基于轉錄組測序分析家蠶中腸、脂肪體和血淋巴組織可變剪接事件

關鍵詞：家蠶；RNA-seq；可變剪接；功能基因；物質合成

家蠶（Bombyxmori）屬鱗翅目家蠶蛾屬Bom-byx泌絲昆蟲，蠶絲是主要的紡織原料。家蠶經歷長期馴養和不斷人工選育，品種多樣、形態各異、遺傳變異豐富，具備易于在室內飼養和繁殖、世代間隔短、子代群體大、遺傳背景清楚、便于實驗操作、經濟價值高、基礎研究積累豐富等優點，是優良的模式動物，2002年，被國際無脊椎動物協會正式確定為鱗翅目模式昆蟲。在我國蠶業科學家的努力下，家蠶成為繼果蠅（Drosophi-la）和按蚊（Anopheles）后第三個完成基因組計劃的模式昆蟲，從2003年到2022年，依次完成了家蠶全基因組DNA序列測定以及基因組構架圖、精細圖、高精度單堿基遺傳變異圖譜和家蠶超級泛基因組圖譜的構建。大量基因組信息的獲得促進了蠶業科學“后基因組時代”的到來，深入解讀家蠶遺傳信息、挖掘家蠶重要功能基因成為現階段蠶業科學的主要研究任務之一。

可變剪接（alternative splicing，AS）是基因轉錄后的前體mRNA通過不同的剪接方式切除內含子、連接外顯子從而產生多個基因轉錄本異構體的過程，是高等真核生物調節基因表達、增加基因復雜性、豐富蛋白質數量和功能的重要因素。高通量轉錄組測序技術是現代生命科學開展功能基因篩選、轉錄本結構分析、基因表達模式探索等的強大工具，已在家蠶的抗病性、品種特性形成、馴化和發育等方面研究中得到廣泛應用。隨著轉錄組測序（RNA sequencing，RNA-seq）技術和AS識別方法的發展，在全基因組水平識別AS位點和AS事件變得更加高通量和經濟。基于RNA-seq數據收集和生物信息學的研究也顯示家蠶基因組中普遍存在AS事件，AS基因在不同組織和不同發育時期選擇的轉錄本和表達水平不同，使AS事件具有時空特異性。家蠶的性別決定與分化、病毒抵御、信號轉導、結構組成等生物學過程的功能基因分析已證實均存在AS事件。AS事件和AS基因的挖掘和分析可以為特定條件下產生特異蛋白的基因生物學功能研究提供重要參考，是進行基因轉錄后調控和蛋白質功能多樣性研究的重要方向。

雖然家蠶各組織RNA-seq研究數據大量涌現，但基于RNA-seq結果的AS研究并不多，AS研究仍集中于單基因。本研究通過RNA-seq技術獲得了東肥和彩4兩個品種家蠶預蛹期中腸、脂肪體和血淋巴組織的轉錄組數據，采用AS識別軟件rMATS、統計學和生物信息學方法對3個組織的AS事件和AS基因的數量、分布、重疊和功能信息進行了分析，為家蠶3個與物質消化和吸收、合成和代謝、貯存和運輸相關的關鍵組織的基因組AS事件分析提供系統性數據，同時篩選出2個家蠶品種間同一組織內的差異AS事件，并對差異AS基因進行功能注釋，以挖掘2個品種差異性狀相關AS基因，為家蠶特定性狀形成機制的探索提供候選基因。

1材料與方法

1.1試驗材料

2019年6-7月同時飼養東肥（DF，4眠，白色繭）和彩4（C4，4眠，肉粉色繭）兩個品種的家蠶全齡幼蟲。飼養條件：溫度23～27℃，濕度60%～70%，自然光照。

1.2家蠶組織樣品采集

在家蠶5齡預蛹期（排空腸道糞便，上蔟前），解剖蠶體并分別采集其中腸、脂肪體和血淋巴組織，-80℃凍存。每種組織3個重復，每個重復的樣品由5頭蠶同一組織混合而成。

1.3總RNA提取與質量檢測

根據TRIzol⑩Reagent（15596026， Invitrogen）的說明提取家蠶各組織樣品的總RNA，采用Agi-lent RNA 6000 Nano kit（5067-1511， Agilent）在Agilent 2100 Bioanalyzer（Agilent，美國）上檢測其純度、完整性和總量。

1.4cDNA文庫構建與轉錄組測序

將質量合格的總RNA委托北京諾禾致源科技股份有限公司進行cDNA文庫構建與轉錄組測序。文庫構建完成后，經初步定量、定量稀釋、in-sert size檢測和有效濃度準確定量，以控制文庫質量。庫檢合格后，把不同文庫按照有效濃度及目標下機數據量的需求pooling后進行IlluminaHiSeq測序，測序的基本原理是邊合成邊測序（se-quencing by synthesis）。測得的圖像數據經CA-SAVA堿基識別轉化為序列數據（reads），對原始reads進行過濾，去除帶接頭的、含無法確定堿基信息和低質量（Qphred≤20的堿基數占整個read長度的50%以上）的reads．獲得質控過濾后數據（clean reads），采用HISAT2（http：//ccb.jhu. edu/software/hisat2/faq. shtml）軟件將clean reads在參考基因組上進行精確定位（mapping），參考基因組為Bmori_2016 v1.0（2020年，GenBank assemblyaccession： GCA_014905235.2）。

1.5AS事件鑒定與分析

使用rMATS（4.0.2）軟件對mapping的RNA-seq數據進行AS事件分析，對每個樣品存在的可變剪接類型及相應表達量進行檢測，可識別A3SS、A5SS、MXE、RI和SE 5種AS事件，通過計算P值和錯誤發生率（1 discovery rate，FDR）進行差異顯著性分析，本研究采用FDRlt;0.05為閾值篩選2個家蠶品種同一組織的差異表達AS事件。在Mirosoft Excel中對初步獲取的AS事件和AS基因的組織分布情況進行統計和繪制表格。利用Novomagic（https：//magic. novo-gene.com/）軟件分析AS基因在不同組織發生同類AS事件和在同一組織發生多種類型AS事件的分布和重疊數據并繪制韋恩圖。

1.6AS基因的GO與KEGG分析

對家蠶3個組織AS基因和2個品種間3個組織差異AS基因采用Novomagic軟件進行GO和KEGG的注釋和富集分析，以Plt;0.05為顯著性閾值，AS基因富集結果選取Plt;0.05且無信息重疊的條目和通路，差異AS基因富集結果選取Plt;0.05或基因集合數量大的條目和通路，富集圖采用GraphPad Prism 5.01軟件繪制。

2結果與分析

2.1家蠶RNA-seq數據質量及與參考基因組比對

RNA-seq原始數據經過質控后，組織樣品均產生不低于6 GB的過濾reads，GC含量在46.83%～51.28%，Q20gt;97.30%，Q30gt;92.82%，數據質量合格。3個組織表達基因總數為17646個，除彩4血淋巴3個樣品的clean reads與參考基因組的比對率低于70%外，其余15個樣品比對率為87.980～94.12%。彩4血淋巴采集3次樣品送測，比對率均低于70%，排除采樣污染的原因，可能是彩4血淋巴組織基因的實際表達情況與參考基因組信息存在較大差異，選取比對率最高的一組進行測序和分析。

各樣品clean reads在參考基因組內基因外顯子、內含子區域和基因間區域的分布情況如圖1所示。脂肪體的外顯子比對率為96.45%～97.97%，高于中腸（89.59%～95.72%）和血淋巴（84.02%～94.67%）；中腸的內含子比對率為2.52%～7.45%，高于血淋巴（1.33%～4.05%）和脂肪體（0.74%～1.63%），中腸內含子事件發生率高可能源于前體mRNA或AS的滯留：血淋巴的基因間區域的比對率為3.81%～13.02%，明顯高于中腸（1.76%～4.04%）和脂肪體（1.29%～1.92%），尤其是彩4血淋巴的3個樣品均不低于9.79%，可能源于非編碼RNA（non coding RNAs，ncRNA）的存在或參考基因組注釋不完善。

2.2家蠶3個組織的AS事件和AS基因特征信息統計

利用rMATS軟件識別5種類型的AS事件，即A3SS、A5SS．MXE、RI和SE。由表1可見，家蠶中腸、脂肪體和血淋巴組織中分別檢測到13525、7419、6965個AS事件，對應分布到4118、3109和2975個AS基因上。AS基因數量低于AS事件數量，表明平均每個AS基因發生1個以上的AS事件。SE的發生比例最高，在3個組織中均不低于64.95%，RI發生比例最低，均不高于1.79%。AS事件數量在脂肪體中排序為SEgt;A3SSgt;MXEgt;A5SSgt;RI，在血淋巴中為SEgt;A3SSgt;A5SSgt; MXEgt;RI，在中腸中為SEgt;MXEgt;A3SSgt;A5SSgt;RI。可見，家蠶同一發育時期的不同組織間AS事件發生的數量和類型差異明顯。3個組織相同類型AS事件的AS基因數量總和大于合計的AS基因數量，例如A3SS事件在中腸、脂肪體和血淋巴發生的AS基因數量分別為825、693、729，總和2247，高于A3SS事件3個組織的AS基因合計值936，這源于1個基因在2個組織甚至3個組織發生同類型AS事件。同理，單個組織發生5種類型AS事件的AS基因數量總和也大于該組織發生AS事件的AS基因合計值，這源于同一組織1個基因發生了1種以上的AS事件。

AS基因發生AS事件情況如表2所示，每個組織中發生1個AS事件的基因數量占比為47.92～88.30%，發生AS事件數量≤3個的基因數量占比為81.11%～100.00%。單個基因在每個組織發生RI事件的數量≤4個，發生A3SS事件和A5SS事件的數量≤21個，發生MXE事件和SE事件的數量高于21個。

測序結果顯示，單個基因發生1種AS事件數量最多的均發生在中腸，分別為LOC101746904發生66個SE事件、LOC101735614發生64個MXE事件、LOC101737083（zinc finger protein 2homolog）發生63個MXE事件、LOC101746878和LOC101737083發生59個SE事件。

在3個組織中發生同一類型AS事件的AS基因數量韋恩圖如圖2所示，A3SS事件在1個組織獨有、在2個或3個組織共有的AS基因數量和比例分別為203（21.69%）、155（16.56%）和578（61.75%），A5SS事件依次為134（21.82070）、125（20.36%）和355（57.82%）．MXE事件依次為787（70.96%）、176（15.87%）和146（13.17%），RI事件依次為37（26.24%）、29（20.57%）和75（53.19%），SE事件依次為2070（43.99%）、1185（25.18%）和1451（30.83%）．由此可見，發生A3SS、A5SS、RI事件的AS基因在預蛹期家蠶的中腸、脂肪體和血淋巴有高達53.19%～61.75%和16.56%～20.57%的3組織重疊和2組織重疊比例，而發生SE、MXE事件的AS基因組織特異性高，在單一組織的比例為43.99%和70.96%。

同一組織內發生1、2、3、4、5個類型AS事件的AS基因數量及占比如圖3所示，在中腸中依次為2611（63.40%）、1180（28.65%）、271（6.58%）、54（1.31%）和2（0.05%），在脂肪體中依次為2175（69.96%）、734（23.61%）、178（5.73%）、21（0.68%）和1（0.03%），在血淋巴依次為2061（69.28%）、723（24.30%）、163（5.48%）、26（0.88%）和2（0.07%），由此可見，在家蠶中腸、脂肪體和血淋巴組織的全部AS基因總數量中，發生1個單獨類型AS事件的基因占比為最高，為63.40%～69.96%，發生2個類型AS事件的基因約占23.61%～28.65%，同時發生3、4、5個類型AS事件的基因合計占比均低于7.00%。證明AS基因在同一組織內同時發生2種以上類型AS事件的現象少，普遍發生單一類型的AS事件。

2.3家蠶3個組織AS基因的功能富集分析

3個組織AS基因GO富集分析結果如圖4所示，基因功能主要富集到生物過程、細胞組分和分子功能3個方面。保留Plt;0.05的前15個和富集基因數量最多的前15個基因功能集合，在生物過程方面富集到基因數量較多的過程可歸納為5類，①磷代謝和磷酸化類：磷代謝過程、含磷化合物代謝過程、磷酸化和蛋白質磷酸化；②分子修飾類：大分子修飾、細胞蛋白和蛋白質修飾過程；③信號轉導類：細胞對刺激的反應、信號、信號轉導、細胞通訊；④大分子的生物合成類：大分子、細胞大分子、雜環、有機循環化合物、芳香族化合物和含堿基化合物生物合成：⑤遺傳物質的代謝和表達調控類：基因表達、RNA代謝過程和RNA生物合成過程。在細胞組分方面，有膜細胞器、細胞內有膜細胞器、細胞核、細胞質、含蛋白質復合物富集到的基因數量明顯多于其他組分。在分子功能方面，腺苷酸、腺苷酸核苷酸和三磷酸腺苷（adenosinetriphosphate，ATP）綁定、鋅離子綁定、轉移酶和磷酸轉移酶活性、激酶和蛋白激酶活性富集到的基因數量明顯高于其他分子功能集合。

KEGG富集到的通路可主要歸納為5類（圖5）：①物質合成和代謝相關通路：輔助因子的生物合成、碳代謝、甘油磷脂代謝、嘌呤代謝、磷酸肌醇代謝、氨基酸的生物合成、氨基酸降解、脂肪酸降解、RNA降解、丙酸代謝、淀粉和蔗糖代謝、半乳糖代謝、果糖和甘露糖代謝、煙酸和煙酰胺代謝、泛酸和輔酶A生物合成；②物質轉運相關通路：內吞作用、ABC轉運系統；③信號轉導：mTOR、MAPK、Wnt、Fox0和磷脂酰肌醇信號通路、Hippo信號通路一果蠅、ECM-受體互作；④RNA和蛋白質調控相關通路：內質網中的蛋白質加工、泛素介導的蛋白質水解、RNA轉運、mRNA監控通路、剪接體、基礎轉錄因子：⑤細胞組成和其他生物過程：溶酶體、自噬一動物、過氧化物酶體、氧化磷酸化、凋亡一果蠅、范科尼貧血通路、晝夜節律一果蠅。

2.4兩個家蠶品種間3個組織差異AS事件統計

以FDRlt;0.05為標準進行差異AS事件篩選，結果（表3）表明，2個品種家蠶同一組織中差異AS事件數量排序為中腸（302）gt;血淋巴（244）gt;脂肪體（176），在中腸中差異表達AS事件數量排序為MXEgt;SEgt;A5SSgt;A3SSgt;RI，在脂肪體和血淋巴中差異表達AS事件數量排序為SEgt;MXEgt;A3SSgt;A5SSgt;RI。中腸組織的差異MXE、SE事件數量遠高于脂肪體和血淋巴，血淋巴的差異A3SS事件數量明顯高于中腸和脂肪體。

2.5兩個家蠶品種間差異AS基因的功能富集分析

兩個家蠶品種間3個組織內差異AS基因的GO富集結果如圖6所示。生物過程方面富集到的主要過程有：蛋白質修飾過程，大分子修飾，碳水化合物代謝過程，含核堿基的化合物、芳香族化合物、雜環、有機環狀化合物、大分子的生物合成過程，含磷化合物和磷代謝過程，磷酸化和蛋白質磷酸化，跨膜運輸，蛋白質水解，基因表達，細胞對刺激的反應，信號轉導，氧化一還原過程。細胞組分方面，有膜細胞器和細胞核注釋到的基因數量遠高于其他組分。分子功能方面則主要富集到轉移含磷基團的轉移酶活性、磷酸轉移酶活性醇基作為受體、激酶活性、蛋白激酶活性、ATP綁定、腺苷酸核糖核苷酸綁定、腺苷酸核苷酸結合、鋅離子綁定、DNA綁定、肽酶活性等過程。雖然品種間富集到的條目在3個組織均有分布，但不同組織間注釋到的基因數量差別明顯。

兩個品種在不同組織間差異AS基因的KEGG富集結果如圖7所示，共注釋到16個通路，其中胞吞作用、溶酶體、Hippo信號通路一果蠅、輔因子的生物合成、過氧化物酶體、嘌呤代謝、果糖和甘露糖代謝7個通路在3個組織中均有分布。中腸富集差異AS基因數量最多的3個通路為胞吞作用、溶酶體和Hippo信號通路一果蠅，脂肪體富集差異AS基因數量最多的3個通路為輔因子的生物合成、嘌呤代謝和碳代謝，血淋巴富集差異AS基因數量最多的3個通路為胞吞作用、剪接體和MAPK信號通路一果蠅。各組織間富集到的KEGG通路和其中注釋到的基因數量明顯不同。

2.6兩個家蠶品種間體內抗氧化水平形成的功能候選AS基因分析

芳香族化合物的生物合成差異是家蠶品種間抗氧化水平差異形成機制研究的重點，在本研究中，富集到含核堿基的化合物、雜環、有機環狀化合物、大分子生物合成過程差異AS基因27個，包括：死亡誘導終結因子1（LOC101735661）、成對的兩親性螺旋蛋白基因Sin3a（LOC101745746）、轉錄因子cwo（LOC101746519）、核受體基因（E75）、RNA聚合酶Ⅱ轉錄調節物13（LOC101747187）、轉錄抑制因子TFI-ID亞基6（LOC101744550）、雙功能嘌呤生物合成蛋白ATIC（LOC101741082）、熱擊因子d（HSFd）、NAD激酶（LOC101739592）、多萜長醇二磷酸寡糖蛋白環糊精糖基轉移酶亞基STT3B（LOC101742247）、a-1，3-巖藻糖基轉移酶C樣（LOC119629781）、cAMP反應元件結合蛋白（CREB）、營養細胞壁蛋白gpl（LOC10174C855）、叉頭轉錄因子Foxl2（LOC10174L018）、周期蛋白Per（Per）、RXR型激素受體（USP）、LOC101743494．ATP依賴型6-磷酸果糖激酶（LOC101745490）、鈣離子／鈣調素反應性腺苷酸環化酶（LOC101741402）、磷脂酰肌醇一聚糖生物合成x類蛋白（LOC101736799）、剪接體相關蛋白CWC27同源物（LOC101744679）、DNA結合蛋白Ets97D（LOC101742 733）、DNA介導RNA聚合酶Ⅲ亞基RPC3（LOCl01 741060）、果糖1，6-_磷酸醛縮酶（LOC778467）、LOC692932、激素受體3（Hr3）、核糖體蛋白S1（RpS1）。富集到氧化一還原過程8個差異AS基因：Cyp9a19、肌醇加氧酶（ LOC100101177）、Cyp12a2、硫醇過氧化物酶（Jafracl）、醛脫氫酶1（LOC101740694）、賴氨酸特異性脫甲基酶lid（LOC101746976）、糞卟啉原氧化酶（LOC692932）和C1 -四氫葉酸合酶（LOC101743494。以上AS基因參與家蠶體內抗氧化物質的轉化和代謝調控，是研究家蠶品種間抗氧化水平差異機制的功能候選基因。

3討論

3.1家蠶預蛹期中腸、脂肪體和血淋巴中AS事件和AS基因的特征

預蛹期家蠶中腸、脂肪體和血淋巴組織中分別檢測到13525、7419、6965個AS事件，AS基因數量依次為4118、3109和2975個，各組織AS基因數量分別占表達基因總數（17646個）的23.34%、17.62%和16.86%，證明家蠶3個組織內AS基因普遍存在。5種AS事件類型中，SE事件發生比例最高、RI事件最低，這種不同類型AS事件數量差異的結果與家蠶和人類的AS事件分布規律一致。中腸的AS事件和AS基因數量遠高于脂肪體和血淋巴，其中，SE和MXE事件數量分別為9479和1963個：中腸單個AS基因發生MXE和SE事件的平均數量明顯高于脂肪體和血淋巴的：3個組織中發生1種類型AS事件的數量gt;20個的AS基因共有32個，中腸的上述AS基因高達25個，均為MXE事件和SE事件。生物信息學分析顯示，家蠶的DSCAM基因通過選擇性剪接外顯子產生374個轉錄本，而果蠅DSCAM基因潛在的AS事件高達38016個。DSCAM基因是RNA可變剪接極大增加RNA和蛋白質多樣性的典型例子，其同源基因LOC101735614在本研究的家蠶中腸內發生64個MXE事件。可變剪接是生物體響應內、外環境的重要機制，中腸是蠶體直接與外界接觸的器官之一，同時參與機體對內、外環境的反應，而脂肪體和血淋巴只處于機體內環境中，因此，中腸AS事件和AS基因的數量、類型和特征與脂肪體和血淋巴的差異明顯，本研究中的家蠶中腸主要通過增加AS基因發生MXE和SE事件的轉錄組多樣性來應對機體內外環境變化。

3.2家蠶預蛹期中腸、脂肪體和血淋巴中AS基因的功能分析

預蛹期是家蠶幼蟲物質累積過程的終點，也是蟲體從幼蟲轉變為蛹的變態發育過程的起點，是研究家蠶物質合成代謝和功能基因組的重要節點。本研究中GO和KEGG富集結果顯示，AS基因參與最多的生物學過程和通路歸納為：糖、脂類、蛋白質、氨基酸、遺傳物質、輔助因子、大分子等各類物質的合成、代謝和轉運，與ATP綁定相關的能量代謝，細胞對刺激的反應和信號轉導，基因表達和翻譯的調控，蛋白質的加工、修飾和水解，磷酸轉移酶和激酶活性。3個組織中AS基因GO富集到的基因功能，在生物過程方面P值最低的GO條目為大分子修飾、細胞蛋白修飾過程、蛋白質修飾過程、磷代謝過程和含磷化合物代謝過程，此外，磷酸化、蛋白質磷酸化、含磷基團轉移酶活性、磷酸轉移酶活性、激酶活性和蛋白激酶活性等與磷酸化相關的生物學過程和分子功能AS基因也被富集。磷酸化是生物體對蛋白質翻譯后修飾的方式之一，通過蛋白激酶／磷酸酶調控蛋白磷酸化和去磷酸化，在細胞的信號轉導和基因表達調控中起重要作用，是機體響應環境變化的主要機制。AS基因通過KEGG富集到mTOR信號通路、MAPK信號通路、Wnt信號通路、Fox0信號通路、磷脂酰肌醇信號通路和Hippo信號通路一果蠅，這些通路都是以磷酸化修飾為核心或是以激酶級聯的磷酸化過程，通過動態的磷酸化水平調控調節細胞增殖、凋亡和代謝等生命活動。綜上所述，可變剪接在家蠶中腸、脂肪體和血淋巴細胞的磷酸化和信號轉導中起重要作用，并對蠶體的物質代謝、能量利用和應激反應等生命活動進行調控。

3.3兩個家蠶品種3個組織間差異AS基因的功能分析

全蠶體提取物有顯著的抗氧化和緩解氧化應激損傷的功能，是富含天然抗氧化活性物質的昆蟲資源。本研究根據前期檢測結果，選定東肥和彩4兩個抗氧化水平差異顯著的品種進行研究，通過對預蛹期中腸、脂肪體和血淋巴3個組織的轉錄組比較，分析探索家蠶品種間抗氧化水平差異的分子機制。家蠶的繭色與蠶體黃酮類和酚類物質組成相關，黃酮類和酚類物質是含苯環的芳香族天然化合物，蠶體含這兩類物質的種類和含量影響其抗氧化水平。本研究發現，兩個品種間的差異AS基因GO富集到氧化一還原過程和含核堿基的化合物、芳香族化合物、雜環、有機環狀化合物、大分子的生物合成過程。其中Cyp9a19和Cyp12a2屬于細胞色素P450基因家族，該家族蛋白在昆蟲對殺蟲劑和植物次生代謝物質的抗性代謝中起重要作用，Jafracl也是昆蟲對抗氧化應激和藥物的關鍵酶。研究表明，芳香族化合物的生物合成相關基因參與調控金銀花不同花期顏色變化關聯物質類胡蘿卜素的含量變化，該生物過程在本研究中與含核堿基的化合物、雜環、有機環狀化合物、大分子的生物合成過程有較多的差異AS基因重疊。上述AS基因參與家蠶體內抗氧化物質的轉化和代謝調控，通過對品種間組織特異性AS基因特征進一步探索，可為闡述家蠶特定物質含量的差異而導致不同品種間全蠶體提取物抗氧化水平變化的機制奠定基礎。

4結論

預蛹期東肥和彩4的中腸、脂肪體和血淋巴組織分別檢測和鑒定到13525、7419、6965個AS事件，4118、3109、2975個AS基因，5個AS事件類型中，SE占比最高，RI最低。中腸AS事件類型主要為SE和MXE，并且在數量上遠高于脂肪體和血淋巴。各組織AS事件和AS基因分析顯示：單個AS基因發生AS事件數量通?！?個，最常見的為1個；AS基因的組織表達特異性與AS事件類型有關，3個組織發生SE、MXE事件的AS基因組織特異性明顯高于A3SS、A5SS和RI事件：同一個組織內AS基因發生1個單獨類型AS事件的比例最高，發生3、4、5個類型共有AS事件的AS基因很少：3個組織中AS基因功能主要富集在物質的合成、代謝和轉運，能量代謝，細胞對刺激的反應和信號轉導，基因表達和翻譯的調控，蛋白質的加工、修飾和水解，磷酸轉移酶和激酶活性等方面。以上結果表明，家蠶體內與物質消化、吸收、合成和代謝相關的AS事件和AS基因數量可觀且具有組織特異性，可為研究特定物質對蠶體的影響提供功能候選基因。另外，兩個家蠶品種間差異表達AS事件數量在中腸、脂肪體和血淋巴中分別為302、176、244個，差異AS基因數量為266、137、186個。部分差異AS基因可富集到氧化一還原過程和含核堿基的化合物、芳香族化合物、雜環、有機環狀化合物、大分子等的生物合成過程，可用于進一步闡明蠶體抗氧化活性物質的組成差異及形成機制。