基于網絡藥理學探討寒濕阻肺證防疫藥茶方對新型冠狀病毒肺炎的作用機制

【摘要】目的 基于網絡藥理學探討寒濕阻肺證防疫藥茶方對新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）的作用機制，為臨床診療提供參考。方法 利用中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP）、PubChem數據庫篩選寒濕阻肺證防疫藥茶方的潛在活性成分[生物利用度（OB）≥30%，類藥性（DL）≥0.18]；利用Swiss數據庫預測防疫藥茶方作用靶點；利用Cytoscape軟件構建“藥物活性化合物-潛在作用靶點”網絡；String數據庫、Cytoscape軟件構建蛋白質相互作用（PPI）網絡；利用R包和ClusterProfiler數據包對共同靶點進行GO富集分析；利用Cytoscape軟件對共同靶點進行京都基因與基因組百科全書（KEGG）富集分析。結果 10個藥物活性成分“degree”值gt;30，分別為柳穿魚黃素（pectolinarigenin）、芫花素（genkwanin）、5-羥基-7，4'-二甲氧基黃酮（5-hydroxy-7，4'-dimethoxyflavanon）、香葉木素（diosmetin）、漢黃芩素（wogonin）、槲皮素（quercetin）、山柰酚（kaempferol）、黃酮醇（pachypodol）、木犀草素（luteolin）、草質素（herbacetin）。可能成為潛在治療靶點的蛋白包括激肽原1（KNG1）、表皮生長因子（EGF）R、半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶（CASP3）、髓過氧化物酶（MPO）。防疫藥茶方可能通過多個生物學過程發揮治療作用。結論 本研究運用網絡藥理學方法，對寒濕阻肺證防疫藥茶方的活性成分及作用靶點進行檢索、篩選及富集分析，推測其治療的活性成分可能為genkwanin、quercetin、diosmetin、kaempferol、wogonin、luteolin，潛在治療靶點可能為KNG1、EGFR、CASP3、MPO，通過調控花生四烯酸代謝、血小板活化、磷脂酶D等信號通路，抑制炎癥反應、調節機體免疫功能等，這可能是寒濕阻肺證防疫藥茶方治療COVID-19的重要機制。

【關鍵詞】網絡藥理學；防疫藥茶方；新型冠狀病毒肺炎

【中圖分類號】R563.1 【文獻標識碼】A 【文章編號】2096-2665.2024.23.0112.06

DOI：10.3969/j.issn.2096-2665.2024.23.034

近年來，中醫藥在新突發傳染病的防治中取得顯著的臨床效果[1]。早期臨床針對新型冠狀病毒肺炎（corona virus disease 2019， COVID-19）的治療沒有特效藥物[2-4]。診療方案中各證型對應的中醫辨證處方，在臨床中得以廣泛應用。目前尚未有臨床研究深入探討寒濕阻肺證防疫藥茶方治療COVID-19的藥理機制。有研究表明，中西醫結合治療方案在COVID-19死亡率等方面具有明顯優勢，其可改善普通型COVID-19患者的臨床癥狀[5]。中藥復方可通過多靶標、多成分對機體發揮調控作用，網絡藥理學是目前研究中藥復方發揮藥物作用機制的有效方法[6]。本研究基于網絡藥理學方法探索寒濕阻肺證防疫藥茶方治療COVID-19的有效成分及作用機制，通過數據庫搜索收集寒濕阻肺證防疫藥茶方包含的化合物及其對應靶點，構建和分析靶點網絡，明確相關靶點及子模塊，對重要靶點和子模塊進行功能富集，探索其與COVID-19的關聯因素，為中醫藥治療COVID-19挖掘更加科學的理論依據。

1 資料與方法

1.1 寒濕阻肺證防疫藥茶方的潛在活性成分 利用中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP）數據庫（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）檢索寒濕阻肺證防疫藥茶方的中藥化學成分；利用PubChem數據庫獲取上述檢索結果中化學成分的分子結構，保存為Canonical SMILES格式，篩選寒濕阻肺證防疫藥茶方的潛在活性成分，條件為生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18。參考藥物代謝動力學（ADME）評估寒濕阻肺證防疫藥茶方的中藥成分對機體的影響[7]。

1.2 預測寒濕阻肺證防疫藥茶方作用靶點 將上述的Canonical SMILES格式文件導入Swiss數據庫（http：// www.swisstargetprediction.ch/），將研究物種設定為“人類”，獲取相關化合物的作用靶點，保存為csv格式，通過整合、去重得到寒濕阻肺證防疫藥茶方的潛在作用靶點。

1.3 構建“活性化合物-潛在作用靶點”網絡 有研究報道， 新型冠狀病毒通過刺突蛋白與人腎素和血管緊張素轉化酶2（ACE2）相互作用，從而導致COVID-19的發生[8]。因此，本研究根據結腸上皮細胞單細胞測序結果，提取與ACE2共表達的基因，對原始文件的基因名進行標準化轉換，匹配與人類相關靶點。與上述寒濕阻肺證防疫藥茶方潛在作用靶點相映射，獲得寒濕阻肺證防疫藥茶方治療COVID-19的潛在靶點。將上述得到的活性化合物和潛在作用靶點導入Cytoscape軟件，構建“活性化合物-潛在作用靶點”網絡。

1.4 構建蛋白質相互作用（PPI）網絡 將上述的潛在作用靶點導入String數據庫（http：//stringdb.org/），物種設定為“人類”，對靶點進行蛋白間相互作用（PPI）分析，將所得結果導入Cytoscape軟件中的插件Cytohubba進行網絡拓撲分析，使用Cytoscape軟件進行可視化處理。

1.5 靶點的生物功能及通路富集分析 利用R包和ClusterProfiler數據包對得到的共同靶點進行GO富集分析；利用Cytoscape軟件中的ClueGO和CluePedia插件對得到的共同靶點進行京都基因與基因組百科全書（KEGG）富集分析，保留結果P≤0.05的數據，獲取GO柱狀圖及KEGG信號通路柱狀圖，使用Cytoscape軟件繪制靶點-信號通路網絡圖，挖掘靶點和信號通路在寒濕阻肺證防疫藥茶方與COVID-19間的關聯因素，探討寒濕阻肺證防疫藥茶方治療的作用機制。

2 結果

2.1 寒濕阻肺證防疫藥茶方的潛在活性成分結果 TCMSP數據庫篩選到70個寒濕阻肺證防疫藥茶方的潛在活性成分。

2.2 寒濕阻肺證防疫藥茶方作用靶點預測結果 利用Swiss 數據庫對上述70個寒濕阻肺證防疫藥茶方的活性成分的潛在靶點進行預測。其中50個化合物可測得靶點，共計539個潛在作用靶點。根據結腸上皮細胞單細胞測序結果，識別到5 556個與ACE2共表達的基因，對原始文件的基因名進行標準化轉換，匹配人類相關靶點的基因共計3 388個。繪制成分靶點（539個）與疾病靶點（3 388個）韋恩圖，得到170個重合靶點，見圖1。上述結果提示寒濕阻肺證防疫藥茶方機體可通過多成分發揮調控作用。

2.3 “活性化合物-潛在作用靶點”網絡的構建與分析 “活性化合物-潛在作用靶點”網絡，見圖2。共10個藥物活性成分“degree”值gt;30，分別為柳穿魚黃素（pectolinarigenin）、芫花素（genkwanin）、 5-羥基-7，4'-二甲氧基黃酮（5-hydroxy-7，4'-dimethoxyflavanon）、香葉木素（diosmetin）、漢黃芩素（wogonin）、槲皮素（quercetin）、山柰酚（kaempferol）、黃酮醇（pachypodol）、木犀草素（luteolin）、草質素（herbacetin）。

2.3 PPI網絡構建與分析 潛在靶點PPI網絡，見圖3。潛在靶點可視化網絡關系，見表1。 170個潛在治療靶點中，可能成為潛在治療靶點的蛋白包括激肽原1（KNG1）、表皮生長因子（EGF）R、半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶（CASP3）、髓過氧化物酶（MPO）。

2.4 GO富集分析結果 對共同靶點進行GO富集分析，選擇結果P≤0.05的數據，對前20個條目結果進行可視化分析。寒濕阻肺證防疫藥茶方主要作用靶點生物過程（BP），見圖4；寒濕阻肺證防疫藥茶方主要作用靶點細胞組成（CC），見圖5；寒濕阻肺證防疫藥茶方主要作用靶點分子功能（MF），見圖6。提示寒濕阻肺證防疫藥茶方可能通過多個生物學過程發揮治療作用。

2.6 KEGG富集結果分析 對共同靶點進行KEGG富集分析，選擇結果P≤0.05的數據，進行可視化分析，獲取寒濕阻肺證防疫藥茶方主要作用靶點KEGG富集，見圖7。上述結果提示寒濕阻肺證防疫藥茶方的活性成分靶點存在于多個通路中，且通路間可協同發揮治療作用。

3 討論

目前，臨床研究證實，在改善COVID-19患者臨床癥狀、縮短平均住院天數方面，中西醫結合治療具有顯著優勢，早期進行中醫干預可減少普通型向重型及危重型的轉化[9]。診療方案中各證型對應的中醫辨證處方在臨床中均得到廣泛應用。目前，尚無臨床研究深入探討寒濕阻肺證防疫藥茶方治療COVID-19的藥理機制。本研究選用TCMSP數據庫對寒濕阻肺證防疫藥茶方的相關活性成分進行篩選，采用Swiss數據庫對寒濕阻肺證防疫藥茶方的潛在作用進行預測，利用Cytoscape軟件對寒濕阻肺證防疫藥茶方的“藥物活性化合物-潛在作用靶點”進行網絡構建，對得到的共同靶點進行基因本GO和KEGG富集分析，構建靶點-信號通路網絡圖，進而挖掘寒濕阻肺證防疫藥茶方的活性化學成分、潛在作用靶點及信號調節通路。

通過寒濕阻肺證防疫藥茶方-活性化合物-潛在作用靶點網絡分析推測pectolinarigenin、genkwanin、5-hydroxy-7，4'-dimethoxyflavanon、 diosmetin、wogonin、quercetin、kaempferol、pachypodol、luteolin、 herbacetin這10個成分是寒濕阻肺證防疫藥茶方治療COVID-19的主要活性成分，表明黃酮類化學成分在寒濕阻肺證防疫藥茶方治療COVID-19的作用機制中具有重要意義。有研究表明，針對甲型流行性病毒誘導的急性肺損傷，漢黃芩素通過抑制補體系統的過度活化，起到一定的保護作用[10]；槲皮素通過抑制核因子（NF）-κB信號通路，減少NF-κB轉錄因子、血管細胞黏附分子1（VCAM-1）的產生，減輕機體炎癥反應，可緩解急性肺損傷[11]，同時，其主要通過拮抗鈣離子通道，阻止病毒受體復合物進入細胞，從而中斷生活周期，起到抗病毒作用[12]。木犀草素具有緩解咳嗽、咳痰的效果，同時具有抗病毒、抗菌、抗炎、抗腫瘤、抗過敏等藥理學活性[13]。山柰酚通過降低MAKP、NF-κB等通路的活性，抑制白細胞介素（IL）-10、腫瘤細胞壞死因子（TNF）-α、IL-6、IL-1β、VCAM-1等炎癥因子表達水平，起到抑制炎癥的作用[14]。同時，山柰酚可清除體內氧自由基，改善組織缺氧損傷，發揮抗氧化活性[15]。香葉木素可通過活化核因子E2相關因子2通路和抑制核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白（NLRP3）炎癥反應，減輕急性肺損傷[16]。芫花素通過調節脂多糖激活的巨噬細胞中的微小RNA（miRNA）101、MKP-1、MAPK途徑抑制促炎介質的產生，發揮抗炎作用[17]。潛在治療靶點方面，研究表明，COVID-19通過結合人ACE2感染患者[18]。

本研究結果顯示，潛在治療靶點KNG1、EGFR、CASP3、MPO均參與肺部炎癥反應。雷公藤紅素可通過KNG1信號轉導途徑減輕慢性阻塞性肺疾病的炎癥反應[19]。EGFR反式激活可誘導氣道上皮細胞產生黏液及促進炎性細胞因子分泌，且有研究表明，EGFR與哮喘大鼠氣道炎癥有關[20-21]。CASP3是細胞凋亡的標志物，過敏性氣道炎癥小鼠模型的研究中，槲皮素通過調節上皮來源的細胞因子和上皮細胞凋亡的過程，緩解慢性組織病理學改變，除肺組織中的基底膜厚度，其對炎癥也有一定抑制作用[22]。失血性休克復蘇后的大鼠，MPO活性增強，分解胞外纖維與基質，從而引起肺實質和急性肺損傷中的炎癥反應，而吸入2%氫氣可降低MPO活性并減少炎癥細胞向肺組織的浸潤，從而最大程度地減少肺部損傷程度[23]。以上均為寒濕阻肺證防疫藥茶方藥物活性成分及靶點在治療COVID-19方面的潛在作用機制，但仍有部分關聯性極高的靶點在既往的研究未被證實具有抗病毒、抗炎作用。例如，潛在治療靶點ESR1，目前普遍認為雌激素的生物效應主要通過ESR1調節，ESR1與雌激素相結合可發揮抗腫瘤作用，而暫未有抗炎、肺保護方面的研究報道[24]。

GO富集分析結果提示，寒濕阻肺證防疫藥茶方可能通過多個生物學過程發揮治療作用。寒濕阻肺證防疫藥茶方的潛在治療靶點主要分布于細胞膜、神經元軸突、溶酶體腔等部位，參與細胞內金屬離子穩態、細胞鈣離子穩態、激素反應、脂肪酸衍生物代謝活性、不飽和脂肪酸代謝、化學突觸傳遞的調節等生物過程，涉及離子通道調控、免疫調節等環節。相關研究表明，羥基可能通過改變細胞鈣離子的穩態發揮其細胞毒性作用，使肺泡巨噬細胞產生過量活性氧自由基，從而導致氧化性肺損傷[25]。炎癥通過跨細胞膜和細胞層的液體轉移等而引起疾病，急性肺損傷也已經檢測到離子通道的變化[26]。中性內肽酶在急性肺損傷的發病機理中起保護作用[27]。

KEGG富集分析結果提示，寒濕阻肺證防疫藥茶方的活性成分靶點存在于多個通路中，且通路間可協同發揮治療作用。與治療具有關聯性的通路中，最為核心的炎癥反應通路是花生四烯酸代謝通路。既往研究發現，該通路可介導炎癥因子產生，與炎癥的發生發展及消退均有密切聯系[28]。磷脂酶D廣泛分布于哺乳動物細胞中，且受多種細胞外信號的調節，其主要底物是磷脂酰膽堿，可水解為磷脂酸和膽堿。磷脂酶D催化的磷脂酰膽堿水解被認為是細胞中信號轉導的重要機制，同時有證據表明磷脂酶D與炎癥具有密切聯系，如炎癥的增加及白細胞的趨化性與磷脂酶D1、磷脂酶D2緊密相關[29]。血小板的活化也是寒濕阻肺證防疫藥茶方主要涉及的通路之一，血小板在維持凝血穩態方面起著核心作用，血小板在炎癥和免疫反應中具有關鍵作用[30-31]。調節機體免疫功能、抑制機體炎癥反應可能是寒濕阻肺證防疫藥茶方治療COVID-19的重要機制。

綜上所述，本研究運用網絡藥理學方法，對寒濕阻肺證防疫藥茶方的活性成分及作用靶點進行檢索、篩選及富集分析，推測其治療的活性成分可能為genkwanin、quercetin、diosmetin、kaempferol、wogonin、luteolin，潛在治療靶點可能為KNG1、EGFR、CASP3、MPO，通過調控花生四烯酸代謝、血小板活化、磷脂酶D等信號通路，抑制炎癥反應、調節機體免疫功能等，這可能是寒濕阻肺證防疫藥茶方治療COVID-19的重要機制。

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