雞傳染性法氏囊病毒新型變異株致病性研究

摘 要：雞傳染性法氏囊病是一種由雞傳染性法氏囊病毒引起的急性、高傳播性和致死率的烈性傳染病，雞感染該病毒后會引起法氏囊器官嚴重萎縮，導致機體產生免疫抑制。近年來IBDV新型變異株在我國開始流行，目前尚無商品化疫苗預防該病，未來可能成為養禽業健康發展的新威脅。因此，需要進一步研究其流行病學情況和在臨床疾病可能發揮著潛在的作用。本研究針對新型變異株GD2021-08進行致病模型建立，為生產防控提供參考和指導。

關鍵詞：雞傳染性法氏囊病毒；新型變異株；致病模型

中圖分類號：S858.31 文獻標識碼：A 文章編號：1673-1085（2024）11-0021-07

傳染性法氏囊病（Infectious bursal disease，IBD），是由傳染性法氏囊病病毒（Infectious bursal disease virus，IBDV）引起的一種急性、高傳播性且具有免疫抑制性的傳染病，會增加誘發其他禽類疾病繼發的可能性或其他疫苗接種失敗的風險[1]。IBDV通常易感染3～6 周雛雞，該病一年四季都可以發生，在4～7月份多發，發病率極高，達80%～100%。發病過程持續一周且極為迅速，通常在感染3 d后即可引起法氏囊萎縮，開始出現死亡，感染4～6 d達到高峰，死亡率為5%～15%，感染并發癥后死亡率會更高，因此該病還被稱為雞中的“艾滋病”[2]。IBDV主要嚴重損害雛雞中樞免疫器官——法氏囊，使B淋巴細胞前體壞死或溶解，從而影響雞的發育以及抗體的產生。臨床癥狀主要有精神萎靡、羽毛蓬松雜亂、少食、間歇腹瀉等。解剖病雞可以發現法氏囊黏膜有出血、嚴重時法氏囊發黃甚至呈紫葡萄狀[3]。

1957年，IBD首次發生于美國Delaware州甘保羅鎮。根據發病地區，該病被命名為Gumboro disease，即甘保羅病[4]。1979年首次在我國廣州出現，周蛟等人在北京發現并于1982年分離出該病毒，隨后陸續在全國流行[5-6]。后來，疫苗的研發使這類經典IBDV得到有效控制，感染IBDV的雞死亡率不高。

最近幾年來，隨著A、B節段不斷的重組重配，中國東部報道IBDV新型變異株出現。在2019年，中國從6個省份中首次檢測到新型變異株IBDV。這引起了人們對新型變異株的廣泛關注，國內陸續有人分離并對IBDV新型變異株進行各方面研究[7]。新型變異株也迅速傳播到了其他亞洲國家，2021年在日本、韓國、馬來西亞等國陸續發現IBDV新型變異株[8-9]。IBDV新型變異株可能成為家禽業新的威脅，防控形勢仍不容樂觀。

本研究前期從臨床中分離到一株IBDV新型變異株GD2021-08，為了解該毒株臨床致病情況。本文通過該毒株在SPF雞上的感染情況以及發病特征進行研究，為生產防控提供參考和指導。

1" 材料方法

1.1" 材料

1.1.1" 病毒" 毒株：本試驗用到的IBDV新型變異株代表株GD2021-08，由溫氏研究院分離純化鑒定。

1.1.2" "SPF雞胚、試驗動物" 無特定病原體（Specific pathogen free，SPF）雞、SPF雞胚均購于廣東溫氏大華農生物科技有限公司。雞胚在37 ℃培養箱中孵育，SPF雞在試驗場負壓隔離器中飼養。

1.1.3" 主要試劑" 病毒基因組提取試劑盒（RaPure Viral RNA/DNA Kits），購自Magen生物公司；PrimeScript? One Step RT-PCR Kit， Ver.2 （Dye Plus）一步法反轉錄試劑盒，購自TaKaRa公司；膠回收試劑盒（E.Z.N.A. ? Gel Extraction Kit）、質粒DNA抽提試劑盒（E.Z.N.A.? Plasmid DNA Mini Kit I），Omega公司產品； In-Fusion? HD Cloning Plus，購自TaKaRa公司；胎牛血清（FBS），購自Bovogen公司；DMEM購自Hyclone公司。

1.1.4" 主要儀器設備" PCR儀、電泳儀，美國伯樂生命醫學產品有限公司；凝膠掃描成像系統，美國Syngene公司；超純水系統，美國Millipore公司；磁力攪拌器，美國IKA公司；漩渦振蕩器，杭州儀表電機廠；超聲細胞破碎儀，南京新辰生物科技有限公司；普通水平離心機，艾本德中國有限公司；冷凍離心機，艾本德中國有限公司；超速冷凍離心機，美國Beckman公司；-80 ℃超低溫冰箱，賽默飛世爾科技（中國）有限公司；CO2培養箱，賽默飛世爾科技（中國）有限公司；-4 ℃超低溫冰箱，中國中科美菱低溫科技有限責任公司；天平，多利斯（上海）貿易有限公司。

1.2" 方法

1.2.1" IBDV新型變異株代表株GD2021-08的分離鑒定" 本研究以IBDV變異株GD2021-08為IBDV新型變異株代表株，將其在SPF雞上盲傳3代分離純化GD2021-08，得到IBDV新型變異株GD2021-08胚毒。對IBDV VP2基因進行檢測，通過PCR檢測外源病毒混合感染情況。

1.2.2" IBDV新型變異株代表株GD2021-08的TCID50測定" IBDV變異株GD2021-08的TCID50通過免疫間接熒光試驗（IFA）來檢測，將2.3.4中的-80 ℃凍融的已過濾研磨上清液用10%FBS的DMEM（F12）培養基依次倍比稀釋10倍接種到CEF細胞上，共稀釋11個梯度，每個梯度設復孔加培養液8孔/100 μL，37 ℃條件下CO2培養箱孵育36 h后測定病毒效價。

1.2.3" IBDV新型變異株GD 2021-08的最小攻毒劑量的確定" 將GD2021-08連續做10倍倍比稀釋，分別按照2×104、2×103、200、20 TCID50/0.2 mL的劑量以點眼滴鼻的方式接種28日齡SPF雞，設3組劑量，每組10只雞，設空白對照組10只雞，每只雞接種PBS/0.2 mL，見表1。攻毒后第7天（7 dpi），解剖所有雞，剖檢并稱量體重。

1.2.4" 致病性試驗方案及其分組" 為了研究IBDV新型變異株GD2021-08對SPF雞的致病性，將45只16日齡的SPF雞隨機分為3組，感染組（21只）、空白對照組（4只）、觀察組（10只）。感染組、觀察組SPF雞在16日齡以點眼滴鼻的方式感染200 TCID50/0.2 mL，IBDV新型變異株GD2021-08，空白對照組在相同日齡注射同等劑量的PBS溶液。攻毒后1～7 d，每天觀察雞臨床癥狀、存活情況并稱重，隨機剖檢感染組3只和空白對照組2只雞，采集法氏囊和脾臟，觀察法氏囊、脾臟病變情況，依據（1-1）式、（1-2）式計算囊重比和脾重比；根據（1-3）式計算囊重指數（Bursa：body-weight index， BBIX）。分別在攻毒后第1、3、5、7 天剖檢的法氏囊用4%甲醛固定，送武漢塞維爾生物科技有限公司進行組織病理切片分析。觀察組感染后觀察臨床癥狀，統計存活率、發病率，在攻毒后第25 天，對存活雞進行稱重，觀察體重變化。

囊重比＝（法氏囊重量/體重）× 1000" "（1-1）式

脾重比＝（脾臟重量/體重）× 1000" "（1-2）式

BBIX＝攻毒組雞囊重比/空白對照組雞平均囊重比 （1-3）式

當BBIXlt; 0.7時，判定法氏囊萎縮。

2" 結果

2.1" 存活率、發病率及體重變化

通過連續25 d對觀察組的存活率統計，發現沒有雞死亡，也沒有明顯臨床癥狀出現，存活率100%，見圖1。但通過稱重發現感染7、25 d時觀察組的體重較空白對照組體重有所減輕，見圖2。

2.2" 感染后剖檢結果

為了進一步評估IBDV新型變異株GD2021-08導致的病理損傷，攻毒后1～7 d進一步對感染組、空白對照組進行剖檢，剖檢結果如圖3所示。感染后3 d法氏囊較空白對照組有明顯萎縮、發黃，脾臟則無顯著變化，說明IBDV新型變異株GD2021-08能導致法氏囊病理損傷。

稱重統計后通過脾重比（圖4）、囊重比（圖5）和BBIX指數（圖6）發現，感染組在攻毒后的第3天時囊重比快速下降，在攻毒后的第3～7天囊體比與空白對照組相比有極顯著差異（Plt; 0.001），脾重比在感染初期的第2、4 天腫大，在2、4、6 dpi時與空白對照組相比有極明顯差異（Plt; 0.001），BBIX指數圖中明顯可看出囊指數在感染后1～7 d逐漸下降，3 d后低于0.7。該結果與解剖結果一致，證明IBDV GD2021-08株對雞有明顯致病性。

2.3" 法氏囊病理切片結果

法氏囊組織切片結果如圖7。發現感染IBDV新型變異株GD2021-08組攻毒后的第3 天法氏囊開始出現明顯病理損傷，皮髓質淋巴細胞壞死、溶解、大量減少，上皮細胞大量增生（紅色箭頭所指），結締組織增生（黃色箭頭所指），有炎性細胞浸潤（綠色箭頭所指），在感染后的第7 天時伴有囊腫形成（藍色箭頭所指）。在空白對照組的雞中未觀察到明顯的病理損傷。

3" 討論

IBD是一種可引起免疫抑制的急性傳染病，可造成疫苗接種失敗。免疫失敗的原因可能與抗原變異、重組錯配有關。變異株主要流行于北美洲，帶來巨大經濟損失[10]。但在2015年有研究發現我國東部多省從免疫雞群檢出多株變異株，經檢測證實是不同于美國早期變異株的新型變異株。該毒株對雞不致死，可引起法氏囊嚴重萎縮，導致強烈免疫抑制，引起廣泛關注，未來可能成為養禽業新的威脅[11]。目前中國IBDV新型變異株的流行情況報道很少，因此，進行IBDV新型變異株流行病學調查是十分必要的。通過遺傳進化分析闡明流行病學特征，評估流行傳播與遺傳進化趨勢，為IBDV的有效防控和疫苗研發提供數據支持。

IBDV有兩種血清型，即血清Ⅰ型和血清Ⅱ型。血清I型有獨特的嗜法氏囊性，在雞的法氏囊中復制并引起免疫抑制，血清II型雖然可以感染火雞的不同組織，但對雞是非致病性的[12]。這兩種血清型可以通過病毒中和試驗（VN）和聚合酶鏈式反應（PCR）來鑒別，但使用間接免疫熒光（IFA）和ELISA測定方法無法區分，只能檢測出兩者共有的常見抗原。血清I型根據致病性和抗原性可大致分為四種：經典毒株（Classical IBDV，cIBDV）、變異株（Variant IBDV）、vvIBDV超強毒株（Very varient IBDV）、新型變異株（Novel varient IBDV），它們會產生不同的致病結果[13]。IBDV基因組由雙節段雙鏈RNA（dsRNA）——A、B片段構成。較大片段A和較小片段B都有5'末端非編碼區（5'-noncoding region，5'-NCR）、3'末端非編碼區（3'-noncoding region，3'-NCR）和編碼區[14]。最近幾年來，隨著A、B節段不斷的重組重配，中國東部出現IBDV新型變異株。在2019年，中國從6個省份中首次檢測到新型變異株IBDV[15]。這引起了人們對新型變異株的廣泛關注，國內陸續有人分離IBDV新型變異株并對其進行各方面研究。

為了評估IBDV新型變異株的致病性。本文用IBDV新型變異株GD2021-08感染16日齡SPF雞，建立致病模型。結果表明IBDV新型變異株GD2021-08株導致雞群體重明顯減輕，剖檢發現攻毒雞群法氏囊明顯縮小且重量減輕，進一步制作組織病理切片進行觀察，發現法氏囊有明顯的病理損傷，皮髓質淋巴細胞壞死、溶解、大量減少，上皮細胞大量增生，結締組織增生，有炎性細胞浸潤，并伴有囊腫形成。法氏囊作為雞主要的中樞免疫器官，與體液免疫有關，可以影響淋巴B細胞的發育。病理結果說明該變異毒株對雞群免疫系統造成巨大損傷，嚴重影響雞群生長發育，會給生產帶來潛在的經濟損失。

4" 結論

本文對IBDV新型變異株GD2021-08致病性進行研究，結果表明該毒株引起雞群體重減輕以及明顯的法氏囊萎縮和炎性病變，雖然不直接引起雞群的死亡，但是給雞群的生長性能帶來了巨大的危害，本模型對生產防控提供臨床參考和指導。

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收稿日期：2024-08-14

基金項目：“十四五”廣東省農業科技創新十大主攻方向 “揭榜掛帥”項目（重大動物疫病新型綜合防控技術）

第一作者：李群輝（1988—），男，博士，主要從事畜禽疾病防控，E-mail：492992437@qq.com

通信作者：王連想（1975—），男，博士，高級獸醫師，主要從事畜禽疾病防控和臨床生產管控，E-mail：animsci@126.com