利用孟德爾隨機化分析日間過度思睡人群腸道菌群特點

[摘要]"目的"探討日間過度思睡（excessive"daytime"sleepiness，EDS）人群的腸道菌群變化特點。方法"利用全基因組關聯分析（genome-wide"association"study，GWAS）數據進行兩樣本孟德爾隨機化分析，將腸道菌群作為暴露因素，EDS作為結局因素，以單核苷酸多態性（single"nucleotide"polymorphism，SNP）作為工具變量，使用多種方法篩查EDS的潛在致病腸道微生物。通過使用不同的敏感度分析，確保孟德爾隨機化分析結果的穩健性。結果"綜合多重分析結果，發現丁酸單胞菌、消化球菌、嗜膽菌、厭氧菌、瘤胃球菌和糞球菌在EDS人群中的豐度相對較高，而顫螺旋菌和脫硫弧菌的豐度相對較低。結論"EDS人群存在腸道菌群失調，通過改變飲食結構、使用益生菌等措施調整腸道菌群結構是否可改善EDS有待于今后進一步研究證實。

[關鍵詞]"日間過度思睡；腸道菌群；腦-腸軸；單核苷酸多態性；孟德爾隨機化

[中圖分類號]"R766""""""[文獻標識碼]"A""""""[DOI]"10.3969/j.issn.1673-9701.2024.31.007

Identification"of"links"between"excessive"daytime"sleepiness"and"gut"microbiota"using"Mendelian"randomization"analysis

ZHANG"Hong1，"HUA"Lin2

1.Department"of"Otolaryngology"Head"and"Neck"Surgery，"Beijing"Tsinghua"Changgung"Hospital"Affiliated"to"Tsinghua"University，"School"of"Clinical"Medicine，"Tsinghua"University，nbsp;Beijing"102218，"China;"2.School"of"Biomedical"Engineering，"Capital"Medical"University，"Beijing"100069，"China

[Abstract]"Objective"To"investigate"the"changes"of"gut"microbiota"in"excessive"daytime"sleepiness"（EDS）."Methods"Two-sample"Mendelian"randomization"（MR）"analysis"was"performed"using"genome-wide"association"study"（GWAS）"data，"with"gut"microbiota"as"an"exposure"factor，"EDS"as"an"outcome"factor，"and"single"nucleotide"polymorphism"（SNP）"as"an"instrumental"variable，"and"a"variety"of"methods"were"used"to"screen"potential"pathogenic"gut"microbes"for"EDS."The"robustness"of"the"results"of"MR"analysis"was"ensured"by"using"different"sensitivity"analyses."Results"Based"on"the"results"of"the"multiple"analyses，"abundances"of"Butyricimonas，"Peptococcus，"Bilophila，"Anaerofilum，"Ruminococcus"gnavus"and"Coprococcus"were"higher"in"EDS"population，"while"abundances"of"Oscillospira"and"Desulfovibrio"were"relatively"lower."Conclusion"There"was"an"imbalance"of"gut"microbiota"in"EDS"people，"and"whether"adjusting"gut"microbiota"structure"by"changing"diet"structure"and"using"probiotics"can"improve"EDS"remains"to"be"confirmed"by"further"studies"in"the"future.

[Key"words]"Excessive"daytime"sleepiness;"Gut"microbiota;"Brain-gut"axis;"Single"nucleotide"polymorphism;"Mendelian"randomization

日間過度思睡（excessive"daytime"sleepiness，EDS）是指在白天主要清醒時段不能保持清醒和警覺，出現難以克制的困倦欲睡或非預期地進入瞌睡和睡眠狀態[1]。研究證實EDS是心血管疾病和神經退行性疾病的風險因素[2]。約50%的阻塞性睡眠呼吸暫停（obstructive"sleep"apnea，OSA）患者主訴有明顯的EDS，但在經過充足睡眠和針對OSA治療后，仍有部分患者（約6%）存在持續的EDS，其原因尚不清楚[2-4]。腸道菌群是指生活在人類和其他動物消化道中復雜的微生物群落。有學者將定植于人體的數量龐大的微生物群視為后天獲得的一個重要“器官”，不僅對人類健康發揮不可替代的作用，也與多種系統疾病有著密切聯系[5-7]。腸道菌群與多種睡眠疾病、晝夜節律的關系已得到證實，然而腸道菌群與EDS的關系尚未見相關報道[8-10]。本研究探討EDS人群腸道菌群的特點，以期為臨床提供新思路，現將結果報道如下。

1""資料與方法

1.1""研究對象

腸道微生物菌群的匯總統計數據來自一項大規模的多種族的全基因組關聯分析（genome-wide"association"study，GWAS），該研究分析了包含來自25個隊列、11個國家的18"340個個體數據，其中大多數為歐洲裔（n=13"266）[11]。通過靶向16S核糖體RNA基因的3個不同可變區域（V4、V3-V4和V1-V2）來描述微生物組成。微生物數量性狀的定位分析用于識別宿主遺傳變異，宿主遺傳變異通常被映射到與腸道微生物菌群豐度相關的遺傳位點。從屬水平到門水平，該研究共包括211個細菌分群，含有131個屬水平，35個科水平，20個目水平，16個綱水平和9個門水平。在校正性別、年齡等協變量和遺傳主成分后，Spearman相關分析用于識別校正協變量后的細菌分群豐度相關的遺傳位點。本研究在屬水平上分析131種菌群，排除12種未知菌群，最終有119種屬水平的菌群進入孟德爾隨機化分析。

1.2""工具變量的選取

孟德爾隨機化分析以單核苷酸多態性（single"nucleotide"polymorphism，SNP）作為工具變量，腸道菌群的全基因組數據以Plt;5×10-8作為篩選標準，對SNP之間進行連鎖不平衡分析，從而保證SNP之間相互獨立（在10Mb范圍內連鎖不平衡r2lt;0.001）。通過計算F值排除弱工具變量，Flt;10的SNP被認為是弱工具變量而被排除[12]。

1.3""孟德爾隨機化分析

應用孟德爾隨機化分析EDS相關的細菌，采用逆方差加權法、加權中位數法、MR-Egger法、簡單模式法和加權模式法。逆方差加權法是孟德爾隨機化的常用方法，通過結合每個SNP因果效應的Wald比值估計因果效應[13]。在不存在水平多效性的情況下，逆方差加權法是較理想且偏倚較小的方法。加權中位數法是將所有的SNP按照Wald比值從大到小排序，然后取等于50％的比值進行回歸。MR-Egger法考慮截距項的存在，可在水平多效性存在情況下提供沒有偏倚的結果，并計算水平多效性。所有方法獲得的相關系數，以Plt;0.05表示存在相關性。

1.4""敏感度分析

敏感度分析包括異質性檢驗和水平多效性檢驗。由于工具變量的來源數據庫為Meta分析后的整合數據庫，不是來源于同一GWAS研究隊列，需進行異質性分析。采用Cochrane’s"Q法進行異質性檢驗，Plt;0.05表示存在異質性[14]。采用Egger回歸法對工具變量進行水平多效性檢驗。若Pgt;0.05，表明工具變量不存在水平多效性，從而在孟德爾隨機化分析中不考慮多效性對研究結果造成的影響。

2""結果

2.1""與EDS相關的菌群

以119種屬水平的腸道菌群作為暴露變量，EDS為結局變量（研究編號ukb-b-5776和ukb-a-15均為歐洲人群）進行孟德爾隨機化分析。得到8種與EDS顯著相關的細菌（Plt;0.05），見表1。圖1為ukb-b-5776研究中糞球菌的線性回歸圖和森林圖。

2.2""敏感度分析

分別對識別的8種細菌進行敏感度分析，包括異質性檢驗和水平多效性檢驗。異質性檢驗顯示Pgt;0.05，說明研究不存在異質性。水平多效性檢驗顯示Pgt;0.05，表明工具變量不存在水平多效性，在孟德爾隨機化分析中可不考慮多效性對研究結果造成的影響。留一法檢驗結果顯示去除任意一個SNP均不會對結果產生較大影響，表明本研究的孟德爾隨機化分析結果穩健，見表2。

3""討論

本研究通過使用GWAS數據，對來自11個國家的18"340個個體數據進行孟德爾隨機化分析，經過多重分析，結果顯示在EDS人群中丁酸單胞菌、消化球菌、嗜膽菌、厭氧菌、瘤胃球菌和糞球菌豐度升高，而顫螺旋菌和脫硫弧菌豐度降低，提示EDS人群的腸道菌群結構存在變化。

人類腸道微生物群含有3.8′1013個細菌，以革蘭陽性厚壁菌門和放線菌門、革蘭陰性擬桿菌門和變形菌門為主，其中革蘭陽性厚壁菌門和革蘭陰性擬桿菌門占90%以上。這些種類復雜的腸道細菌在腸道內組成一個龐大而復雜的微生態系統，直接或間接參與宿主的消化、營養吸收、能量供應、脂肪代謝、免疫調節、腫瘤發生發展、疾病的發生與轉歸等諸多方面。包括環境、藥物攝入、生活方式、壓力等在內的多種因素均可破壞腸道微生物群的平衡并影響其多樣性和功能[15]。

丁酸單胞菌主要產生短鏈脂肪酸，具有免疫抑制作用[16]。丁酸單胞菌被認為是對癌癥治療有害的細菌，與癌癥治療的不良反應有關"[17]。另有研究發現丁酸單胞菌與過敏性哮喘之間存在因果關系，可能參與機體的免疫反應[18]。瘤胃球菌屬于革蘭陽性菌，是最早發現的胃部細菌之一，在新陳代謝中發揮重要作用，包括有益菌和有害菌。部分瘤胃球菌屬被證實具有促炎作用。以肉食為基礎的飲食會增加有害菌，減少有益菌的豐度[19]。糞球菌屬于革蘭陽性菌，是腸道重要的有益菌，起到分解食物、促進養分吸收的作用。如果腸道內部環境發生改變，身體抵抗力下降，糞球菌可損傷腸道黏膜，也會成為致病菌。對顫螺旋菌在腸道中的生態作用或生理特性知之甚少，其在炎癥性疾病中的豐度下降[20]。本研究中EDS人群具有丁酸單胞菌、瘤胃球菌和糞球菌豐度增加而顫螺旋菌豐度下降的特點，提示腸道內環境改變。

腸道菌群與EDS的作用途徑主要通過腦-腸軸實現。腸道菌群與胃腸道和大腦之間存在著一條復雜的雙向通信路徑，稱為腦-腸軸。神經、內分泌和免疫信號影響腸道和大腦之間的交流，腸道菌群參與這些信號通路的調節，被認為是腦-腸軸的組成部分[21]。Gareau等[22]首次證實腸道感染可導致應激性記憶缺陷，并伴有海馬中的腦源性神經營養因子表達降低，即使在細菌清除和腸道病理消除后，記憶障礙仍然存在。Li等[23]研究表明飲食引起的腸道細菌變化與認知功能變化有著時間上的關聯，表明微生物和大腦之間有著密切的聯系。

孟德爾隨機化分析是一種用于檢查暴露和復雜結果之間是否存在因果關系的常用方法[24]。臨床研究中受實驗條件及醫學倫理等因素的限制，無法在大樣本人群中多次獲取樣本，利用孟德爾隨機化分析及大樣本數據庫研究有一定的優點。首先，孟德爾隨機化分析不易受到反向因果關系和混雜因素的影響；其次，將大量的GWAS樣本數據、兩組獨立的工具變量和不同的方法應用與因果關聯評估，避免混雜因素的影響，可進行較準確的因果評估。本研究使用最新GWAS數據庫對腸道微生物群與EDS進行孟德爾隨機化分析，大大降低混雜因素的影響。

受數據來源的影響，本研究有一定的局限性，如受試者主要為歐洲裔，與國人的飲食習慣、飲食結構、自然環境和人種等存在差異，對結果的影響有待闡明；數據庫中是否有重復病例尚未可知。但本研究發現EDS人群的腸道菌群存在一定結構和豐度的變化，可為今后深入研究腸道菌群與EDS關聯及EDS改善方法提供一定的研究思路和研究基礎。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

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（收稿日期：2024–07–10）

（修回日期：2024–10–09）