29.60，表明其為穩定的堿性疏水型蛋白；CDD分析顯示蛋白的32～269位為MIP結構域（圖1C），略長于SoPIP2;1、AtPIP2;1和AtPIP2;4（表3）；CePIP2;1與SoPIP2;1、AtPIP2;1、AtPIP2;4的序列相似性分別為84.88%、84.14%、84.35%，其結構包括TM1～TM6等6個典型的跨膜螺旋、HB和HE"2個半螺旋、2個典型的NPA基序、多個磷酸化位點（S105、S124、S283和S286）；ar/R選擇性濾器（F90-H219-T228-R234）和對應于SoPIP2;1"C69的二聚化位點、S115的磷酸化位點及H193和L197門控位點在所比較的4個蛋白中完全一致；在5個Froger位點中，僅P1存在差異，SoPIP2;1為M141-S226-A230-F245-W246，而CePIP2；1為Q150-

S235-A239-F254-W255（圖1D）。

為揭示CePIP2;1的進化關系，將其與SoPIP2;1及水稻、擬南芥中的所有PIP構建如圖1E所示的進化樹。多數成員按物種聚在一起，暗示相關成員在物種分化之后產生。CePIP2;1與OsPIP2;1、OsPIP2;2、OsPIP2;3聚在一起，其序列相似性分別為91.72%、90.31%和84.98%。二級結構預測顯示，CePIP2;1以無規則卷曲（45.49%）和α-螺旋為主（29.51%），其次是延伸鏈（20.83%），最低的為β-轉角（4.17%），與SoPIP2;1、AtPIP2;1和AtPIP2;4類似（表3）。基于SoPIP2;1的同源建模顯示，CePIP2;1可以形成同源四聚體（圖1F）。

2.2""亞細胞定位分析

與其他PIP蛋白類似[24-25]，WoLF"PSORT在線軟件預測顯示CePIP2;1定位在細胞膜。為驗證該結果，本研究以先前報道的HbPIP2;3[25]作為陽性對照，將含pNC-HbPIP2;3-RFP和pNC-Cam1304-"CePIP2;1的農桿菌工程菌等量混合后微量注射煙草葉片。共聚焦觀察結果顯示，GFP-CePIP2;1的綠色熒光信號出現在細胞膜，并與HbPIP2;3-RFP的紅色熒光信號高度重合，這表明CePIP2;1確實是定位在細胞膜（圖2）。

2.3""基因表達分析

為揭示CePIP2;1基因表達的組織特異性，利用轉錄組數據分析其在幼嫩葉片、成熟葉片、葉鞘、根、匍匐莖、芽尖和塊莖等主要組織中的表達模式。結果顯示，CePIP2;1在這些組織中均高水平表達，豐度最高的是葉片（幼嫩和成熟葉片差異不顯著），最低的為芽尖，其與塊莖豐度相當（圖3A）。

為揭示基因表達與不同發育時期塊莖含水量之間的相關性，挑選自塊莖形成起始期（S1）、膨大中期（S2）、膨大晚期（S3）和成熟期（S4）等4個典型時期，其含水量分別為83.7%、86.0%、74.8%和48.3%[17]。qRT-PCR分析結果如圖3B所示，CePIP2;1基因呈先升后降的趨勢，峰值出現在S2，約為S1的1.5倍；豐度最低的是S4，僅為S1的8%；S3僅為S2的30%。

3""討論

水是生命的主要存在形式，廣泛參與體內的各項生理生化反應，為植物的生長發育和代謝活動所必需[2]。研究表明，植物細胞間水分的跨膜運輸主要由細胞膜定位的PIP介導[1，"2]。進化分析顯示，PIP高度保守，僅包含PIP1和PIP2兩個亞類；雖然他們早在苔蘚中就已分化形成，但二者之間的序列相似性一般在70%以上[3-9，"26]。PIP通常具有高效的水分轉運活性[2]。雖然有研究表明PIP1亞類在酵母和蟾蜍卵母細胞等體外體系中無活性或活性很低，主要歸因于其自身不能有效定位到細胞膜[27-28]。在植物體內，PIP2的存在可以介導PIP1的有效定位[27-29]。

在前期的研究中，本團隊系統分析了塊莖的發育特征及發育過程中的含水動力學，發現在我國海南地區塊莖的整個發育期約為35"d，其中，前、中期伴隨著細胞的快速分裂和擴張，水分含量一直維持在85%，而后期隨著塊莖的成熟，水分含量逐步降低，25"d和35"d分別為74.8%和48.3%[17]，發生類似種子的脫水過程[17，"30]。雖然如此，至今對油莎豆塊莖發育的水分平衡機制知之甚少。

本研究首次報道了1個油莎豆PIP2基因CePIP2;1。與大多數PIP基因類似[3-9]，CePIP2;1含有3個內含子；其編碼蛋白包含AQP家族特有的MIP結構域，分子量為30.76"kDa，與先前的報道相似[5-9，"25-26]。CePIP2;1具有較高的脂肪族指數（95.28），且總平均疏水指數gt;0、等電點gt;7.0、不穩定系數為lt;40，屬于典型的穩定、堿性、疏水型蛋白。在水稻的13個PIP蛋白中，CePIP2;1與OsPIP2;1的序列相似性最高（91.72%），略高于與OsPIP2;2的90.31%，但遠高于與OsPIP1的72.19%～74.59%，這與本研究的結果一致，支持其劃歸為PIP2亞類。此外，CePIP2;1具有SoPIP2;1[10]、AtPIP2;1[11]和AtPIP2;4[12]相似的結構特征，其中包括典型的NPA基序、F-H-T-R"ar/R選擇性濾器、Q-S-A-F-W"Froger位點、位于LA高度保守的C殘基、可形成四聚體，并且被實驗證實定位在煙草葉片的細胞膜，這些均表明CePIP2;1可能具有高效的水分轉運活性。雖然CePIP2;1首先是作為1個塊莖高豐度PIP基因而被關注，但組織特異性分析顯示它在其他組織中的表達豐度更高，暗示其功能的重要性。在塊莖的發育過程中，CePIP2;1呈現先升后降的表達模式，即隨著細胞的快速分裂和擴張，CePIP2;1的表達迅速上調，至膨大中期達到峰值，而在成熟過程中逐漸下調，這與相應時期的水分含量趨勢基本一致[17]。雖然如此，CePIP2;1具體是如何調控塊莖及其他組織的水分平衡還有待深入研究，比如門控調控、翻譯后修飾、蛋白互作模式以及調控其轉錄的上游轉錄因子。

綜上，本研究完成了塊莖高水平表達CePIP2;1基因的克隆與初步鑒定，明確了其基因結構、序列特征、進化關系、亞細胞定位和表達特性，這為進一步的功能分析及油莎豆遺傳改良奠定了堅實的基礎。

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