辣椒CaWRKY39基因克隆及其酵母單雜交pGADT7載體構建

關鍵詞：辣椒；CaWRKY39；生物信息學分析；酵母單雜交pGADT7載體構建

辣椒（Capsicum annuum L．）是茄科辣椒屬植物，是我國重要的經濟作物之一。根據FAO數據，2021年我國辣椒種植面積達82.7萬公頃，約占全球辣椒種植面積的40%，年產值超過3500億元。但番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus，TSWV）的入侵嚴重影響了辣椒的產量和品質。TSWV是布尼亞病毒目（Bunyavirales）番茄斑萎病毒科（Tospoviridae）正番茄斑萎病毒屬（Orthotospo-vzrus）的一種，是世界十大農業病害之一，每年造成的經濟損失超過10億美元。TSWV侵染辣椒后會使其株形矮化、株幅變小、果實嚴重畸形、單果重降低、結果數量及單果種子數減少。在我國，TSWV已快速從最初發現的四川和云南擴散至遼寧、甘肅、山東等14個省份，可侵染多種蔬菜作物，已成為我國辣椒和番茄等主產區導致絕產的主要病毒，造成了巨大的經濟損失。因此，如何有效防控該病毒是保護辣椒產業健康穩定發展的重要問題。

已有研究表明，WRKY轉錄因子在作物抗病性中發揮重要作用。如：水稻WRKY13、WRKY42、WRKY45-2形成轉錄調控級聯，其中WRKY42可能通過抑制茉莉酸（JA）信號相關基因負向調控水稻對稻瘟病菌的應答，而WRKY45-2轉錄激活WRKY13，WRKY13的編碼蛋白則反過來轉錄抑制WRKY42，從而調控水稻對稻瘟病菌的抗性：過表達蘋果MdWRKY100后，其抗炭疽病菌能力增強，而RNAi基因沉默植株對炭疽病菌更敏感，表明MdWRKY100在蘋果響應炭疽病中發揮正調控作用：CmWRKY15-J對菊花白銹病原菌掘氏菊柄銹菌具有類似正調控功能；桃PpWRKY45可以通過結合激活抗性基因PpCHI、PpGLU、PpPR-like等啟動子中的W-box元件并激活其表達，增強對匍枝根霉菌的耐受性：OsWRKY114能直接結合幾丁質酶的啟動子激活其表達，從而降低水稻對水稻白葉枯病菌的敏感性。近年來，WRKY轉錄因子在辣椒中的研究也取得了一定的進展。報道顯示，CaWRKY6、CaWRKY15、CaWRKY30等轉錄因子可能參與煙草花葉病毒、辣椒青枯病菌、辣椒疫霉菌和根結線蟲等多種病原體侵染后的植物防御機制。以上研究表明，WRKY轉錄因子可以廣泛參與植物的各種生物和非生物脅迫過程，并且功能具有多樣性，但目前關于WRKY轉錄因子是否參與抗TSWV過程以及如何發揮作用尚無報道。

本課題組前期通過TSWV病毒侵染及轉錄組學分析發現，侵染后的辣椒葉片中特異性高表達，推測其可能在抗TSWV中發揮重要作用，但具體功能和作用機制尚不清楚。本研究從辣椒葉片中克隆基因，利用生物信息學方法對CaWRKY39蛋白的理化性質、結構和功能進行綜合分析，并構建的酵母單雜交pGADT7表達載體，以期為進一步解析CaWRKY39抗TSWV的分子機理提供技術支撐和參考。

1材料與方法

1.1材料

本試驗所用辣椒品種是‘蕭新19’，種子購于安徽蕭新種業有限公司。

載體、菌株及試劑：酵母單雜交表達載體pGADT7（Amp抗性）為云南省作物生產與智慧農業重點實驗室自有；限制性內切酶購于紐英倫生物技術（北京）有限公司（NEB）；質粒提取試劑盒購于艾科瑞生物工程（湖南）有限公司（AG）；TRNzol Universal總RNA提取試劑購于天根生化科技（北京）有限公司（ TIANGEN）；膠回收試劑盒、PCR產物回收試劑盒、DL2000 DNAMarker、DL10000 DNA Marker、In-Fusion Snap As-sembly cloning kits購于寶生物工程（大連）有限公司（TaKaRa）；pEASY-Blunt Zero Cloning Kit購于全式金生物技術股份（北京）有限公司（Trans-Gen）;Hiscript Ⅱ1st Strand cDNA Synthesis Kit、2x Phanta Flash Master Mix購于諾唯贊生物科技（南京）有限公司（Vazyme）；CaWRKY39基因克隆引物和載體構建引物合成及陽性菌落測序均由生工生物工程（上海）股份有限公司（Sangon）完成。

1.2方法

1.2.1植物材料的培育與處理

于2023年3月將辣椒種子播于穴盤中，待出苗后移栽到裝有土壤和腐殖質混合物的塑料盆（10cm×10cm×10cm）中，置于光照培養箱，在（25+2）℃、相對濕度恒定為（65±5）%、光照周期為光照16h：黑暗8h條件下培養，每2d澆水一次，保證植株正常生長；待植株生長至四葉期，采集葉片，立即在液氮中冷凍后保存在-80℃冰箱中。

1.2.2CaWRKY39基因克隆

利用TRNzol Uni-versal總RNA提取試劑于2023年6月提取辣椒葉片的總RNA，經反轉錄試劑盒合成cDNA，并以該cDNA為模板進行PCR擴增。根據前期轉錄組分析得到的CaWRKY39編碼序列利用PrimerPremier 6.0軟件設計基因克隆引物（表1）。PCR反應體系：終延伸1min，4℃保存。利用膠回收試劑盒回收純化CaWRKY39全長CDS序列片段，將純化產物連接至克隆載體pEASY-Blunt Zero Cloning Vector上，轉化至大腸桿菌感受態細胞Transl-T1，鑒定的含有CaWRKY39片段的陽性菌落送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.2.3CaWRKY39蛋白的生物信息學分析基于測序獲得CaWRKY39基因的堿基序列，利用DNAMAN6.0推導CaWRKY39蛋白序列，利用ExPASy-ProtParam（https：//web. expasy. org/prot-param/）分析CaWRKY39蛋白的理化性質，通過SOPMA軟件（https：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma. html）預測分析其二級結構．通過SWISS-MODEL軟件預測其三級結構。利用在線預測工具NetPhos 3.1（https：//services.healthtech.dtu.dk/services/NetPhos-3.11）、TMHMM Server 2.0（https：//services.healthtech.dtu.dk/services/TMHMM-2.01）、SignalP-4.1（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.1/），Cell-PLoc2.0（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/）等在線工具分析CaWRKY39蛋白的磷酸化位點、跨膜結構、信號肽以及蛋白的亞細胞定位。利用NCBI數據庫搜索并下載其他物種的WRKY39蛋白序列，用MEGA11軟件構建系統進化樹（Neighbor-join-ing法，Bootstrap重復數為1000，線程數量為3）。

1.2.4 CaWRKY39基因表達載體構建和酶切鑒定

通過SnapGene軟件設計帶酶切位點NdeI、EcoRI插入片段的同源重組引物（表1），以pEASY-CaWRKY39質粒DNA為模板。PCR反應體系：質粒DNA1.0uL，上、下游引物各1.5uL，2xPhanta Flash Master Mix 25.0uL， ddH20 21.0uL，共50.0uL。PCR反應程序：98℃預變性30s;98℃變性10s，54℃退火5s，72℃延伸5s，34個循環；72℃終延伸1min，4℃保存。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測并利用DNA膠回收試劑盒（TaKaRa，寶日醫生物技術（北京）有限公司）回收目的基因片段。用限制性內切酶NdeI、EcoRI酶切載體pGADT7質粒5h后進行瓊脂糖凝膠電泳并將酶切產物回收，按照無縫克隆試劑盒（TaKaRa，寶日醫生物技術（北京）有限公司）說明書將酶切純化后的pGADT7載體與回收的帶同源臂CaWRKY39片段進行連接，連接產物轉化大腸桿菌感受態細胞DH5a，利用含氨芐抗性的LB平板培養基過夜篩選，經PCR鑒定陽性的菌落送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。構建的表達載體命名為pGADT7-CaWRKY39。挑選測序正確的菌落采用質粒提取試劑盒提取pGADT7-CaWRKY39質粒DNA，以該質粒DNA為模板進行PCR鑒定后，瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2結果與分析

2.1CaWRKY39基因克隆

基于轉錄組數據得到的CaWRKY39基因CDS序列，利用DNAMAN6.0對其蛋白序列進行推測分析，結果（圖1）顯示，CaWRKY39的CDS序列全長為1035bp，共編碼344個氨基酸，含有一個由WRKYGQK7個氨基酸組成的保守WRKY結構域，說明CaWRKY39蛋白屬于WRKY成員。本實驗以辣椒‘蕭新19’葉片的cDNA為模板進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳檢測顯示擴增產物與預期大小一致（圖2），通過回收目的片段、轉化大腸桿菌、單克隆PCR擴增和測序鑒定，結果表明成功克隆到CaWRKY39基因全長CDS序列。

2.2CaWRKY39蛋白基本理化性質分析

ExPASy-ProtParam在線分析結果顯示，CaWRKY39蛋白的分子式為C1642 H2653 Nsis 0518 S21，總原子數為5349個，分子量為38570.53Da．等電點為9.59，帶正電荷殘基為30個，帶負電荷殘基為49個，總平均親水性為-0.805，不穩定系數為59.71，脂肪族指數為63.17。表明CaWRKY39蛋白屬于不穩定的堿性親水蛋白。

2.3CaWRKY39蛋白二級結構、三級結構分析

SOPMA分析結果顯示，CaWRKY39蛋白的二級結構中無規則卷曲占60.76%，a-螺旋占25.58%，延伸鏈占9.59%，轉角占4.07%（圖3A）。進一步通過SWISS-MODEL網站預測CaWRKY39蛋白的三維結構，同樣發現該蛋白無規則卷曲占比最大，同時還存在a-螺旋、延伸鏈和轉角等結構（圖3B）。表明CaWRKY39蛋白主要由無規則卷曲組成，其次為儀-螺旋，延伸鏈、轉角占比較小，這可能與CaWRKY39蛋白的功能相關。

2.4CaWRKY39蛋白磷酸化位點、信號肽、跨膜結構域、亞細胞定位分析

磷酸化對蛋白質功能的正常發揮起著重要的調節作用。經NetPhos 3.1分析發現，CaWRKY39蛋白由38個氨基酸磷酸化位點構成，包含30個絲氨酸（Serine）、5個蘇氨酸（Threonine）和3個酪氨酸（Tyrosine）磷酸化位點（圖4A）。根據CaWRKY39蛋白相應的磷酸化潛能，推測其可能被絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸激酶磷酸化激活，從而調控基因的表達。

亞細胞定位分析結果顯示CaWRKY39蛋白定位于細胞核（圖4B），說明其為典型的核轉錄因子。但進一步分析發現其既沒有跨膜區域，也不存在信號肽，說明CaWRKY39蛋白不是定位于生物膜上的膜蛋白，無跨膜運輸，不屬于分泌蛋白。

2.5CaWRKY39蛋白系統進化分析

根據CaWRKY39蛋白的序列信息，在TAIR數據庫下載AtWRKY39蛋白序列，在NCBI數據庫搜索并下載其他11個物種的WRKY39蛋白序列，利用MEGA11軟件，采用鄰接法構建系統進化樹。結果（圖5）發現，辣椒CaWRKY39與棉花GhWRKY39的親緣關系最近，與小麥TaWRKY39的親緣關系較遠，預示著CaWRKY39蛋白與Gh-WRKY39具有相似功能。

2.6表達載體的構建及驗證

為進一步驗證CaWRKY39對相關抗性基因的靶向調控作用，進行pGADT7-CaWRKY39酵母單雜交表達載體構建。以pEASY-Ca WRKY39質粒DNA為模板，用CaWRKY39-Nde I-F、CaWRKY39-EcoR I-R引物進行CaWRKY39基因帶同源臂片段擴增，對擴增產物和NdeI、EcoRI雙酶切后的線性pGADT7載體進行純化回收，隨后利用無縫克隆試劑盒將目的基因片段導人線性pGADT7載體中，將連接產物轉入大腸桿菌感受態細胞，挑取單菌落進行PCR檢測和測序鑒定。結果表明，目的片段大小為1312bp（圖6），與預期相符，表明pGADT7-CaWRKY39酵母單雜交表達載體構建成功，可以用于后續實驗。

3討論

目前關于辣椒WRKY類轉錄因子的基因克隆及相關功能研究報道較為少見。本研究成功克隆了辣椒CaWRKY39全長CDS序列，全長1035bp，共編碼344個氨基酸；CaWRKY39蛋白總平均親水性為-0.805，不穩定系數為59.71，等電點為9.59．屬于不穩定的親水性堿性蛋白，這與已報道的CaWRKY30蛋白的預測結果類似。CaWRKY39蛋白結構中無規則卷曲占比60.76%，說明其結構不穩定。蛋白磷酸化會降低該蛋白的穩定性，CaWRKY39蛋白的磷酸化位點有38個，再次驗證了該蛋白的不穩定性。

轉錄因子在細胞核內才能發揮調控功能。本研究結果顯示CaWRKY39蛋白定位于細胞核，表明其可以發揮轉錄因子的調控功能。但該蛋白無跨膜區域和信號肽，是非分泌蛋白，形成后會在細胞內發揮作用并根據植物體需求調整數量和狀態。WRKY轉錄因子最顯著的功能是參與植物抗病調節過程。棉花GhWRKY39在本氏煙中過表達后，PR抗性基因的表達顯著上調，青枯菌的侵染病癥明顯減弱，表明GhWRKY39具有抗青枯病的作用。從系統進化樹可知，CaWRKY39與GhWRKY39親緣關系最近，并且CaWRKY39在TSWV侵染下表達量顯著提高，推測CaWRKY39具有抗TSWV功能。

本研究利用無縫克隆技術成功構建了酵母單雜交表達載體pGADT7-CaWRKY39，下一步將結合酵母單雜交誘餌載體構建和相關互作實驗，進一步驗證CaWRKY39對CaPR1等抗性基因的靶向調控作用，以闡明CaWRKY39轉錄因子參與辣椒抗TSWV病毒的分子機理，進而為抗TSWV病毒植物培育和綠色防控提供參考。

4結論

本研究對CaWRKY39全長CDS及其編碼蛋白的理化性質、結構和系統進化等進行了生物信息學分析，并采用RT-PCR技術克隆得到CaWRKY39基因全長CDS序列，進一步通過無縫克隆的方法成功構建了其酵母單雜交pGADT7表達載體，可為全面深入研究CaWRKY39轉錄因子參與辣椒抗TSWV病毒分子機理提供技術支持，并為抗TSWV病毒植物培育和綠色長效防控提供理論依據。