畢節市煤礦非靶向代謝產物分析

摘" 要：對畢節市市內采集的3類瓦斯濃度不同的煤礦礦石樣本進行非靶向代謝產物分析，以了解其分布情況、豐度等信息。采集市內距離相近的3類不同瓦斯濃度煤礦礦石，使用色譜儀聯合質譜儀進行檢測，并對檢測數據進行分析。在3類礦石中標注到化合物369種，其中，氨基酸、多肽和類似物（Amino acids， peptides， and analogues）占12.97%，某種數據庫未描述的化合物（Not Available）占12.97%，脂肪酸和偶聯物（Fatty acids and conjugates）占5.48%，為占比最靠前的3類化合物；低瓦斯煤礦（Ao）與高瓦斯煤礦（Bo）差異化合物87種、低瓦斯煤礦（Ao）與突出瓦斯煤礦（Co）差異化合物64種，高瓦斯煤礦（Bo）與突出瓦斯煤礦（Co）差異化合物100種。該研究較為系統地觀察畢節市內3類不同瓦斯濃度煤礦的生物代謝產物，分析它們之間存在的差異和可能的原因，并作KEGG信號通路預測，為本區域內的煤礦開采、疾病防治、礦區生物相關研究等提供參考數據。

關健詞：煤礦；代謝組學；環境代謝組學；微生物；小分子代謝物

中圖分類號：R313" " " 文獻標志碼：A" " " " " 文章編號：2095-2945（2024）33-0091-05

Abstract： Non-targeted metabolite analysis was carried out on three types of coal mine ore samples with different gas concentrations collected in Bijie City to understand their distribution， abundance and other information. Three types of coal mine ores with different gas concentrations with similar distances in the city were collected， tested using a chromatograph combined with a mass spectrometer， and the detection data were analyzed. 369 compounds were marked in three types of ore， including amino acids， peptides， and analogues which accounted for 12.97%， a compound not described in the database （not available） accounted for 12.97%， fatty acids and conjugates accounted for 5.48%， making it the top three types of compounds; there are 87 different compounds between low gas coal mines（Ao） and high gas coal mines（Bo）， 64 different compounds between low gas coal mines （Ao） and outburst gas coal mines（Co）， and 100 different compounds between high gas coal mines （Bo） and outburst gas coal mines（Co）. This study systematically observed the biological metabolites of three types of coal mines with different gas concentrations in Bijie City， analyzed the differences and possible reasons between them， and predicted the KEGG signal path to provide reference data for coal mining， disease prevention and control， and bio-related research in mining areas in the region.

Keywords： coal mine; metabolomics; environmental metabolomics; microorganisms; small molecule metabolites

環境代謝組學是一門新興的學科，其主要用于研究和提示環境中天然生存的細胞、組織或生物體內的小分子代謝物及其相互作用，通過對環境樣品的高通量分子檢測和分析，代謝組學能夠提供基于宏數據下關于生理生態學、生態毒理學、疾病學等多學科的豐富信息。目前，基于高效液相色譜儀串聯質譜儀的方式成為代謝組學研究的主流平臺，其原理是將待測樣本均質化處理為流相微粒后，使其在質譜儀中于特定條件下規律涌動，之后與數據庫內的化合物數據作全面對比，從而可以精準測定出樣本內化合物的種類和豐度，對環境生境內的化合物作全面的了解，并對差異環境生境中的物質作分析。目前，這種方法廣泛受到醫學、環境科學、食品科學的重視，已被超前學科應用于眼科疾病診斷、腫瘤學研究、作物營養價值評估和環境影響因子尋找等多學科方向[1]。鑒于現有數學方法的改進，通過數據關聯，還可以發現意想不到的關系和代謝物反應，并提供環境內生物的功能性預測抑或是疾病相關性等方面的評估[2]。煤礦的原生環境中含有豐富的微生物構成，這些微生物的存在對環境產生的影響及其間的關系已成為交叉學科應用研究的熱點，未來有望在礦區復墾、感染預防、瓦斯治理等方面得到規模化的應用[3-4]。由于深埋的煤礦環境下其他生物較少，故微生物在煤礦環境中可能成為影響生物代謝的最重要一環，但目前國內外缺乏針對煤礦環境生物代謝的相關研究，因此本研究采用高通量非靶向代謝產物檢測的方法對煤儲豐富的畢節市內煤礦進行調查，系統地分析市內距離相近的3類不同瓦斯濃度煤礦礦石生境內代謝產物，為本區域內的煤礦開采、疾病防治和礦區生物相關研究等提供數據參考。

1" 研究方法

1.1" 主要試劑與儀器

滅菌鑷子（杭州微生物科技有限公司）、采集袋（比克曼生物科技有限公司）、冷凍真空濃縮儀（Maxi Vacbeta，GENE COMPANY）、Q Exactive高分辨質譜儀（Thermo Fisher Scientific，USA）、Waters UPLC I-Class Plus（Waters，USA）、甲醇（上海振興化工二廠）、乙腈（上海振興化工二廠）和超純水儀（上海和泰儀器有限公司）等。

1.2" 標本采集與標記

選擇畢節市內煤礦密度較高的區域采樣，以保證樣本的代表性；根據瓦斯濃度的不同，以距離相近的3類不同瓦斯濃度（低瓦斯煤礦、高瓦斯煤礦、突出瓦斯煤礦）煤礦內的礦石為采集對象，以盡量減少環境變化帶來的影響。本次采集到低瓦斯煤礦（標記為Ao，經緯度：106.11°E，27.32°N）、高瓦斯煤礦（標記為Bo，經緯度：106.22°E，27.38°N）、突出瓦斯煤礦（標記為Co，經緯度：106.17°E，27.38°N）共3組礦石，其中煤礦瓦斯濃度為突出瓦斯煤礦高于高瓦斯煤礦高于低瓦斯煤礦，采樣均在井下約500 m深度的礦井中人為活動較少的地方進行，每組煤礦各采集環境重復樣本4個礦石以做統計學分析，采集時嚴格進行無菌操作以避免人為污染，采集到的礦石放入專用采集袋，標記后立即將樣本放入冷藏保溫箱待用。

1.3" 礦石樣本非靶向代謝產物測定和數據分析

在超凈工作臺內將樣本在緩慢解凍后，置于管中，加入提取液（甲醇∶乙腈∶水=2∶2∶1，-20 ℃預冷）和內標液，放入研磨儀中研磨，水浴超聲后，冰箱靜置。離心后取上清，置于冷凍真空濃縮儀抽干后，加入復溶液進行復溶后離心，取上清置于上樣瓶中。色譜條件：所使用的色譜柱為BEHC18色譜柱（Waters，USA），以含甲酸的水和甲醇作正離子相，另外以含甲酸銨的水和甲醇作負離子相，設定流速達0.35 mL/min并穩定，柱溫在45 ℃對樣本進行梯度洗脫。質譜條件：采集一級信息條件設定如下，質譜掃描質核比范圍調整為70～1 050，一級分辨率調整為70 000，AGC設調整為3e6，最大注入時間（Injection Time，IT）調整為100 ms。按照母離子強度，選擇Top3模式進行碎裂；采集二級信息條件設定如下，二級分辨率為17 500，AGC為1e5，最大注入時間（Injection Time，IT）為 50 ms，碎裂能量（Stepped Nce）設置為20、40、60 eV。離子源（ESI）參數設置：鞘氣流速（Sheath Gas Flow Rate）為40，輔助氣流速為10，噴霧電壓（Spray Voltage）正離子模式為3.80，負離子模式為3.20，離子傳輸管溫度（Capillary Temperature）為320 ℃，輔助氣加熱溫度為350 ℃。下機后使用metaX對軟件導出結果進行進一步的處理，以獲得可以用于正式分析的化合物和定量值，獲得的數據與HMDB（www.hmdb.ca）數據庫進行比對和注釋，然后對其注釋的情況進行統計，進一步使用數據通過單變量分析和多變量分析來篩選2個生物組別間的差異代謝物，對比并繪制PLS-DA分析圖和Upset圖；另外，使用獲得的數據與KEGG數據庫（http：//www.genome.jp/kegg）對比以獲得關鍵生物信號通路相關信息，繪圖及統計使用R語言軟件。

2" 結果

2.1" 檢測情況

在正離子模式和負離子模式2種模式下檢測到的離子數詳見表1；PLS-DA分析結果如圖1所示，各個坐標點的距離代表了樣本間聚集和離散程度，距離越近表明樣本間相似性越高，距離越遠表明樣本間差異性越大。

2.2" HMDB化合物注釋情況

所有樣本標注到的化合物如圖2所示，通過HMDB數據庫比對，整體標注到多種化合物，標注出前20種，其余合并為其他（others），根據化合物豐度排列，前三的化合物為：氨基酸、多肽和類似物（Amino acids， peptides， and analogues）占比為12.97%，某種數據庫未描述的化合物（Not Available）占比為12.97%，脂肪酸和偶聯物（Fatty acids and conjugates）占比為5.48%。進一步分別對3組樣本進行兩兩比對，差異化合物結果如圖3所示。Ao與Bo有87個差異化合物，Ao與Co有64個差異化合物，Bo與Co有100個差異化合物，這些差異化合物集中在羧酸和衍生物（Carboxylic acids and derivatives）、脂肪酰胺（Fatty Acyls）、有機羥基化合物（Organooxygen compounds）、苯及其取代衍生物（Benzene and substituted derivatives）、有機氮化合物（Organonitrogen compounds）等。

2.3" KEGG信號通路預測情況

KEGG預測發現代謝產物與植物次生代謝產物生物合成（Biosynthesis of plant secondary metabolites），α-亞麻酸代謝（Alpha-Linolenic acid metabolism），丙烷、哌啶和吡啶類生物堿的生物合成（Tropane， piperidine and pyridine alkaloid biosynthesis），甘油磷脂代謝（Glycerophospholipid metabolism）等多種信號通路有關，如圖4所示，在圖中本研究列出排名前20的重要相關信號通路。

3" 討論與結論

煤炭是含有豐富的碳、氫、氧、硫、磷和氟等元素的化石燃料，因此成為一些微生物選擇駐存的環境有機物，人們已經開始把這些微生物與煤炭之間微妙的相互作用用于工業生產中，如利用煤儲層生物改造加強煤層氣開采、使用甲烷氧化菌降解礦內瓦斯等[5-6]，而微生物群落在礦質上的生存會產生代謝產物，這些代謝產物將對環境造成影響。本研究中觀察到在3類地質條件相近的煤礦中，存在豐富的代謝產物構成，其中氨基酸和多肽類物質（Amino acids， peptides， and analogues）占比最高，它們是蛋白質基本構成單位和碳基生物的功能基本載體[7]，此結果契合了煤礦環境中豐富的微生物群落構成，目前工業微生物的應用仍處在探索階段，人們正在嘗試結合基因工程技術改造微生物的能力，從而推進微生物的規模化工業應用[8]；另外，脂肪酸類化合物（Fatty acids and conjugates）也在本次檢測中有較高的豐度，這類化合物除作為生物一般代謝產物觀察外，現發現該類化合物對某些環境影響因子有一定的響應預警作用[9]，在煤礦工業中的應用價值值得進一步研究；有趣的是，本研究發現一類數據庫未描述的化合物（Not Available）豐度在礦石中較高，這可能是區域性特有的代謝產物，其潛在功能性仍待發掘。在對3類煤礦的差異代謝產物對比中，一些常見的生物有機化合物差異較大，這說明3類煤礦中微生物的群落和分布是可能存在較大差別的。此外，發現哌啶類化合物、吲哚及其衍生物和黃酮類化合物存在差異，此3類化合物與藥物有相關性，哌啶類如氯雷他定、地洛他定類抗組胺藥等，吲哚類如吲哚美辛等非甾體類抗炎藥等，黃酮類如鹽酸黃酮哌酯等，說明在煤礦天然環境中存在潛在的產藥菌群且它們受到環境的影響較大，其中煤礦瓦斯濃度是可能的影響因素，使用PLS-DA分析對比了3類不同瓦斯濃度煤礦的所有代謝產物集合，證實了它們之間的相對離散關系，但在檢測到的化合物總量上三者沒有顯著區別（Pgt;0.05）。基于獲得數據，本研究進一步對化合物涉及的生物信號通路作了功能預測，結果中可以見到如α-亞麻酸代謝（Alpha-Linolenic acid metabolism）等多種與常見微生物一般生存代謝相關的預測作用通路[10]，但發現有植物次生代謝產物生物合成（Biosynthesis of plant secondary metabolites）、膽汁合成（Bile secretion）等動植物相關的其他通路，這說明盡管處于深埋環境，微生物仍然不是影響環境代謝的唯一因素。

本研究系統地觀察了畢節市內3類不同瓦斯濃度煤礦的代謝產物，并分析了3類瓦斯濃度不同的煤礦代謝產物的差異，為本區域該類環境中的生物代謝情況提供了基本參考數據，其中氨基酸、多肽和類似物（Amino acids， peptides， and analogues），某種數據庫未描述的化合物（Not Available），脂肪酸和偶聯物（Fatty acids and conjugates）為環境內豐度最高的化合物，數據庫未描述的化合物（Not Available）可能是區域環境內的特有化合物；3類不同瓦斯濃度煤礦中存在多種差異化合物，說明在3類不同瓦斯濃度的煤礦中，可能受瓦斯濃度的影響，環境生物代謝有一定的差別；KEGG預測分析發現多種微生物、動植物相關代謝通路。

參考文獻：

[1] JACOB G B， MATTHEW P D， MARK R V. Environmental metabolomics： a critical review and future perspectives[J].Metabolomics，2009（5）：3-21.

[2] MYRNA J S. Application of metabolomic methods to evaluate the impact of pollutants on soil organisms：Recent progress and future perspectives[J].Current Opinion in Environmental Scienceamp;Health，2023（31）：100431.

[3] 鄭微，袁龍珍，王建花，等.煤礦復墾區不同植被對土壤可培養微生物多樣性和理化性質的影響[J].中國農學通報，2023，39（7）：81-87.

[4] 杜林琳.煤礦井下微生物群落組成及其與環境間相互關系研究[D].沈陽：遼寧大學，2023：1-65.

[5] 嚴程，梅娟，趙由才.好氧甲烷氧化菌及其工程應用進展[J].生物工程學報，2022，38（4）：1322-1338.

[6] BO Y， LI Z， MENG J， et al. Reformation of coal reservoirs by microorganisms and its significance in CBM exploitation[J].Fuel，2024（1）：130642.

[7] 羅鵬云，李巖竣，左新秀，等.蛋白質寡聚化的活體檢測技術及其研究進展[J].科學通報，2024（4）：1-13.

[8] 劉偉.二種典型工業微生物基因組編輯系統構建及高產含硫氨基酸衍生物[D].杭州：浙江大學，2019：1-147.

[9] 宋宇迪，樊昊心，姚槐應.納米銀脅迫下土壤微生物磷脂脂肪酸的響應特征[J].武漢工程大學學報，2023，45（6）：655-662.

[10] 慕春龍，李軒，吳海琴，等.微生物群系與動物消化道營養[J].中國科學：生命科學，2023，53（5）：626-636.