調經湯經鐵死亡途徑干預早發性卵巢功能不全的網絡藥理靶點分析及活性成分預測

[摘要]"目的"通過網絡藥理學及生物信息學方法，探索臨床效方調經湯通過鐵死亡途徑治療早發性卵巢功能不全（premature"ovarian"insufficiency，POI）的有效靶點和活性藥物成分預測。方法"通過中藥系統藥理學分析平臺、用于傳統中藥分子機制挖掘生物信息學分析工具數據庫獲取調經湯的活性成分和靶基因，使用人類基因綜合數據庫、藥物靶點數據庫、Drugbank獲取POI的疾病靶點，并通過Venn獲取交集靶點。利用鐵死亡數據庫、Cytoscape及STRING軟件構建調經湯通過鐵死亡途徑治療POI的核心靶基因網絡。使用DAVID數據庫對調經湯治療POI和鐵死亡相關的預測靶點進行基因本體和生物學途徑富集分析。通過基因表達總表（gene"expression"omnibus，GEO）數據庫獲取POI疾病生物學差異基因進一步提取關鍵靶點進行分析，并通過分子對接驗證活性小分子藥物成分結合力。結果"調經湯13種中藥中共篩選出154種活性成分，與POI相關靶點101個，鐵死亡相關基因共23個。富集分析顯示主要涉及通路為磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B（phosphatidylinositol-4，5-bisphosphate"3-kinase/protein"kinase"B，PI3K/Akt）信號通路、低氧誘導因子-1信號通路等。通過GEO數據庫篩得調經湯通過鐵死亡途徑干預POI的關鍵靶點為糖原合成酶激酶3β（glycogen"synthase"kinase-3β，GSK-3β）、小窩蛋白-1（caveolin-1，CAV1）、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian"target"of"rapamycin，mTOR）和蛋白激酶C"α（protein"kinase"C"alpha"gene，PRKCA），這些基因在POI疾病中表達量均降低。分子對接結果顯示CAV1-槲皮素、GSK-3β-木犀草素具有較穩定的結合能力。結論""網絡藥理學結果提示鐵死亡途徑可能是調經湯治療POI的重要機制，GSK-3β、CAV1、mTOR和PRKCA等靶點及PI3K/Akt信號通路或在其中發揮重要作用。

[關鍵詞]"早發性卵巢功能不全；鐵死亡；生物信息學；調經湯

[中圖分類號]"R271.1""""""[文獻標識碼]"A""""[DOI]"10.3969/j.issn.1673-9701.2024.24.006

Network"pharmacological"target"analysis"and"active"component"prediction"of"Tiaojing"decoction"intervention"in"premature"ovarian"insufficiency"by"ferroptosis"pathway

WANG"Weiyu，"YAN"Hang，"ZHANG"Wenyu，"MA"Decong，"WANG"Lu

Department"of"Gynecology，"the"Third"Affiliated"Hospital"of"Zhejiang"Chinese"Medicine"University，"Hangzhou"310005，"Zhejiang，"China

[Abstract]"Objective"To"explore"the"effective"target"and"active"ingredient"prediction"of"premature"ovarian"insufficiency"（POI）"treated"by"Tiaojing"decoction"by"ferroptosis"pathway"by"network"pharmacokogy"and"bioniformatics."Methods"The"active"ingredients"and"target"genes"of"Tiaojing"decoction"were"obtained"through"traditional"Chinese"medicine"systems"pharmacology"database"and"analysis"platform"（TCMSP）"and"bioinformatics"analysis"tool"for"molecular"mechanism"of"traditional"Chinese"medicine"databases，"disease"targets"for"POI"were"obtained"by"using"GeneCards，"therapeutic"target"database"and"Drugbank，"and"intersection"targets"were"obtained"by"Venn."Core"target"gene"network"of"Tiaojing"decoction"in"treatment"of"POI"were"constructed"through"the"ferroptosis"pathway"by"ferroptosis"database，"Cytoscape"and"STRING"software."Then，"the"DAVID"database"was"used"to"perform"gene"ontology"and"biological"pathway"enrichment"analysis"on"the"predicted"targets"related"to"ferroptosis"of"POI"treated"with"Tiaojing"decoction."Subsequently，"differential"genes"in"biology"related"to"POI"were"obtained"through"the"gene"expression"omnibus"（GEO）"database"for"further"extraction"of"key"targets，"and"the"binding"affinity"of"active"small"molecule"drug"components"were"verified"through"molecular"docking."Results"A"total"of"154"active"ingredients，"101"targets"related"to"POI"and"23"genes"related"to"ferroptosis"were"selected"from"13"kinds"of"traditional"Chinese"medicines"in"Tiaojing"decoction."The"enrichment"analysis"showed"that"the"main"involved"pathways"were"phosphatidylinositol-4，"5-bisphosphate"3-kinase/protein"kinase"B"（PI3K/Akt）"signaling"pathway"and"hypoxia"inducible"factor-1"signaling"pathway."Through"GEO"database"screening，"the"key"targets"of"Tiaojing"decoction"in"intervening"POI"through"ferroptosis"pathway"were"glycogen"synthase"kinase-3β"（GSK-3β），"caveolin-1"（CAV1），"mammalian"target"of"rapamycin"（mTOR）"and"protein"kinase"C"alpha"gene"（PRKCA），"all"expression"of"which"reduced"in"POI."The"results"of"molecular"docking"showed"that"CAV1-quercetin"and"GSK-3β-luteolin"had"stable"binding"ability."Conclusion"The"network"pharmacology"results"suggest"that"the"ferroptosis"pathway"may"be"an"important"mechanism"of"Tiaojing"decoction"in"treatment"of"POI，"GSK-3β，"CAV1，"mTOR，"PRKCA"and"other"targets，"as"well"as"PI3K/Akt"signaling"pathway，"may"play"important"roles"in"them.

[Key"words]"Premature"ovarian"insufficiency;"Ferroptosis;"Bioinformatics;"Tiaojing"decoction

早發性卵巢功能不全（premature"ovarian"insufficiency，POI）指在女性40歲之前出現的卵巢功能減退，主要表現為月經異常、促卵泡激素（follicle-stimulating"hormone，FSH）水平升高、雌激素波動性下降[1]。由于雌激素分泌減少，常導致月經不調和生育力低下甚至不孕[2]。過早喪失卵巢功能還可增加骨骼脆性及心血管和神經認知障礙的風險[3]。因此，亟需探索有效的POI干預措施。

鐵死亡指受調節的細胞發生脂質過氧化，從而產生鐵依賴性累積達致死水平呈現的程序性細胞死亡[4]。研究證明鐵死亡在POI中發揮重要作用，堿核蛋白1（basonuclin"1，BNC1）通過神經纖維素2重組蛋白?與Yes相關蛋白（recombinant"neurofibromin"2-Yes-associatednbsp;protein，NF2-YAP）途徑觸發卵母細胞鐵死亡導致卵泡過早活化和濾泡閉鎖過多，使BNC1突變的小鼠表現出POI癥狀[5]。因此卵巢相關功能細胞發生鐵死亡可能是POI疾病發生的重要病理過程。

調經湯是陳木扇女科流派傳承人陳學奇醫師治療POI的經驗方，由當歸、川芎、白芍、生地黃、熟地黃、白術、黃芪、山藥、香附、丹參、續斷、紫石英和淫羊藿組成，具有調和氣血、陰陽及肝、脾、腎的作用[6]。目前已有較多調經湯的相關研究，但調經湯能否通過鐵死亡途徑干預POI疾病進程仍未明確[6-8]。本研究擬聯合生物信息學數據庫和網絡藥理學研究方法，探究調經湯治療POI的潛在機制，為調經湯治療POI提供基礎研究支持。

1""材料和方法

1.1""網絡藥理學研究

1.1.1""調經湯活性成分相關靶點的獲得與篩選""利用中藥系統藥理學分析平臺（traditional"Chinese"medicine"systems"pharmacology"database"and"analysis"platform，TCMSP）聯合用于傳統中藥分子機制挖掘生物信息學分析工具（bioinformatics"analysis"tool"for"molecular"mechanism"of"traditional"Chinese"medicine，BATMAN-TCM）數據庫獲取調經湯活性成分的相關靶點，利用UniProt數據庫進行基因名稱標準化處理。

1.1.2""POI疾病靶點的獲得與篩選""基于人類基因綜合數據庫（GeneCards）、藥物靶點數據庫（therapeutic"target"database，TTD）、Drugbank數據庫檢索關鍵詞“premature"ovarian"insufficiency（POI）”，建立POI相關靶點集合，去除重復數據，得到POI疾病靶點。

1.1.3""調經湯活性成分治療POI潛在靶點的預測""運用Draw"Venn"Diagram軟件導入活性成分靶點與疾病靶點，取其交集得到調經湯活性成分治療POI的潛在作用靶點。

1.1.4""調經湯活性成分-靶點網絡構建及核心靶點蛋白相互作用網絡（protein-protein"interaction，PPI）""運用Cytoscape3.7.2軟件構建活性成分-靶點網絡，選擇Network"Analyzer對節點進行分析，獲取核心靶點。可視化表達中藥-活性成分-靶點的相互關系。同時將核心靶點導入STRING"11.0數據庫，刪除無相互作用的靶點，最后對PPI網絡進行可視化處理。

1.1.5""鐵死亡機制相關靶點的獲取""基于鐵死亡數據庫（ferroptosis"database，FerrDb）查找鐵死亡機制相關靶點，利用Venn"Diagram軟件篩選與1.1.4中核心靶點的交集部分，在Cytoscape軟件中利用cytoHubba插件篩選degree算法獲取最佳基因進行可視化處理。

1.1.6""基因本體功能和京都基因與基因組百科全書通路富集分析""將調經湯活性成分通過鐵死亡機制治療POI的靶點導入DAVID數據庫，物種選擇“Homo"sapiens”進行京都基因與基因組百科全書（Kyoto"Encyclopedia"of"Genes"and"Genomes，KEGG）通路富集分析和基因本體（gene"ontology，GO）功能分析，再將結果導入聯川數據平臺進行可視化處理。

1.2""GEO芯片差異性分析

在GEO數據庫中以“premature"ovarian"insufficiency”為關鍵詞，設置表達類型為“Expression"profiling"by"array”進行篩選。利用R語言GEOquery包進行讀取、數據下載，提取表達矩陣，對原始數據進行log2轉化，利用limma包以|log2FC|gt;1、Plt;0.05為條件進行芯片數據的差異性分析。采用ggplot"2包繪制火山圖，pheatmap包繪制熱圖。

1.3""GEO芯片中重要差異基因表達量提取

將調經湯通過鐵死亡機制干預POI疾病的核心靶點的基因轉換，篩選GEO芯片中的交集差異基因表達，以柱狀圖形式呈現基因表達差異。

1.4""分子對接

對調經卵湯治療POI的排名靠前的主要候選化合物與核心靶點進行分子對接驗證。蛋白質晶體結構由蛋白質結構數據庫（ProteinData"bank，PDB）、對接小分子庫由Pubchem通過搜索中藥活性成分獲取并建立。使用Discovery"Studio"2019"Client"軟件進行受體結構準備工作。隨后在Dock"Ligands中進行精準分子對接，找到結合能最佳匹配的蛋白復合物與配體進行圖像展示。

2""結果

2.1""調經湯活性成分及靶點

基于TCMSP、BATMAN-TCM等數據庫共獲得調經湯的活性成分179種，其中當歸2種、川芎7種、白芍13種、生地黃2種、熟地黃2種、白術7種、黃芪15種、山藥16種、香附18種、丹參65種、續斷8種、淫羊藿24種，見圖1。對應靶點117個。

2.2""調經湯通過鐵死亡途徑治療POI的相關靶點預測

從GeneCards、TTD、DrugBank等數據庫得到疾病靶點6308個，與調經湯靶點取交集后得到共同靶點101個，見圖2A。進一步將101個共同靶點與FerrDb數據庫取交集，得到鐵死亡相關基因共23個。其中包括與炎癥、免疫相關的白細胞介素（interleukin，IL）-6、V-rel網狀內皮細胞病毒癌基因同源物A（V-rel"reticuloendotheliosis"viral"oncogene"homolog"A，RELA），與氧化損傷相關的低氧誘導醌氧化還原酶1[NAD（P）H"dehydrogenase，quinone"1，NQO1]、核因子（網織紅細胞衍生2）樣2（nuclear"factor"erythroid"2-related"factor"2，NFE2L2），與缺氧死亡相關的HIF-α，與調控細胞增殖、分化相關的糖原合成酶激酶-3β（glycogen"synthase"kinase-3β，GSK-3β）、促分裂原活化蛋白激酶8"（mitogen-activated"protein"kinase"8，MAPK8）、表皮生長因子受體（epidermal"growth"factor"receptor，EGFR）等，見圖2B。

2.3""調經湯通過鐵死亡機制干預POI相關基因富集分析

GO富集分析顯示，涉及生物過程（biological"process，BP）153個條目，細胞組分（cellular"component，CC）22個條目，分子功能（molecular"function，MF）47個條目，將BP、CC、MF結果按P值大小升序排列后，其中排名前10位的富集信息在聯川生物云平臺進行可視化分析，見圖3A。結果顯示藥物作用靶點與有絲分裂細胞周期的正向調節、晝夜節律調節、細胞對氧化應激的反應等BP有關；與細胞質、細胞核、染色質及轉錄因子復合體等CC有關；與蛋白結合、酶結合及DNA結合等MF有關。KEGG分析顯示共涉及55個信號通路，其中排名靠前的通路有pathways"in"cancer、PI3K/Akt信號通路、叉頭框蛋白O信號通路（forkhead"box"O"signaling"pathway，FoxO），見圖3B。

2.4""GEO數據庫中篩選野生型與POI小鼠基因表達差異

通過對GSE194196數據庫基因差異表達富集分析后，發現其中336個基因在POI中顯著上調，502個基因在POI中顯著下調，見圖4A。通過熱圖分析找到表達差異程度，見圖4B。這些差異表達基因中與前述鐵死亡相關POI差異基因共同篩選得到4個核心基因：CAV1、GSK-3β、mTOR、PRKCA，其在數據集中的表達差異顯著，見圖4C～圖4F。

2.5""信號通路

在對2.3中鐵死亡機制下調經湯干預POI的KEGG通路分析中，PI3K/Akt通路是排名靠前的作用通路；在對2.4差異基因分析中發現最核心的差異表達基因GSK3β、mTOR、PRKCA均在PI3K/Akt通路上發揮作用，見圖5。

2.6""分子對接

基于活性成分與潛在作用靶點的對應關系，將核心靶點蛋白與藥物活性成分進行分子對接，結合熱能越低提示受體與配體結合性越好，分子對接結果見表1。結果提示槲皮素-CAV1、木犀草素-GSK3β具有較穩定的結合能力，使用DS軟件對其進行可視化分析，見圖6。

A."GSE194196數據集中上調和下調的差異表達基因，其中紅色實心點圖代表上調表達基因，藍色實心點圖代表下調表達基因；B."差異表達基因在各組樣本中的表達水平熱圖，紅色代表高表達基因，藍色代表低表達基因。C.～F."GSE194196數據集中差異表達基因與前述鐵死亡相關POI差異基因。C."CAV1基因；D."GSK3β基因；E."mTOR基因；F."PRKCA基因。*Plt;0.05，#Plt;0.01

3""討論

POI在中醫學中根據其臨床表現歸于“月經后期”“不孕癥”“閉經”等范疇，《陳素庵婦科補解》調經總論中記載陳木扇女科調經特色思想，POI可參照其中“經水后期方論”“經水不當絕而絕方論”等論治[9-10]。陳學奇醫師結合多年臨床經驗認為POI的發生涉及腎、脾、肝及心四臟的生理功能，在卵泡發育過程中腎氣充盛、脾胃健運、肝氣疏泄有度、心主血脈有節才可使氣血旺盛通暢、沖任通盛、血海滿溢、卵泡成熟并排出、月經如期來潮；當腎虛精虧、肝脾失調、心火上炎則會沖任失調、卵泡發育困難或卵子雖成熟卻難以排出，終至經停[11-12]。因此，陳學奇醫師根據多年臨床經驗以調經湯治療POI，治以補腎為主，佐以健脾、疏肝、養心，補虛瀉實，使氣血通暢、陰陽平衡、血海充盈、胞宮及卵巢得養[11，13]。

調經湯中當歸、白芍補血養肝；川芎活血調經；生熟地黃滋陰養血補腎，促進卵泡發育；黃芪、山藥、白術益氣健脾，固本培元；續斷、紫石英和淫羊藿溫腎助陽，改善黃體功能；香附、丹參活血化瘀，使補而不滯，滋而不膩，使氣血生化有源，氣機調暢，以達滋陰扶陽補腎、和氣理氣養血的功效。本研究發現調經湯中槲皮素及木犀草素是發揮抗鐵死亡作用的重要活性成分。分子對接結果顯示槲皮素-CAV1、木犀草素-GSK-3β具有較穩定的結合能力。槲皮素存在于黃芪中，是一種天然黃酮類化合物，具有強大的抗氧化和抗炎作用[14]。卵巢細胞出現脂質過氧化是發生鐵蓄積的前提，也是卵巢功能下降的重要原因[15]。研究表明，一方面，槲皮素可逆轉顆粒細胞線粒體功能障礙及通過PGC1-α途徑激活線粒體生物發生，抑制去乙酰化酶3介導的超氧化物歧化酶2賴氨酸68乙酰化，從而增加顆粒細胞抗氧化應激能力，改善卵巢功能[16]；另一方面，木犀草素存在于丹參中，同樣具有強大的抗氧化作用。木犀草素可通過核因子E2相關因子2信號通路，促進抗氧化劑谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione"peroxidase，GPx）、氯霉素乙酰轉移酶基因（chloramphnicolnbsp;acetyltransferase，CAT）、谷胱甘肽等表達，改善大鼠卵巢形態，保護卵巢功能[17]。

通過對4個鐵死亡相關基因功能分析，確定GSK-3β、CAV1、mTOR和PRKCA為卵巢功能細胞的保護基因。其中GSK-3β參與PI3K/Akt信號通路、FoxO和Wnt信號通路（Wnt"signaling"pathway，WNT）等多條信號通路傳導。Wang等[18]發現WNT2可抑制小鼠顆粒細胞的細胞質中GSK-3β的表達，幫助細胞周期G1到S的轉化，促進細胞增殖。CAV1是一種膜結合支架蛋白，調控細胞增殖、侵襲、細胞死亡和脂質代謝，參與抗氧化[19]。已有研究表明，女性卵巢中CAV1基因表達下調可影響Notch2信號通路，導致富含亮氨酸的含有G蛋白偶聯受體5的重復序列減少，從而導致POI[20]。細胞實驗已證實CAV1是鐵死亡“抑制劑”[21]。此外，mTOR是細胞生長和增殖的重要調節基因。在小鼠卵泡中，mTOR通路于排卵前在顆粒細胞丘細胞中被選擇性激活以促進卵泡發育和存活[22]。Han等[23]發現通過活化AMPK-mTOR信號通路傳導和降低GPX4表達水平來增強自噬可誘導鐵死亡。而PRKCA是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，具有調節細胞增殖、存活和轉移的功能[24]。在卵母細胞中，抑制PRKCA表達可破壞PI3K/Akt通路的傳導，抑制細胞發生減數分裂[25]。本研究篩選的GEO數據集中，POI患者PRKCA表達顯著低于對照組，可見PRKCA的差異表達在POI的細胞鐵死亡過程中值得關注。

本研究的GO和KEGG富集分析表明，調經湯可通過調控PI3K/Akt、低氧誘導因子-1、FoxO信號通路作用于POI疾病過程，這反映中藥復方多靶點多通路的治療策略。4個核心靶基因中GSK-3β、CAV1和mTOR是PI3K/Akt通路上的重要節點。研究發現卵泡的發育受PI3K信號通路的幾種成分調節，包括Akt、GSK-3α和GSK-3β[26]；卵母細胞中PTEN特異性缺失可通過PI3K誘導Akt活化，從而觸發原始卵泡活化[27]。不僅如此，Akt家族中的Akt1發生磷酸化后，可磷酸化一系列抑制增殖和促進細胞凋亡的下游靶蛋白，包括FoxO3a、Bcl-xL/Bcl-2相關死亡啟動子和mTOR，在卵泡顆粒細胞的死亡和卵母細胞的周期進程中發揮重要作用[28]。可見PI3K途徑對卵母細胞生長和卵泡活化很重要。因此，結合本研究對GEO數據集的信息提取，筆者發現卵巢細胞中多種鐵死亡相關基因差異表達或可解釋POI的發生機制。

綜上所述，調經湯治療POI是一個多成分、多靶點、多通路的過程。調經湯通過GSK-3β、CAV1、mTOR、PRKCA和PI3K/Akt等參與調節卵巢功能細胞鐵死亡過程。同時，本研究利用分子對接技術驗證調經湯中活性成分與POI中鐵死亡相關靶點之間的相互作用，為進一步探索其分子機制提供依據。但由于中藥復方成分的多樣性和作用機制的復雜性，單純依靠網絡藥理學和生物信息學對其預測具有一定局限性。為更好地解釋調經湯通過調控細胞鐵死亡治療POI的機制，還需進一步開展藥物質譜分析及體外、體內實驗驗證。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

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