一氧化氮釋放殼聚糖復合水凝膠的制備及其抗菌性能評估

摘 要： 為了獲得能夠抵御細菌感染的傷口敷料，將原兒茶醛（PA）和氯化鐵配位形成PA/鐵離子螯合物（PA/Fe），并通過希夫堿反應與羧甲基殼聚糖（CMCS）交聯形成水凝膠，在水凝膠中負載一氧化氮（NO）供體分子N，N′-二仲丁基-N，N′-二亞硝基-1，4-苯二胺（BNN6），得到BNN6@CMCS-PA/Fe復合水凝膠；對BNN6@CMCS-PA/Fe的結構和性能進行表征，評估其生物安全性及體外抗菌性能。結果表明：該水凝膠具有優良的力學性能和高溶脹率（1169%），能夠黏附于多種材料表面，并具有自愈合能力和生物相容性；在405 nm光照下，水凝膠中的BNN6分解釋放NO的速率達到了7.2 μmol/（L·h），并且水凝膠在808 nm光照下表現出光熱效應，10 min平均升溫36.5 ℃；該水凝膠對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的生長表現出了顯著的抑制效果，其中通過NO對細菌的抑菌率均超過93%，通過光熱效應的抑菌率均超過99%。該研究為氣體釋放敷料應用于促進細菌感染傷口的愈合提供了理論依據。

關鍵詞： 原兒茶醛；殼聚糖；水凝膠；一氧化氮；光熱效應；抗菌

中圖分類號： TB381

文獻標志碼： A

文章編號： 1673-3851 （2024）11-0753-11

引文格式：謝冉，李彬. 一氧化氮釋放殼聚糖復合水凝膠的制備及其抗菌性能評估［J］. 浙江理工大學學報（自然科學），2024，51（6）：753-763.

Reference Format：" XIE" Ran，LI" Bin. Preparation of a nitric oxide-releasing chitosan-based composite hydrogel and assessment of its antimicrobial properties［J］. Journal of Zhejiang Sci-Tech University，2024，51（6）：753-763.

Preparation of a nitric oxide-releasing chitosan-based composite hydrogel and assessment of its antimicrobial properties

XIE Ran， LI Bin

（School of Materials Science amp; Engineering， Zhejiang Sci-Tech University， Hangzhou 310018， China）

Abstract：" To obtain a wound dressing resistant to bacterial infection， protocatechualdehyde （PA） and iron chloride were coordinated to form iron PA/ferric ion chelate （PA/Fe）. Then PA/Fe was crosslinked with carboxymethyl chitosan （CMCS） by Schiff base to form a hydrogel， which was subsequently loaded with a nitric oxide （NO） donor N，N′-di-sec-butyl-N，N′-dinitroso-1，4-phenylenediamine （BNN6） to obtain a BNN6@CMCS-PA/Fe composite hydrogel. The structure and properties of the BNN6@CMCS-PA/Fe composite hydrogel were characterized， and its biosafety and in vitro antibacterial performance were analyzed. The results showed that the hydrogel had excellent mechanical properties， a high swelling ratio （1169%）， adhesion to various materials， self-healing ability and excellent biocompatibility. Under 405 nm light irradiation， the rate of NO release from BNN6 in the hydrogel reached 7.2 μmol/（L·h）， and the hydrogel exhibited photothermal effect under 808 nm light irradiation， with an average temperature increase of 36.5 ℃ in 10 minutes. At the same time， the hydrogel showed significant inhibitory effects on the growth of Staphylococcus aureus and Escherichia coli， with antibacterial rates exceeding 93% for bacteria inhibited by NO and over 99% for bacteria inhibited by photothermal effects. To sum up， this study provides theoretical basis for the application of gas-releasing dressing in promoting the healing of bacterial infected wounds.

Key words： protocatechualdehyde; chitosan; hydrogel; nitric oxide; photothermal effect; antibacterial

0 引 言

皮膚是人體最外層的屏障，在抵抗微生物入侵、參與免疫反應、調節體溫和代謝過程中發揮著重要作用。一旦皮膚受損，外來病原體就會趁機入侵，可能導致難以愈合的慢性傷口產生。傷口敷料能夠降低創面與外界細菌的接觸率、有效清除創面的細菌，是促進傷口愈合的有效手段［1-3］。然而，目前臨床上使用的紗布、繃帶等傷口敷料吸水性較差、需要頻繁更換，而且難以完全覆蓋傷口表面、抗菌性能弱，容易造成傷口感染［4］。此外，抗生素濫用導致耐藥細菌的產生，使得傳統抗生素治療逐漸失效［5］。因此，新型傷口敷料需要同時兼顧吸水性、形狀適應性和抗菌性能。

水凝膠是一種新型傷口敷料，具有出色的吸水性和保濕性，可以為傷口愈合提供適宜的環境。動態交聯網絡水凝膠是通過可逆的化學鍵交聯而成的一類水凝膠，它可以在一定的外界刺激下改變物理狀態，具有可注射性和自愈性等特性，能夠應對復雜的傷口形狀和環境，因此近年來受到了更為廣泛的關注［6］。氨基和醛、酮之間發生的可逆希夫堿反應常用于構建具有形狀適應性和自愈合能力的動態交聯網絡水凝膠。殼聚糖是一種由自然界廣泛存在的幾丁質經過脫乙酰作用得到的天然多糖，其化學結構中含有大量氨基，常用于與醛基反應構建具有良好的生物相容性和高吸水性的可注射水凝膠［7-8］。然而，這類水凝膠的力學強度通常較低，不足以滿足傷口愈合的要求。為了增強水凝膠的結構穩定性和力學性能，可以引入第二種交聯反應構建雙動態交聯網絡水凝膠。原兒茶醛（Protocatechualdehyde， PA）是一種天然存在的酚醛，具有良好的生物安全性、抗菌和抗氧化性能。一方面，PA的醛基能夠與殼聚糖發生希夫堿反應；另一方面，PA的酚羥基還能夠與金屬離子進行配位，通過雙動態交聯網絡賦予水凝膠更強的穩定性并豐富其功能［9-10］。

水凝膠的抗菌作用可以通過在水凝膠骨架中引入抗菌基團或將抗菌成分負載到水凝膠中實現。PA與Fe3+絡合形成的PA/鐵離子螯合物（PA/Fe）具有光熱效應，能夠在近紅外光（Near infrared， NIR）光照射下產生熱量，從而殺滅抗菌［11-12］。然而，單一抗菌成分往往難以控制混合感染，因此，結合使用不同的抗菌手段可以進一步擴大抗菌譜，增強治療效果。一氧化氮（Nitric oxide， NO）作為一種人體內源性氣體分子，具有廣譜抗菌性，且不易引起細菌的耐藥性［13-14］。N，N′-二仲丁基-N，N′-二亞硝基-1，4-苯二胺（N，N′-di-sec-butyl-N，N′-dinitroso-1，4-phenylenediamine， BNN6）是一種NO供體，能夠在光照或熱刺激下釋放NO，進一步增強PA/Fe的抗菌效果。同時，NO還具有抗炎，促進細胞增殖和促進血管生成的作用，能夠促進傷口愈合［15-17］。

本文利用PA、 Fe3+與羧甲基殼聚糖（Carboxymethyl chitosan， CMCS）之間的席夫堿反應和配位反應構建雙動態交聯網絡水凝膠水凝膠CMCS-PA/Fe（CPF），并將BNN6負載至水凝膠中，得到復合水凝膠BNN6@CMCS-PA/Fe（CPFB）。對CPFB的結構和性能進行表征，并對其吸水性、生物相容性、抗菌性能進行測試。通過綜合比較細胞相容性和抑菌率的結果，優化CPFB水凝膠的組成及BNN6負載量，以期能夠通過光熱和NO釋放實現抗菌效果，為其在促進傷口愈合方面的應用提供理論支撐。

1 實驗部分

1.1 實驗材料

CMCS購自上海麥克林生化科技有限公司，PA、六水合氯化鐵（FeCl3·6H2O）、N，N′-二仲丁基-1，4苯二胺（N，N′-Di-sec-butyl-1，4-phenylenediamine， BPA）、氫氧化鈉（Sodium hydroxide， NaOH）、亞硝酸鈉（Sodium nitrite， NaNO2）、鹽酸（hydrogen chloride， HCl）、二甲基亞砜（Dimethyl sulfoxide， DMSO）、Pluronic F127和無水乙醇購自阿拉丁試劑公司，一氧化氮檢測試劑盒（Griess試劑盒）購自上海碧云天生物科技股份有限公司，噻唑藍溴化四唑（Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide， MTT）、DMEM（Dulbecco′s Modified Eagle Medium）培養基、磷酸鹽緩沖溶液（Phosphate buffer saline， PBS）和脫纖維兔血購自上海源葉生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 PA/Fe的合成

根據Li等［18］報道的方法合成PA/Fe螯合物。將PA（1.45 g）溶解在80℃的去離子水中，并與FeCl3溶液（0.1 mol/L）以3∶1的摩爾比混合，用NaOH溶液（10.0 mol/L）將溶液的pH值調至10.0，室溫攪拌3 h后得到PA/Fe螯合物。

1.2.2 CPF的制備

將CMCS配置成質量分數為12%的水溶液。將1 mL CMCS溶液分別與20、40 μL和60 μL PA/Fe溶液混勻并靜置，得到CPF20、CPF40和CPF60水凝膠。

1.2.3 BNN6的合成

向2.34 mL BPA 中加入18.00 mL無水乙醇，在氮氣保護下加入20.00 mL NaNO2水溶液（6.0 mol/L）并攪拌30 min。緩慢滴加20 mL HCl水溶液（6.0 mol/L），隨后繼續攪拌4 h后，離心收集沉淀，用體積分數50%的乙醇/水混合物和水分別洗滌3次，冷凍干燥得到固體粉末。

1.2.4 CPFB的制備

參照Sun等［19］報道的方法，利用F127包裹BNN6形成膠束，以提高BNN6在水中的分散性。將10 mg BNN6和40 mg Pluronic F127超聲溶解于1 mL無水乙醇中，旋蒸得到F127-BNN6復合物薄膜。加入2 mL去離子水并超聲分散，通過0.45 μm濾膜過濾得到F127-BNN6膠束，將200 μL膠束分散液（其中含有BNN6的質量濃度為1 mg/mL）與800 μL CPF40前驅體溶液混合形成水凝膠。

1.3 測試與表征

1.3.1 BNN6和水凝膠基本性能測試

用紫外分光光度計（TU-1901，北京普析通用儀器有限責任公司）測定BNN6的紫外可見吸收光譜；用核磁共振波譜儀（AVANCE AV400MHz，瑞士布魯克公司）測定BNN6的核磁氫譜；用拉曼光譜儀（XploRA Nano，日本HORIBA科學儀器事業部）測定BNN6的拉曼光譜；用紅外光譜儀（IRTracer 100，日本島津儀器有限公司）測試水凝膠的紅外光譜；用掃描電鏡（Sigma300，德國蔡司光學有限公司）觀察和記錄水凝膠的微觀形貌。

1.3.2 水凝膠的壓縮和拉伸性能測試

將制備好的CPF水凝膠（直徑10 mm，高8 mm）在萬能材料試驗機（Instron 5943，美國英斯特朗公司）上以5 min/mm的速率壓縮，應變范圍為0～80%，記錄應力-應變曲線。

用拉伸模具將2 mL水凝膠制備成形，然后用萬能材料試驗機以10 min/mm的速率拉伸，記錄應力-應變曲線。

1.3.3 水凝膠的溶脹測試

將冷凍干燥的水凝膠（冷凍干燥前為1 mL）浸泡在10 mL PBS溶液中，然后放在37 ℃的恒溫培養箱中12 h。結束后用濾紙吸去水凝膠表面的水。稱量樣品的質量，并將其與初始質量進行比較。溶脹率S按式（1）計算：

S/%=T-AA×100（1）

其中：A為水凝膠的初始質量，g；T為水凝膠溶脹平衡后的質量，g。

1.3.4 水凝膠的黏附性能定性測試

將制備好的水凝膠輕輕按壓黏附在手掌表面，接觸面與地面垂直，觀察水凝膠是否滑動或脫落。5 min后揭開水凝膠，觀察是否有水凝膠殘留在手掌表面。

將水凝膠輕輕按壓黏附在食指關節外部，接觸面與地面垂直。隨后在0°和90°之前反復彎曲手指，觀察水凝膠是否開裂、脫落。

用手指將水凝膠分別按壓黏附在塑料瓶蓋、橡膠塞與玻璃樣品瓶表面，抬起手使物體懸空，保持30 s后觀察物體是否掉落。

1.3.5 水凝膠的自愈合能力性能

將CPF40水凝膠切成兩半，并輕輕貼合，2 h后觀察并用手輕輕拉伸水凝膠，確認是否為一個整體。

通過流變儀（MCR52，奧地利安東帕公司）定量評估水凝膠的自愈合性能。在應變1%～1000%的范圍內測量水凝膠所能承受的最大臨界應變，通過固定角頻率（10 rad/s）進行交替掃描試驗，其中振幅應變在1%的小應變和高于最大臨界應變的大應變之間切換，每次切換的時間間隔為120 s。

1.3.6 水凝膠的血液相容性測試

將兔血以1500 r/min離心5 min得到紅細胞，用PBS洗滌3次后配置成質量分數為5%的PBS分散液。將200 μL水凝膠浸出液加入800 μL紅細胞分散液中。其中CPFB組光照10 min，在37 ℃下振蕩孵育1 h；去離子水組和PBS溶液組分別作為陽性對照和陰性對照。孵育后，將混合物以1500 r/min離心10 min，上清液用酶標儀（LM-MK3，美國賽默飛世爾科技公司）測定540 nm處的吸光度，溶血率H的計算參考式（2）：

H/%=S-PW-P×100（2）

其中：S為實驗組的吸光度值；W為陽性對照組的吸光度值；P為陰性對照組的吸光度值。

1.3.7 BNN6的穩定性測試

通過紫外分光光度計測試F127-BNN6膠束的紫外可見吸收光譜，隨后將溶液在室溫避光靜置7 d，再測定一次紫外可見吸收光譜進行對比。用405 nm LED燈照射（100 mW/cm2）靜置7 d后的F127-BNN6膠束，用Griess試劑測定NO釋放量，并與新配置的F127-BNN6膠束的NO釋放量進行對比。Griess試劑法的簡要步驟如下：將50 μL Griess 試劑I、50 μL Griess 試劑II和50 μL待測溶液混合與96孔板中，通過酶標儀測量540 nm處的吸光度，用相同方法測試NO標準溶液的標準曲線，根據標準曲線和樣品的吸光度計算得到樣品中的NO濃度。

1.3.8 水凝膠的NO釋放

采用Griess試劑法測定NO的釋放量。將制備好的1 mL水凝膠（CPF和CPFB）分別浸泡在3 mL PBS溶液中，并與Griess試劑混合均勻。其中CPFB光照組用405 nm LED燈（100 mW/cm2）照射，每光照10 min后用酶標儀測量溶液在540 nm處的吸光度值。另外，CPFB（黑暗）組全程避光，CPFB（37℃）組放置于37℃恒溫箱中避光，每10 min測量一次540 nm處的吸光度值，最后通過標準曲線計算出NO釋放速率。

1.3.9 水凝膠浸出液NO的釋放

將冷凍干燥后的水凝膠在60℃下滅菌1 h，轉移至20 mL DMEM培養基中浸泡24 h。取1 mL浸出液置于6孔板中，并與Griess試劑混合均勻，每光照10 min后用酶標儀測量540 nm處的吸光度值，通過NO標準曲線計算出NO釋放速率。

1.3.10 水凝膠的細胞毒性測試

采用浸出液的方式對水凝膠的細胞毒性進行測試。將冷凍干燥后的水凝膠在60℃下滅菌1 h，轉移至20 mL DMEM培養基中浸泡24 h。將小鼠成纖維細胞（L929細胞）接種于96孔板中，培養24 h后將DMEM培養基更換為水凝膠浸出液，其中1組用405 nm LED燈（100 mW/cm2）光照10 min。分別培養1 d和3 d后，用MTT法測試細胞相容性。MTT法的簡要步驟如下：在96孔板內將材料與細胞共培養24 h。棄去舊培養基，每個孔腔加入100 μL PBS靜置1 min后棄去，重新加入100 μL完全培養基，隨后在避光條件下每孔加入20 μL濃度為5 mg/mL的MTT水溶液，繼續轉移至二氧化碳培養箱中培養4 h。取出96孔細胞培養板，棄去所有溶液，每孔加入150 μL DMSO后避光置于搖床上以150 r/min搖晃15 min，隨后使用酶標儀檢測96孔細胞培養板在波長為490 nm和570 nm處的吸光度。每孔的細胞毒性V計算參考式（3）：

V/%=S-BC-B×100（3）

其中：B為培養基加入MTT溶液后的吸光度值；C為空白組細胞加入MTT溶液后的吸光度值；S為實驗組加入MTT溶液后的吸光度值。

1.3.11 水凝膠的光熱性能測試

在波長為808 nm、功率密度分別為0.4、0.6、0.8 W/cm2和1.0 W/cm2的近紅外激光照射下，用熱成像儀記錄10 min內去離子水、CMCS、CPF和CPFB溫度隨時間變化曲線。為了評估水凝膠的光熱穩定性，使用0.8 W/cm2近紅外激光對水凝膠CPF表面照射10 min并記錄溫度變化，停止光照后繼續記錄溫度10 min，重復此過程3次。

1.3.12 水凝膠的抗菌實驗

采用平板菌落計數法來評價水凝膠的抑菌效果。將20 μL 含菌菌落數為105個/mL的菌液加入到3 mL LB培養基溶液中，并與1 mL滅菌后的CPFB水凝膠共孵育（CMCS組和CPF組加入等當量的材料），在37℃恒溫培養箱中以200 r/min震蕩孵育6 h。其中CPFB光照組用405 nm LED燈（100 mW/cm2）照射30 min，CPFB光熱組用808 nm激光（0.8 W/cm2）照射10 min。孵育后，將菌液用PBS溶液稀釋105倍，用移液槍吸取100 μL稀釋液均勻涂布在瓊脂板上，37℃孵育12 h，記錄瓊脂板上的菌落數量。

2 結果與討論

2.1 材料的結構與性能表征

圖1為BNN6的基本性質表征BNN6的核磁氫譜圖、PA和PA/Fe的紫外可見吸收光譜和拉曼光譜圖。從圖1（a）中BNN6的核磁氫譜圖可知，氫的化學位移及峰面積的比值與Fan等［13］報道的一致，證明了BNN6的成功合成。圖1（b）為PA和PA/Fe的紫外可見吸收光譜，圖1（b）表明：相比于PA，PA/Fe在450 nm附近出現了一個新的吸收峰，說明PA和Fe3+之間形成了配位鍵。PA和PA/Fe的拉曼光譜如圖1（c）所示，從圖中可以觀察到，相比于PA，PA/Fe在470～670 cm-1和1200～1500 cm-1出現了配位鍵的特征峰［20］，進一步證明了PA/Fe螯合物的形成。

圖2為制備的雙動態鍵交聯水凝膠CPF的形成過程和紅外光譜圖。從圖2（a）可見，CMCS與PA/Fe前驅體溶液混合后即可形成水凝膠。通過比較圖2（b）中CMCS、PA/Fe和CPF水凝膠的官能團變化可以觀察到，PA的譜圖中1639 cm-1處的吸收峰歸屬于PA的醛基；CPF譜圖中1577 cm-1處的吸收峰也證明了CMCS的氨基與PA/Fe的醛基之間形成了希夫堿結構；CPFB譜圖中1377 cm-1處的吸收峰則證實了BNN6存在于水凝膠中［21］。

2.2 水凝膠的力學性能、黏附性能和自愈合性能

雙動態鍵交聯網絡能夠提高水凝膠的力學性能［22］。圖3為PA/Fe在水凝膠的含量對CPF水凝膠力學強度、溶脹性能和微觀結構的影響。由圖3（a）可知：CPF60相比于CPF40由于PA/Fe含量更高，交聯網絡更強，水凝膠在相同應變時的拉伸應力增大。CPF40在拉伸應變為122%時，拉伸應力達到最大值0.15 MPa，而CPF60在拉伸應變為79%時，拉伸應力達到最大值0.09 MPa，表明CPF60水凝膠相比于CPF40具有更大的抗壓強度，但由于交聯密度過大、柔性降低，導致其在拉伸時更容易斷裂。水凝膠的壓縮測試結果如圖3（b）所示，可以發現在0～80%的應變范圍內隨著PA/Fe含量的增加，水凝膠的壓縮應力逐漸增大，其壓縮應力從0.11 MPa增加到0.36 MPa。

圖3（c）為水凝膠在PBS（pH值7.4）中的溶脹率測試結果。從圖中可知，在PBS中浸泡12 h后，CPF20、CPF40、CPF60水凝膠的溶脹率分別達到952%、1169%、866%。由于交聯密度較低，CPF20水凝膠的網狀結構容易被破壞，溶脹率較低。隨著PA/Fe含量的增加，水凝膠的交聯網絡更加致密，溶脹率也隨之增大，因此CPF40的溶脹率更高。但是CPF60水凝膠的溶脹率相較于CPF40更低，可能是由于其交聯密度過高，阻礙了溶液的吸收。圖3（d）-（f）為不同水凝膠的SEM圖，從圖中可以觀察到水凝膠具有多孔結構，并且隨著PA/Fe含量的增加，水凝膠的孔徑減小，這與力學性能和溶脹性能測試的結果相符。考慮到CPF40具有最高的溶脹率，且力學強度始終，因此選用CPF40（以下描述為CPF）進行后續實驗。

水凝膠需要具有一定的黏附能力以附著在傷口上，因此對其黏附性能進行了定性測試，測試結果如圖4所示。從圖4（a）可知，CPF水凝膠能夠黏附在手上，并且剝離后沒有明顯的殘留。從圖4（b）可以觀察到水凝膠能夠適應不同彎曲程度的手指活動。另外，從圖4（c）可以觀察到，水凝膠還能夠黏附在不同材料（塑料、橡膠和玻璃）表面。CPF水凝膠的黏附性能可能來源于PA中的酚羥基與黏附物之間形成的氫鍵、靜電相互作用和π-π相互作用［23］。以上實驗表明CPF水凝膠具有較好的組織黏附性，有利于固定在傷口表面。

動態鍵交聯網絡賦予了水凝膠自愈合性能［24-25］，CPF水凝膠的表觀自愈合實驗和流變測試結果如圖5所示。從圖5（a）可知，CPF水凝膠切成兩半后能夠自行愈合，2 h后水凝膠表面無裂紋，可以拉伸而不斷裂。隨后對CPF水凝膠的自愈合性能進行了定量測試，從圖5（b）可以觀察到，當應變增加到504%時，G′和G″出現交集，這是水凝膠網絡崩潰的臨界點，表明水凝膠網狀結構被破壞，當應變高于504%時，G′急劇下降，因此應用1%和600%應力交替進行的連續交替應變掃描觀察水凝膠的自愈合現象。從圖5（c）可知，當施加高應變（600%）時，G′的值從879 Pa下降到412 Pa，低于G″（462 Pa），表明凝膠網絡受到破壞；當施加低應變（1%）時，G′（519 Pa）大于G″（255 Pa），表明凝膠網絡結構恢復了，在經過3次掃描后，G′和G″的大小能夠交替變化。以上結果表明CPF水凝膠具有自愈合能力。

2.3 水凝膠的NO釋放行為和穩定性

圖6為CPFB水凝膠的NO釋放速率和穩定性測試。從圖6（a）可知，在405 nm光照下，NO釋放速率為7.2 μmol/（L·h），而在模擬體溫環境（37 ℃）或近紅外光照射（808 nm，0.8 W/cm2）下，均沒有觀察到明顯的NO釋放現象，說明BNN6在室溫和體溫下是穩定的。此外，從圖6（b）可以計算得出水凝膠浸出液的NO釋放速率為4.7 μmol/（L·h），證明BNN6能夠緩慢從水凝膠中釋放出來，有利于在傷口愈合過程中提高NO的局部濃度。圖6（c）為BNN6溶液在室溫下保存的穩定性測試，可以觀察到，室溫避光放置7 d后，F127包裹BNN6膠束分散液仍為無色；在405 nm光照之后，顏色由無色變為紅色，表明BNN6仍然能夠釋放NO。隨后測定了NO的釋放速率為7.2 μmol/（L·h），與7 d前的溶液相同，表明F127-BNN6具有一定的穩定性，能夠在室溫、避光環境中保存7 d以上。這些結果表明水凝膠具備穩定釋放NO的能力，有利于精確控制NO的濃度用于促進傷口愈合。

2.4 水凝膠的光熱效應

PA/Fe具有光熱效應，能夠吸收近紅外光轉換成熱量，水凝膠的光熱性能評估結果見圖7。從圖7（a）可以觀察到，在808 nm激光照射下，CPF水凝膠的溫度持續升高，且升溫速率與光功率密度正相關。隨后，從圖7（b）中可以觀察到去離子水和CMCS的溫度在激光照射下沒有明顯變化，而CPF和CPFB水凝膠的溫度在光照10 min后分別達到了55.6 ℃和57 ℃，表明水凝膠的光熱性能來源于PA/Fe。之后進一步研究了水凝膠的光熱穩定性，從圖7（c）可以觀察到，CPF水凝膠在連續3次升降溫循環實驗中升高的溫度沒有發生明顯變化，均在36.5 ℃左右，表明水凝膠具備良好的光熱穩定性。

2.5 水凝膠的生物相容性

傷口敷料需要與皮膚相互接觸，因此CPFB水凝膠的生物相容性至關重要［26］。通過溶血和細胞相容性試驗評估了水凝膠的安全性，結果如圖8所示。從圖8（a）-（b）可以觀察到，CPF、CPFB水凝膠在黑暗和405 nm光照下溶血率均低于5%的允許閾值［27］，分別為3%、1%和4%，說明水凝膠具有良好的血液相容性。隨后又評估了水凝膠浸出液的細胞相容性，從圖8（c）可以觀察到，L929細胞在與不同方式處理的水凝膠浸出液共孵育后，細胞活性均超過95%，可見CPFB水凝膠具備良好的生物安全性。

2.6 水凝膠的NO與光熱抗菌性能

與傳統抗生素相比，NO具有廣譜抗菌能力，能夠通過硝化作用和DNA裂解破壞細菌結構，避免了細菌產生耐藥性［28］。因此，選用金黃色葡萄球菌和革蘭氏陰性大腸桿菌測試了材料的抗菌性能，結果如圖9所示。從圖9（a）—（c）中可見，CMCS、CPF和CPFB不光照時金黃色葡萄球菌的存活率分別為89%、79%和73%，大腸桿菌的存活率分別為72%、69%和64%，可見CMCS和PA/Fe都具有一定的抗菌能力。相對而言，CPFB光照和光熱處理后金黃色葡萄球菌的存活率分別為7%和1%，大腸桿菌的存活率分別為5%和1%，說明NO和光熱均具有顯著的的抗菌效果。另外，通過SEM觀察CPFB光照處理后細菌的表面形貌，從圖9（d）可以觀察到，大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的表面均出現了褶皺或破裂，說明NO破壞了細菌的膜結構。由此可見，CPFB水凝膠在抗菌和促進傷口愈合方面具有應用潛力。

3 結 論

本文通過將PA/Fe與CMCS復合，成功制備了CMCS-PA/Fe水凝膠，并在其中裝載BNN6得到CPFB水凝膠用于NO釋放；考察了CPFB的NO釋放能力、力學性能、黏附性、自愈合性能、生物安全性及體外抗菌性能，主要結論如下：

a）CPFB水凝膠具有良好的力學性能，在拉伸應變為122%時，拉伸應力達到最大值0.15 MPa；在壓縮比80%時應力達到0.22MPa。同時定性觀察到水凝膠具有一定的黏附性和自愈合能力，能夠抵抗一定的外力，有利于在傷口愈合過程中保持穩定。

b）CPFB水凝膠具有NO釋放的能力，能夠在405 nm光照下穩定釋放NO，NO釋放速率為7.2 μmol/（L·h）；同時水凝膠在808 nm（0.8 W/cm2）光照下具有較強的光熱效應，光照10 min平均升高溫度36.5 ℃。

c）CPFB水凝膠具有良好的細胞相容性，溶血率低于5%，且與L929細胞共培養24 h后細胞存活率大于95%。水凝膠主要成分CMCS和PA/Fe均具有一定的抗菌能力，并且能夠通過釋放NO和光熱效應使得金黃色葡萄球菌的存活率分別降至7%和1%，大腸桿菌的存活率分別降至5%和1%。

本文制備的CPFB水凝膠表現出優良的NO釋放能力、生物安全性及體外抗菌能力，在促進傷口愈合方面具有潛在應用價值。

參考文獻：

［1］祖瀟然， 韓愚弟， 周維， 等. 抗菌水凝膠治療感染創面的研究進展［J］. 中國修復重建外科雜志， 2024， 38（2）： 249-255.

［2］Cheng S， Pan M， Hu D R， et al. Adhesive chitosan-based hydrogel assisted with photothermal antibacterial property to prompt mice infected skin wound healing［J］. Chinese Chemical Letters， 2023， 34（12）： 108276.

［3］Yang Z M， Fan S S， Ma W， et al. Flexible adhesive GelMA/SF-based patch embedded with polydopamine N-halamine nanoparticles for repair of infected wounds［J］. Chemical Engineering Journal， 2023， 460： 141732.

［4］Ji J Y， Ren D Y， Weng Y Z. Efficiency of multifunctional antibacterial hydrogels for chronic wound healing in diabetes： A comprehensive review［J］. International Journal of Nanomedicine， 2022， 17： 3163-3176.

［5］Liu G H， Wang L， He Y， et al. Polydopamine nanosheets doped injectable hydrogel with nitric oxide release and photothermal effects for bacterial ablation and wound healing［J］. Advanced Healthcare Materials， 2021， 10（23）： 2101476.

［6］Huang W J， Cheng S， Wang X L， et al. Noncompressible hemostasis and bone regeneration induced by an absorbable bioadhesive self-healing hydrogel［J］. Advanced Functional Materials， 2021， 31（22）： 2009189.

［7］唐國柯， 朱亮， 劉彥斌， 等. 殼聚糖基可注射水凝膠在骨組織修復再生方面的研究進展［J］. 生物骨科材料與臨床研究， 2024， 21（2）： 71-76.

［8］Bai Q， Gao Q， Hu F F， et al. Chitosan and hyaluronic-based hydrogels could promote the infected wound healing［J］. International Journal of Biological Macromolecules， 2023， 232： 123271.

［9］Tan W W， Long T， Wan Y Z， et al. Dual-drug loaded polysaccharide-based self-healing hydrogels with multifunctionality for promoting diabetic wound healing［J］. Carbohydrate Polymers， 2023， 312： 120824.

［10］Shi T T， Lu H Z， Zhu J Y， et al. Naturally derived dual dynamic crosslinked multifunctional hydrogel for diabetic wound healing［J］. Composites Part B： Engineering， 2023， 257： 110687.

［11］林曉， 趙俊澤， 周舒文， 等. 光熱增強抗菌水凝膠的制備及其性能研究［J］. 廣州化工， 2023， 51（13）： 33-36.

［12］Lv Y C， Cai F Y， He Y X， et al. Multi-crosslinked hydrogels with strong wet adhesion， self-healing， antibacterial property， reactive oxygen species scavenging activity， and on-demand removability for seawater-immersed wound healing［J］. Acta Biomaterialia， 2023， 159： 95-110.

［13］Fan J， He N Y， He Q J， et al. A novel self-assembled sandwich nanomedicine for NIR-responsive release of NO［J］. Nanoscale， 2015， 7（47）： 20055-20062.

［14］尚亞廷， 李世超， 周瑩杰， 等. NO釋放性抗菌、抗氧化水凝膠的制備及性能［J］. 功能高分子學報， 2023， 36（5）： 453-460.

［15］Picheth G F， da Silva L C E， Giglio L P， et al. S-nitrosothiol-terminated Pluronic F127： Influence of microstructure on nitric oxide release［J］. Journal of Colloid and Interface Science， 2020， 576： 457-467.

［16］Yang Y， Zhou Y T， Li Y L， et al. Injectable and self-healing hydrogel containing nitric oxide donor for enhanced antibacterial activity［J］. Reactive and Functional Polymers， 2021， 166： 105003.

［17］Liang Z Y， Liu W K， Wang Z Q， et al. Near-infrared laser-controlled nitric oxide-releasing gold nanostar/hollow polydopamine Janus nanoparticles for synergistic elimination of methicillin-resistant Staphylococcus aureus and wound healing［J］. Acta Biomaterialia， 2022， 143： 428-444.

［18］Li M Y， Wang H， Hu J F， et al. Smart hydrogels with antibacterial properties built from all natural building blocks［J］. Chemistry of Materials， 2019， 31（18）： 7678-7685.

［19］Sun C Y， Li W J， Ma P， et al. Development of TPGS/F127/F68 mixed polymeric micelles： enhanced oral bioavailability and hepatoprotection of syringic acid against carbon tetrachloride-induced hepatotoxicity［J］. Food and Chemical Toxicology， 2020， 137： 111126.

［20］Xu N， Gao Y P， Li Z， et al. Immunoregulatory hydrogel decorated with Tannic acid/Ferric ion accelerates diabetic wound healing via regulating Macrophage polarization［J］. Chemical Engineering Journal， 2023， 466： 143173.

［21］Bayram C. Carboxymethyl chitosan-glycerol multi-aldehyde based self-healing hydrogel system［J］. International Journal of Biological Macromolecules， 2023， 239： 124334.

［22］Li Z L， Lin Z Q. Recent advances in polysaccharide-based hydrogels for synthesis and applications［J］. Aggregate， 2021， 2（2）： e21.

［23］Lv J L， Qi Y， Tian Y M， et al. Functionalized boron nanosheets with near-infrared-triggered photothermal and nitric oxide release activities for efficient antibacterial treatment and wound healing promotion［J］. Biomaterials Science， 2022， 10（14）： 3747-3756.

［24］Liang Y Q， Xu H R， Li Z L， et al. Bioinspired injectable self-healing hydrogel sealant with fault-tolerant and repeated thermo-responsive adhesion for sutureless post-wound-closure and wound healing［J］. Nano-Micro Letters， 2022， 14（1）： 185.

［25］Min Y J， Han R J， Li G L， et al. The pH-sensitive optical fiber integrated CMCS-PA@Fe hydrogels for photothermal therapy and real-time monitoring of infected wounds［J］. Advanced Functional Materials， 2023， 33（16）： 2212803.

［26］Liang Y P， He J H， Guo B L. Functional hydrogels as wound dressing to enhance wound healing［J］. ACS Nano， 2021， 15（8）： 12687-12722.

［27］Deliormanl A M， Rahman B， Atmaca H. In vitro cytotoxicity of magnetic-fluorescent bioactive glasses on SaOS-2， MC3T3-E1， BJ fibroblast cells， their hemolytic activity， and sorafenib release behavior［J］. Biomaterials Advances， 2024， 158： 213782.

［28］Hall J R， Rouillard K R， Suchyta D J， et al. Mode of nitric oxide delivery affects antibacterial action［J］. ACS Biomaterials Science amp; Engineering， 2019， 6（1）： 433-441.

（責任編輯：張會巍）