基于RNA測序和生物信息學分析鑒定椎旁肌退變中關鍵的鐵死亡基因

摘要：目的 探究椎旁肌退變（PMD）中的基因表達譜，并鑒定關鍵的鐵死亡基因。方法 選取正常和PMD患者各3例，分別取椎旁肌組織進行RNA測序，獲得差異表達的基因。通過蛋白-蛋白相互作用（PPI）和基因功能富集分析，與鐵死亡基因取交集，鑒定與鐵死亡相關的關鍵中樞基因。通過受試者工作特征（ROC）曲線分析鐵死亡基因對PMD疾病的診斷價值。結果 在PMD中共鑒定出292個差異表達的基因，其中125個顯著下調，167個顯著上調。生物信息學分析發現14個差異表達的基因與鐵死亡相關，其中鐵死亡基因MUC1、ATF3、CDKN1A是關鍵的中樞基因，對診斷PMD具有良好的敏感度和特異度。功能富集分析發現它們可能通過調控細胞凋亡、鐵死亡和骨骼肌組織發育、分化等介導PMD的發生與進展。結論 鐵死亡基因MUC1、ATF3、CDKN1A可作為診斷PMD的生物標志物，為解碼PMD的病理機制及開發新的藥物提供理論依據。

關鍵詞：序列分析，RNA；鐵死亡；計算生物學；椎旁肌退變

中圖分類號：R685 文獻標志碼：A DOI：10.11958/20240587

Identification of key ferroptosis genes in paraspinal muscle degeneration based on RNA sequencing and bioinformatics analysis

ZHANG Chunhong1， HUANG Hongchao1， LIU Yue1， DU Lilong1， XU Haiwei1， LI Ning1， LI Yongjin2△

1 Department of Minimally Invasive Spine Surgery， Tianjin Hospital， Tianjin 300211， China; 2 Department of Spine Surgery， the First Affiliated Hospital of University of Science and Technology of China

△Corresponding Author E-mail： yongjin816@xwh.ccmu.edu.cn

Abstract： Objective To explore the gene expression profile in paraspinal muscle degeneration （PMD） and identify key ferroptosis genes. Methods RNA sequencing was performed on paraspinal muscle tissue of 3 normal and 3 PMD patients respectively to obtain differentially expressed genes. Through protein-protein interaction （PPI） and gene functional enrichment analysis， the intersection of ferroptosis genes was identified to identify key hub genes associated with ferroptosis. The diagnostic value for PMD disease was analyzed by receiver operating characteristic （ROC） curves. Results A total of 292 differentially expressed genes were identified in PMD. Among them， 125 genes were significantly downregulated and 167 genes were significantly upregulated. Bioinformatics analysis revealed that 14 differentially expressed genes were associated with ferroptosis. Among them， ferroptosis genes MUC1， ATF3 and CDKN1A were key hub genes with good specificity and sensitivity for diagnosing PMD. Functional enrichment analysis revealed that they may mediate the occurrence and progression of PMD by regulating cell apoptosis， ferroptosis and skeletal muscle tissue development and differentiation. Conclusion Ferroptosis genes MUC1， ATF3 and CDKN1A can serve as biomarkers for diagnosing PMD， providing theoretical basis for decoding the pathological mechanism of PMD and developing new drugs.

Key words： sequence analysis， RNA; ferroptosis; computational biology; paraspinal muscles degeneration

腰痛是引起患者運動功能障礙的主要原因［1］。椎旁肌在支持脊柱的直立姿勢和動態穩定中發揮重要的作用［2］。椎旁肌退變（paraspinal muscle degeneration，PMD）可破壞脊柱穩定性，引起腰痛［3］。引起椎旁肌退變的原因很多，其中之一是基因差異表達［4］。越來越多的證據表明，基因表達失調通常與人類疾病（包括椎間盤和椎旁肌退變）的發生和發展密切相關，基因在介導細胞死亡、細胞外基質代謝以及炎癥反應中發揮著關鍵作用［4-5］。批量RNA測序（RNA-seq）是鑒定組織中差異表達基因（DEGs）并闡明其功能和機制的常用方法［5］。然而，在PMD中基因的表達譜尚未確定；基因介導PMD病理機制的研究還比較有限，缺乏針對人椎旁肌的RNA測序研究。因此，全面了解PMD中基因介導的關鍵病理改變對診斷和開發新的治療方法至關重要。本研究旨在通過對人椎旁肌組織進行RNA-seq和生物信息學分析，探究PMD中的基因表達譜并鑒定關鍵的鐵死亡相關基因（FRGs）。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2022年12月—2023年12月就診于天津醫院微創脊柱外科的腰痛患者6例，其中女4例，男2例；年齡15～67歲，中位年齡41歲。根據磁共振成像結果，應用Goutellier視覺半定量評估方法評估PMD的嚴重程度［6］。0級：肌肉中沒有任何脂肪條紋；1級：肌肉內有脂肪條紋；2級：肌內顯示多發灶性脂肪密度，脂肪浸潤小于肌肉質量；3級：脂肪浸潤大致等于肌肉質量；4級：脂肪浸潤大于肌肉質量，脂肪沉積超過50%［6］。將納入研究的患有腰椎間盤突出癥且需要脊柱外科手術治療的Goutellier分級2—4級患者作為PMD組；將患有急性腰椎間盤突出癥或脊柱骨折的年輕而無椎旁肌退變的Goutellier分級0—1級患者作為對照組。排除兼有感染、肺結核、帕金森病、腫瘤的患者。所有患者均簽署知情同意書。研究方案獲得天津醫院倫理委員會監督與批準。在L4—5節段，共收集3個相對正常和3個退變性多裂椎旁肌組織。

1.2 方法

1.2.1 RNA測序 使用無菌磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌椎旁肌組織，再用無菌剪刀清除結締組織和脂肪組織。使用TRIzol試劑提取總RNA，并評估RNA純度和完整性。制備RNA-seq文庫，在上海烈冰生物醫藥科技有限公司進行RNA-seq測序。

1.2.2 數據質控 FastQC軟件用于評估原始數據質量。BWA軟件用于將干凈的數據與參考基因組序列進行比較，以產生序列比對文件。

1.2.3 基因表達譜分析 使用每千個堿基的轉錄每百萬映射讀取的片段（FPKM）公式計算基因的相對表達水平。采用R軟件處理數據，通過錯誤發現率（FDR）校正P值。篩選閾值設置為|log2（FC）|gt;1，FDRlt;0.05。使用聚類熱圖和火山圖分析PMD中基因表達模式。

1.2.4 蛋白-蛋白相互作用（PPI）分析 使用STRING數據庫構建DEGs的PPI網絡［7］。首先將DEGs輸入STRING網站（https：//cn.string-db.org/），下載相關數據，并將數據輸入Cytoscape軟件中。使用Cytoscape軟件的CytoHubba插件的MCC算法鑒別關鍵的中樞基因。

1.2.5 基因本體論（GO）和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析 GO包括生物學過程（BP）、細胞成分（CC）和分子功能（MF）。基于KEGG數據庫分析可尋找顯著性富集的信號通路。BP和KEGG可以直接反映基因的潛在功能。

1.2.6 鐵死亡相關的DEGs鑒定 從FerrDb網站（http：//www.zhounan.org/ferrdb/）中下載FRGs［5，8］。為鑒定與PMD相關的FRGs，使用Venn圖將FRGs與RNA-seq獲得的DEGs合并，篩選重疊基因。

1.3 統計學方法 采用R軟件中的pROC軟件包進行受試者工作特征（ROC）曲線分析以預測關鍵FRGs的預后價值，并通過曲線下面積（AUC）評估基因的診斷價值。

2 結果

2.1 獲得PMD中基因表達譜 經過RNA-seq，在PMD中共鑒定出16 536個基因，見圖1。依據|log2（FC）|gt;1和FDRlt;0.05的標準，發現292個DEGs；其中125個基因顯著下調，167個基因顯著上調。

2.2 獲得PMD中鐵死亡相關的DEGs 從鐵死亡數據庫FerrDb共下載567個FRGs，與RNA-seq獲得的292個DEGs取交集，在PMD中共篩選出14個鐵死亡相關的DEGs，見圖2A、表1。如火山圖和條形圖所示，CHAC1、GPT2、SLC40A1、NR1D2、TFRC相關的DEGs顯著下調；HILPDA、NDRG1、SESN2、MUC1、STING1、ATF3、GCH1、CDKN1A、SLC2A1相關的DEGs顯著上調，見圖2B、C。其中CHAC1在PMD中下調最明顯，SLC2A1上調最明顯。

2.3 PPI獲得DEGs中關鍵的中樞基因 將292個DEGs輸入STRING數據庫，PPI分析結果顯示DEGs的前20個中樞基因（RPS4Y1、UTY、PRKY、USP9Y、EIF1AY、NLGN4Y、KDM5D、ZFY、DDX3Y、CDKN1A、CCL2、HSP90AA1、ICAM1、ATF3、SELE、MUC1、SELP、GADD45A、HSPA1B、PTX3）中有3個與鐵死亡相關，分別是MUC1、ATF3和CDKN1A，見圖3。

2.4 DEGs功能富集分析結果 對292個DEGs進行GO功能注釋和KEGG通路富集分析，共顯著富集了475條BP以及225條KEGG通路（P＜0.05）。與PMD相關的生物學過程包括細胞凋亡、鐵死亡、炎癥反應、信號轉導、細胞外基質降解、骨骼肌組織發育、分化等。其中SESN2、MUC1、CDKN1A、NDRG1與信號轉導相關；MUC1、ATF3、CDKN1A與細胞凋亡有關；NR1D2、ATF3與骨骼肌組織發育、分化有關（圖4A）。SLC40A1、TFRC與鐵死亡有關（圖4B）。

2.5 確定關鍵FRGs的診斷價值 CDKN1A的AUC值、敏感度、特異度、約登指數為1。ATF3和MUC1的AUC值大于0.85，敏感度為1；提示以上FRGs具有良好的敏感度和特異度，對PMD具有較高的診斷價值，可作為診斷PMD的生物標志物。見圖5。

3 討論

3.1 PMD的致病機制與研究現狀 腰痛是一種復雜的多因素疾病，包括PMD、椎間盤退變性疾病、脊柱側后凸等［3， 9-10］。椎旁肌在維持脊柱的運動和穩定性中發揮重要作用，背闊肌和腹部肌群，如腹外斜肌、腹內斜肌、腹橫肌、腹直肌以及腰方肌等也有一定的作用［2-3］。Panjabi［2］提出脊柱穩定性依賴于主動系統（如椎旁肌），若其病變可導致脊柱失穩，觸發腰痛。PMD與多種疾病的發病機制有關，包括椎間盤退變［3，10］、矢狀位失衡和脊柱側凸［9，11］、腰椎滑脫［12］、腰椎管狹窄［13］、肌少癥［14］等。Hey等［9］發現椎旁肌退變小鼠出現椎間盤高度降低、椎體楔入和脊柱后凸，表明椎旁肌病變可促使椎間盤退變和脊柱后凸。Huang等［10］報告慢性腰痛患者出現PMD的特征為椎旁肌橫截面積降低和脂肪浸潤增加；該課題組通過穿刺腰椎椎間盤建立大鼠慢性腰痛模型，證明慢性腰痛引起的腰椎間盤退變可誘導椎旁肌脂肪浸潤，促進PMD進展，這與腫瘤壞死因子（TNF）-α的表達有關。Li等［11］證明重度椎旁肌損傷可引起氧化應激反應增加，導致肌細胞壞死、凋亡和異常肌肉生成，肌肉功能喪失，脊柱失穩，進而加重特發性脊柱側彎進展。然而，當前的治療側重于緩解癥狀，很少關注解決腰痛的根本病因和恢復脊柱的正常生理結構和功能，導致預后不佳［15］。PMD的病理機制在很大程度上仍不清楚。因此，亟需揭示PMD的發病機制并開發新的治療靶點，以尋找抑制PMD的新方法。

3.2 PMD與基因差異表達相關 基因差異表達與人類疾病的發生和進展密切相關，對調控復雜的遺傳網絡和細胞信號級聯至關重要。研究表明，椎旁肌退變至少部分歸因于基因表達譜的改變［4］。然而，目前基因介導PMD病理過程的研究還比較少，缺乏針對人類椎旁肌組織的RNA-seq研究。在本研究中，筆者通過RNA-seq鑒定了PMD的基因表達譜，發現許多差異表達的基因及其潛在的生物學功能，為研究PMD的致病機制提供了新的見解。

3.3 FRGs參與調控PMD 細胞是生命的基本組織單位。細胞死亡，尤其是鐵死亡，是一種鐵依賴的磷脂過氧化驅動的獨特細胞死亡方式，受到多種細胞代謝的調控，已被證明與人類多種疾病有關，在不同的生命形式中均發揮重要作用［16-17］。王柯等［17］在膝關節炎模型大鼠中證實靶向調控鐵死亡可以治療骨關節炎。然而，鐵死亡在PMD中的研究仍然較少。本研究通過RNA測序和生物信息學研究發現14個FRGs在PMD中差異表達，其中5個顯著下調，9個顯著上調。生物信息學分析揭示鐵死亡基因MUC1、ATF3、CDKN1A是椎旁肌退變過程中的關鍵基因，可能參與介導信號轉導、鐵死亡、細胞凋亡以及骨骼肌組織發育、分化等。ROC曲線分析也顯示MUC1、ATF3、CDKN1A具有良好的敏感度和特異度，可作為診斷PMD的生物標志物。

3.4 MUC1、ATF3、CDKN1A是PMD中的關鍵FRGs 本研究在PMD中鑒定出關鍵的鐵死亡基因，但MUC1、ATF3、CDKN1A在PMD中的生物學功能尚未明確。轉錄因子ATF3是一種應激反應因子，本團隊前期證實靶向干預ATF3可通過抑制鐵死亡、細胞凋亡、細胞外基質代謝失衡減緩椎間盤退變［18］。Zhang等［19］報道ATF3通過調節H2B表達防止骨骼肌干細胞過早激活，進而影響肌肉再生。肌肉纖維化是椎旁肌退變的標志性病理特點［3］，全基因組關聯研究確定CDKN1A是一個與肌纖維組成相關的新位點［20］，表明CDKN1A可能參與調控肌肉纖維化。Chen等［21］在肌少癥患者中發現11個鐵死亡相關的中樞基因，包括CDKN1A，對肌少癥的診斷顯示出高度的靈敏度和特異度，這與本研究結果一致。MUC1也被證實可以有效抑制鐵死亡［22］。綜上所述，MUC1、ATF3、CDKN1A很可能通過調控鐵死亡、細胞凋亡、細胞外基質代謝等介導肌肉的再生與修復，進而在PMD中發揮重要調控作用，但是它們在PMD中的具體功能尚需實驗驗證。

3.5 研究局限性 由于本研究測序的樣本數量相對較少可能會影響結論的準確性，因此未來需要收集更多的臨床樣本來驗證結論的可推廣性和再現性，同時還需要通過分子生物學實驗驗證關鍵鐵死亡基因在PMD中是否差異表達，以及基因調控PMD發生與進展的機制。

綜上所述，本研究收集人椎旁肌組織進行RNA測序，在PMD中共鑒定出292個差異表達基因，其中14個基因與鐵死亡有關。生物信息學分析顯示，鐵死亡基因MUC1、ATF3、CDKN1A是關鍵的中樞基因，可能參與調控細胞凋亡、鐵死亡和骨骼肌組織發育、分化等。此外，ROC曲線分析顯示它們在診斷PMD方面具有良好的特異度和敏感度，可作為診斷PMD的生物標志物，從而為解碼PMD的發病機制及開發新的藥物提供理論依據。

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（2024-05-13收稿 2024-05-27修回）

（本文編輯 李鵬）