免疫細胞治療產品生產用質粒生產質量管理指南

（2023-05-10發布2023-06-01買施）

前言

本文件按照GB/T 1.1-2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規則》的規定起草。

請注意本文件的某些內容可能涉及專利。本文件的發布機構不承擔識別專利的責任。

本文件由上海藥品審評核查中心提出。

本文件由上海醫藥行業協會歸口。

本文件起草單位：上海藥品審評核查中心、江蘇省藥品監督管理局審核查驗中心、上海市生物醫藥科技發展中心、上海藥明生基醫藥科技有限公司、上海醫藥行業協會。

本文件主要起草人：李香玉、王立新、俞佳寧、王金偉、成殷、孫程潔、宋丹、黨可純、孫神敏、卜修民、李積宗、史彤、梁銀杏、高楊、譚建新、梁海蘭、汪偉、夷征宇、吳耀衛、朱蓓芬。

本文件首批執行單位：無錫生基醫藥科技有限公司、上海藥明巨諾生物科技有限公司、上海科濟制藥有限公司、上海優卡迪生物醫藥科技有限公司、上海邦耀生物科技有限公司、上海賽比曼生物科技有限公司、上海微知卓生物科技有限公司、南京馴鹿生物醫藥有限公司、南京傳奇生物科技有限公司、南京北恒生物科技有限公司、合源生物科技（天津）有限公司、北京藝妙神州醫藥科技有限公司。

1范圍

本文件適用于生產免疫細胞治療產品體外基因修飾系統用的質粒的生產質量管理。

2規范性引用文件

下列文件中的內容通過文中的規范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。

藥品生產質量管理規范（2010年修訂）及其附錄

中華人民共和國藥典（2020年版）

藥品記錄與數據管理要求（試行）

無菌工藝模擬試驗指南（無菌制劑）

3術語和定義

下列術語和定義適用于本文件。

3.1免疫細胞治療產品immune cell therapy products

指源自人體（自體／異體）細胞或人源細胞系的細胞，經過體外操作，包括但不限于分離、純化、培養、擴增、誘導分化、活化、遺傳修飾、細胞庫（系）的建立、凍存復蘇等，再輸入或植入到患者體內，通過誘導、增強或抑制機體的免疫功能而治療疾病的免疫細胞治療產品。

3.2質粒plasmid

系細菌等生物中染色體以外的環狀DNA元件，具有自主復制能力，使其在子代細胞中能保持恒定的拷貝數，并表達所攜帶的遺傳信息。

3.3細菌種子批bacterial bank

指通過將質粒轉化宿主菌，經單克隆篩選及培養傳代后建立的種子庫。

3.4體外基因修飾系統ex vivo genetic manipulation system

指在人體外，將外源基因等導入細胞，通過添加、替代、補償、阻斷、修正特定基因從而為獲得細胞治療產品或細胞治療產品生產用種子細胞而使用的修飾系統。

3.5生產區域production area

指建筑物內一組特定的用于生產操作的房間，通常配備相對獨立的空調系統（包括通風、溫度和必要的濕度調節，以及必要的空氣過濾凈化）和人、物流通道。

3.6密閉系統closed system

指為了避免產品或物料暴露于室內環境而設計和操作使用，且可經驗證的系統。

4基本要求

4.1質粒作為體外基因修飾系統的生產用起始關鍵物料，被用于將目的基因轉染到基因修飾載體中（如慢病毒載體），進一步生產免疫細胞治療產品。此類質粒通常不直接作用于免疫細胞治療產品，其生產、檢驗和放行管理應參考《藥品生產質量管理規范》及其相關附錄的要求，應根據其使用于不同的研發階段、不同的基因修飾載體及免疫細胞治療產品及其不同的生產工藝需求，企業可以根據風險評估的結果確定生產過程中適用GMP要求的符合程度。

4.2早期研發階段中應重點關注質粒的設計和構建，考慮元件的功能性和安全性，一般應避免使用B -內酰胺類抗生素抗性基因，在采用土撥鼠肝炎病毒轉錄后調控元件等有風險的調控元件時，應經過充分風險評估，在必要時進行相應安全性改造。

4.3質粒的生產應重點關注生產用原材料的質量控制、批間差異、雜質水平、工藝中間控制、污染控制等可能影響免疫細胞治療產品安全性、有效性的因素；質粒的質量控制方面應重點關注安全性和轉染有效性相關項目，如超螺旋比例、宿主DNA殘留、宿主RNA殘留、宿主蛋白殘留等。如果質粒生產或質量控制發生變更，應進行充分研究和評估，關注變更對質粒質量的影響，也應將對體外基因修飾系統及免疫細胞治療產品的影響納入考慮范圍。

4.4對于采用多個質粒瞬時共轉染工藝生產體外基因修飾載體的情形（如三質粒或者四質粒系統），質粒分為含有目的基因的轉移質粒和在轉染過程中發揮輔助作用的通用型輔助質粒兩種類別，兩類質粒的生產技術要求和質量控制原則應保持一致。

4.5藥品上市許可持有人（MAH）對質粒的質量負有責任。

5技術要求

5.1機構與人員

5.1.1企業應設置與質粒生產相適應的生產管理、質量管理、供應鏈管理等部門，參考藥品生產要求的質量管理體系，各部門應有明確的職責。

5.1.2企業應當配備與產品生產、檢驗與質量管理相適應的技術人員，具有適當資質和豐富實踐經驗的操作人員和管理人員。參與質粒生產和檢驗的人員應當具備產品相關知識，有書面文件明確其相關職責。

5.1.3參與質粒生產和檢驗的人員應接受相關的衛生、病原微生物處理、無菌操作（如適用）等相關專業培訓。

5.2廠房與設備

5.2.1生產用廠房設施應根據質粒產品特性，生產工藝流程和工藝控制要求設計，充分考慮人流、物流的合理性，盡可能減少人流和物流交叉污染的風險，宜采用廢棄物單向流設計，確保不對質粒產品造成污染。

5.2.2質粒發酵區域作為有菌操作區應與純化區域物理分開，宜配備獨立的空調凈化系統，并關注預防交叉污染的措施。

5.2.3生產區內應提供生產用壓縮空氣、純蒸汽、制藥用水等公用介質，并進行定期監測。關注工藝用水的流向設計，應避免倒流，防止污染及交叉污染。

5.2.4生產的關鍵設備應進行計量、確認與驗證，與產品直接接觸的設備或者耗材宜使用一次性系統，以有效地防止污染和交叉污染；使用非一次性系統，應采取適當措施降低污染的風險，使用后的房間和設備需進行適當清潔，設備清潔方法應經過驗證。

5.2.5對于發酵、純化等生產關鍵步驟，宜采用電子化系統控制設備，可參考《藥品生產質量管理規范》計算機化系統附錄、《藥品記錄與數據管理要求（試行）》的要求，對電子化系統進行多級賬號管理，并納入計算機化系統，以確保數據的可靠性、真實性和可追溯性。

5.2.6質粒生產應在受控環境中進行，環境需采取有效控制措施并進行日常監測，以盡可能降低環境微生物及顆粒等對產品可能造成的污染，操作環境的潔凈度級別宜按照表1中的示例進行選擇。

5.3生產管理

5.3.1一般要求

質粒生產應依照已批準的工藝規程和操作規程進行操作并有相關記錄，確保生產過程的有效控制，持續、穩定地生產出符合質量要求的產品。

5.3.2分批原則

企業應當建立劃分質粒產品生產批次的規則，生產批次的劃分應當能夠確保同一批次產品質量和特性的均一性。原則上來源于同一工作菌種發酵獲得菌體經同一生產周期裂解、純化后的獲得質量和特性均一的產品為一批。若不同批次工作菌種發酵獲得的菌體經裂解純化步驟后合并進行分裝成最終成品的，應評估可能存在的風險并經相應的驗證。質粒生產日期不得遲于產品分裝前經最后混合的操作開始日期。

5.3.3工藝驗證

5.3.3.1應基于產品研發階段、質粒特點、質粒工藝是否相同等因素結合質量風險管理原則進行風險評估，確定各質粒工藝確認或驗證的批次和方案，如工藝過程控制確認、中間產物貯存穩定性研究、多批次質量分析以及雜質清除研究等。

5.3.3.2通常轉移質粒（含有目的基因）工藝驗證一般應包含三個連續成功的工藝生產批次，如需減少輔助質粒驗證批次，首次驗證應根據風險評估結果，選擇其中一種有代表性的質粒進行三批次工藝驗證，其他質粒工藝驗證可根據風險評估結果制定驗證方案。商業化生產中應進行持續的工藝確認，如因變更需要進行再次驗證時，可根據風險評估結果確定合理的工藝驗證批次。

5.3.4污染和交叉污染

質粒產品生產過程中應當基于產品特性以及工藝流程，采取有效措施防止污染和交叉污染，控制質量風險，如：

a）宜采用密閉系統進行生產，如發酵采用密閉式發酵罐系統。生產過程中有產品暴露的操作時，宜采取合理措施降低操作帶來的污染風險，如在生物安全柜中操作等。密閉系統發生意外開啟或泄漏的，應當進行風險評估并采取有效的應急措施；

b）不同品種的質粒應采用階段性生產方式進行生產，生產品種輪換時應按照批準的清場操作規程進行清潔和清場，清潔程序應經過驗證；

c）采用密閉系統生產的，同一生產操作區域或同一培養箱內可同時進行同一品種的不同批次品生產，但應當采取有效措施避免批間污染及混淆；

d）宜采用一次性使用系統進行生產，尤其是與產品直接接觸的耗材，如菌種培養搖瓶、管道、除菌過濾器等等。如采用重復使用的設備及物料，應在使用后按照批準的清潔程序進行清潔及適當的監測，清潔程序應當經過驗證；

e）不同品種質粒純化生產時與產品介質接觸的過濾器、中空纖維柱、膜包、層析介質等應按照品種專用，不得共用。過濾器、中控纖維柱、膜包等一次性耗材的材質應經過溶出析出評估或測試。重復裝填層析柱應對層析柱保存、清洗、安裝工藝進行研究。層析介質及膜包等壽命應經過評估或驗證；

f）含有工程菌的料液、檢測剩余的樣品及廢棄物等，應采取適當措施滅活后方可移出生產區域，防止其污染廠房、設施及產品；

g）采用密閉系統生產的，產品或物料被轉入密閉系統時，必須以非暴露的方式（例如通過無菌連接器或密閉轉移系統）進行，避免產品或物料暴露于室內環境。如需打開密閉系統（例如進行暴露的無菌操作、安裝過濾器或進行組件連接等），在回到密閉狀態或者使用前需要進行消毒或滅菌（非無菌環境下暴露），且應對其“回到密閉狀態”的能力進行必要的確認或驗證；

h）質粒最終成品為無菌產品的，無菌生產工藝的驗證可參考《藥品生產質量管理規范》無菌藥品附錄、《無菌工藝模擬試驗指南（無菌制劑）》的要求，確保其無菌保證水平滿足要求。如采用無菌工藝模擬試驗等方式確認質粒無菌生產操作的無菌保障的有效性。

5.3.5混淆和差錯

質粒生產過程中宜采取有效的措施避免物料、產品和廢棄物的差錯和混淆，如密封轉移、交替操作、定置管理、滅菌與消毒以及傳遞等過程中應做好標識管理。

5.3.6其他

質粒的生產過程中，應重點關注裂解等特殊工序的工藝時限，避免產生額外的殘留物或工藝雜質、產品相關雜質。中間產物如需儲存，應視情況開展必要的中間產物貯存穩定性研究。

5.4物料管理

5.4.1質粒生產用物料的管理應遵循質量風險管理的原則，結合物料的預期用途、物料的質量屬性、供應商的資質等制定物料風險等級分級及控制策略。對于物料的分級，可參考《中國藥典三部》生物制品生產用原材料及輔料質量控制通則中對生物制品原材料及輔料的分級原則，根據原材料的來源、生產以及對最終細胞治療產品潛在的毒性和外源因子污染風險等，結合質粒本身在細胞治療產品中的作用，確定生產用關鍵原材料的范圍及入廠檢驗和放行的要求。

5.4.2應避免使用人源或動物源性材料。如需使用，應開展外源因子等安全性相關的風險評估與研究。

5.4.3生產過程中應避免使用B-內酰胺類抗生素，如需使用其他種類的抗生素，應對抗生素的殘留量進行控制和安全性評估。

5.4.4質粒發酵應盡可能選擇分析純或更高級別的物料，質粒純化及后續生產工序使用的物料宜選擇藥用級，對于無藥用級別的，應參照《藥品生產質量管理規范》對物料管理的要求，經風險評估后，選擇適宜級別的物料。

5.4.5下游生產過程中使用的與產品直接接觸的關鍵一次性耗材，應進行適用性和生物安全性風險評估，根據風險評估結果來決定是否需要開展進一步研究或驗證。質粒使用的內包裝材料，應對其密封性、無菌性和相容性進行評估，并考慮其可能存在的核酸酶對質粒的影響。

5.4.6供應商提供的研究數據可作為評估支持材料，如引用供應商數據，須對數據的適用性進行評估。

5.4.7應建立質粒生產用原材料、內包裝材料、關鍵一次性耗材的質量管理流程，如供應商質量評估、驗收標準、入庫驗收、儲存、有效期／復驗期管理等。

5.5細菌種子批

5.5.1細菌種子批是生產質粒的起始原材料，應充分考慮宿主菌的來源、基因型、表型、既往使用經驗和生產需求等因素，如使用新型菌株，需關注其可能引入的額外風險。

5.5.2按照《中國藥典三部》生物制品生產檢定用菌毒種管理及質量控制通則的要求完成二級或三級細菌種子批的建庫和檢定，主種子批和工作種子批建庫環境應參照《藥品生產質量管理規范》的要求。對于生產不同質粒使用的主種子批和工作種子管理，應通過區分物料編號、標簽管理、儲存管理等多種方式，避免不同細菌種子批在儲存或使用過程中發生混淆或交叉混淆。建庫過程中應避免使用β-內酰胺類抗生素，如需使用其他種類的抗生素，應對抗生素的殘留量進行安全性評估或控制，應盡量避免使用人源或動物源的材料。

5.5.3基于細菌主種子批和細菌工作種子批的制備方法，合理設定細菌種子批的檢定項目。細菌種子批檢定項目一般包括細菌形態學鑒別、染色鏡檢、生化特性分析、菌種基因型鑒定、菌種純度、抗性檢查、活菌數、質粒限制性內切酶圖譜分析、質粒全序列鑒定、噬菌體檢查等。檢測方法需經過研究、確認或驗證。通過質量控制應確保不存在其它細菌、真菌和噬菌體的污染，以及確保目的基因序列和其他元件序列的準確性。

5.5.4開展全面的傳代穩定性研究，宜根據質粒序列準確性、質粒限制性內切酶圖譜、質粒保有率、質粒拷貝數等研究結果明確細菌種子批的限定傳代代次。

5.5.5根據細菌種子批在貯存條件下和時長內種子批的活菌數、質粒保有率等研究結果制定合理的貯存條件和有效期。

5.6工藝控制

5.6.1應當制定質粒生產工藝規程并經過批準，工藝規程中應明確質粒產品的關鍵質量屬性（如適用）、生產工藝流程、關鍵工藝參數和控制范圍、中間控制項目及控制標準。應制定生產操作規程，對生產操作步驟等進行詳細說明，以確保生產過程的有效運行和有效控制。

5.6.2質粒的生產通常以細菌種子批為起始原材料，其工藝分為上游工藝和下游工藝。上游工藝包括種子擴增及發酵、菌體收獲、菌體裂解等步驟；下游工藝包括層析、超濾／滲濾、除菌過濾及灌裝等步驟，最終制備成質粒成品。典型質粒生產關鍵工藝步驟和工藝控制點如下：

a）種子擴增：取工作種子批，復蘇，使用搖床或生物反應器進行逐級擴增培養，培養至細菌滿足發酵生產接種要求。培養過程中應對培養基組成、培養溫度、轉速、培養時間及細菌懸液光密度（Optical Density，OD）值等工藝參數進行監控；

b）發酵生產：通常使用適當生產規模的生物反應器進行高密度細菌發酵培養，收獲菌體懸液。發酵過程中應對接種量、發酵培養基組成、發酵培養溫度、pH、溶氧量、攪拌轉速、補料培養基組成、補料時間和速率、收獲時間、菌體懸液OD值等工藝參數進行監控；

c）菌體收獲及裂解：發酵菌體懸液通過高速離心或切向流過濾等方式去除培養上清液和菌體外雜質，收集菌體，在一定條件下使細胞部分或者全部破碎進行菌體裂解，將質粒、宿主DNA、宿主蛋白、細菌內毒素等細胞內物質釋放到胞外。菌體處理通常采用堿裂解方式，應對裂解過程中菌體濃度、裂解液（配方、濃度或pH值）、裂解時間、攪拌轉速（如適用）等相關參數進行關注，裂解后進行中和、沉淀（如適用）及澄清處理，去除宿主DNA、宿主蛋白、宿主RNA、細菌內毒素等，此過程中還應關注中和緩沖液的組成、加入時間、加入量以及中和完全程度；

d）超濾／滲濾1：對收獲的澄清液進行濃縮洗濾，進一步去除宿主DNA、宿主蛋白、宿主RNA、細菌內毒素等。過程中應對濃縮倍數、洗濾倍數及跨膜壓等參數進行監控；

e）層析純化：采用多步層析步驟提純質粒，提升超螺旋比例，去除宿主DNA、宿主蛋白、宿主RNA、細菌內毒素等，通常選用凝膠層析、親和層析、疏水層析和離子層析等填料介質，利用分子量、特異性結合、疏水性、電荷等方法進行雜質去除。層析過程中應對層析柱載樣量、線性流速、洗雜和洗脫條件（pH、鹽濃度等）、收集峰起止點進行監控；

f）超濾／滲濾2：對層析收獲液進行超濾濃縮和換液，通過該步驟將質粒DNA置換到質粒保存液中，經濃縮并調節至符合目標產品濃度后，進行下一步除菌過濾和無菌灌裝。應對置換倍數、跨膜壓、產品濃度等參數進行監控；

g）除菌過濾和灌裝：采用除菌過濾器進行除菌過濾，除菌過濾后在A級環境下進行分裝。質粒最終成品為無菌產品的，質粒產品灌裝的全過程應當保證無菌和避免污染和交叉污染，并進行相關監控，應基于風險評估的結果確定灌裝的生產形式和方式，其生產形式和方式應經過無菌工藝驗證。

5.6.3應規定生產過程中各步驟的工藝時限及過程中物料、中間產品和最終產品的儲存條件，并采取有效的管理控制措施確保符合儲存要求。物料、中間產品和最終產品如需轉運，應當對轉運條件有明確的規定，如溫度、時限等，對于有特殊溫度要求的物料、中間產品和最終產品的轉運，在轉運過程中應進行相應的監測并有記錄。

5.6.4生產工藝過程中任何偏離生產工藝規程的情況均應當有記錄，應對偏差進行評估、調查并制定糾正和成預防措施，有效防止類似偏差的再次發生。5.7質量控制

5.7.1企業應當對質粒逐批進行檢驗。一般包括以下項目：理化（外觀、pH）、質粒濃度或含量、鑒別（限制性內切酶分析、序列鑒定）、純度與雜質（A260/A280、超螺旋比例、宿主菌DNA殘留、宿主菌RNA殘留、宿主蛋白殘留、抗生素殘留（如適用）等）、無菌及細菌內毒素等。

5.7.2應根據質粒在最終的免疫細胞治療產品生產中的功能及安全性等相關因素，經風險評估建立合理的質粒質量標準；可參照《中國藥典》的相關要求，進行檢測方法的驗證或確認。

5.7.3應對質粒的穩定性進行長期監測，選擇合理、敏感的考察項目（如外觀、pH、濃度/含量、純度（A260/A280）、超螺旋比例等），并根據相關數據制定或調整質粒的貯存條件和有效期。

5.8包裝與貯存

5.8.1企業應有詳細的規程規定質粒產品的包裝、貼簽和貯存（如適用）等操作過程，所有操作過程應有詳細、完整的記錄。

5.8.2質粒產品包裝容器和包裝形式應當基于風險評估的結果確定，其安全性和密封性均應經過適當的評估或驗證，避免產品遭受污染。

5.8.3企業應配備專用的設備用于質粒成品的貯存，并按照《藥品生產質量管理規范》的要求劃分區域，按品種、批號分區存放。每個最小包裝上應有標簽標識其名稱、批號、數量／體積、生產日期、有效期／復驗期、貯存條件等必要信息。應當按照有效期或復驗期貯存。貯存期內，如發現對質量有不良影響的特殊情況，應當進行復驗。對于貯存過程中發生的超溫、包裝破損等異常情況，應按偏差程序進行處理和評估。

5.8.4貯存區應當有足夠的空間，待驗品和合格品可進行分區或用狀態標識進行管理，放行前應按待驗貯存，不合格和退回（如適用）品應專區存放并有明顯的標識。

5.8.5貯存設備應進行溫度監控，可配備相應的溫度監控系統。應建立出入庫記錄，記錄應真實、完整、準確、可追溯。

5.9運輸

質粒產品的運輸和轉運的方式應有明確的操作規程進行規定，運輸的方式應進行驗證和確認（如適用），整個運輸過程應有完整的記錄。