新型接觸性病毒牛結節性皮膚病診斷與防控措施的詳細探討

牛結節性皮膚病又被稱為牛結節疹，是由牛結節性皮膚病毒引發的以全身體表皮膚出現結節病變為主要特征的病毒性傳染性疾病。該種疾病通過牛和相關制品的運輸向著全國各地蔓延，在各個省份相繼報告了結節性皮膚病疫病。從致死率來看牛結節性皮膚病造成的整體死亡率相對較低，但是該類疾病發病周期較長，傳播速度相對較快，發病之后會導致繁殖母牛出現不孕流產，種公牛出現不育，同時還會降低奶牛的泌乳量和肉牛的生產性能，損壞牛皮，病情加重之后還很容易繼發感染細菌性疾病和其他病毒性疾病，使得疾病的診斷難度加大，養殖效率逐漸下降，給牛養殖業造成極大的經濟損失。作為飼養管理人員應該對牛結節性皮膚病的危害有所認知，要明確該類疾病的流行特點和診斷方法，提前采取措施進行有效地防控，降低發病率，確保養殖安全。本次研究就牛結節性皮膚病的診斷與防控措施進行詳細的探討與分析，希望對廣大同行有所借鑒與幫助。

一、牛結節性皮膚病的流行病學

1、牛結節性皮膚病的病原學

牛結節性皮膚病病毒屬于痘病毒科山羊豆痘病毒屬的成員，已知有Ⅰ型（廣泛分布）、Ⅱ型（非洲）、Ⅲ型（中亞）。該類病毒形態特征呈現磚形或卵形，長度230～270nm，寬度140～200nm，具有包膜和中心核心，表面有桿狀結構。病毒對干燥和高溫相對穩定，可以在痂皮和土壤中存活數月，對酸性條件敏感。氯仿等有機溶劑不滅活病毒，病毒對熱敏感，56℃加熱30min可滅活病毒，對紫外線和γ射線敏感，對某些消毒劑敏感，如次氯酸鈉和季銨化物。該類病毒宿主范圍窄，主要感染牛，通過接觸感染性物質（例如痂皮或唾液）傳播，在牛群中引起嚴重的結節性皮膚病。

2、牛結節性皮膚病的致病機理

牛結節性皮膚病病毒（LSDV）的致病機制涉及病毒與宿主細胞的相互作用和病毒復制過程中的免疫逃避。LSDV通過皮膚傷口或黏膜進入宿主，病毒與靶細胞表面的受體結合，例如痘病毒受體A33R。病毒進入細胞后，其外膜融合，釋放核心到細胞質中，核心釋放病毒DNA，并在細胞質中復制。LSDV在動物細胞當中能夠編碼多種免疫調節蛋白，可以抑制宿主的免疫反應。常見的蛋白質主要有E3L蛋白抑制宿主細胞的凋亡，為病毒復制提供有利環境。B22R蛋白抑制主要組織相容性復合物（MHC）I類分子的表達，從而逃避細胞毒性T細胞的識別，同時結節性皮膚病毒還能夠干擾牛體內干擾素的產生。LSDV復制導致靶細胞腫脹和破裂，釋放病毒顆粒和細胞碎片，細胞損傷和炎癥反應導致結節形成，結節主要發生在皮膚、淋巴結和呼吸道等部位。LSDV持續復制和釋放新的病毒顆粒，逃避宿主的免疫反應，病毒表面蛋白的抗原變異也可能有助于其逃避免疫識別。

3、牛結節性皮膚病的流行特點

牛結節性皮膚病是一種由疙瘩皮膚病病毒引起的牛的傳染病，傳染源是感染牛以及病牛的結節液、唾液、血液和糞便。病毒主要通過吸血昆蟲（如蚊、蠅、蠓、虻、蜱等）的叮咬傳播，也可通過相互舔舐或舔舐發病牛的結痂進行傳播，食入被感染動物唾液污染的飼料和飲水也是傳播途徑之一。該種疾病目前沒有特定的易感群體，所有牛都應該被認為是潛在的易感者，尤其是幼牛和未經免疫的成年牛。從流行季節來看結節性皮膚病在溫暖濕潤的季節更為流行，特別是在雨后，昆蟲活動頻繁時，夏季和秋季是疾病的高發期。在很多養殖場中牛結節性皮膚病是由疙瘩皮膚病病毒引起的慢性、亞急性或急性傳染病，病毒可能通過感染牛的唾液進入體內，引起病毒復制和感染，再加上養殖管理不當患病牛群和健康牛群頻繁接觸，從而造成疫病擴散蔓延。

二、牛結節性皮膚病的臨床癥狀

牛結節性皮膚病潛伏期因不同病毒株和牛只的免疫狀態而異，通常為7～21d，但也有報告指出部分病例的潛伏期可長達28d。初期階段患病牛出現輕微的體溫上升，但尚無明顯的皮膚病變。隨后牛只體溫急劇上升，可達41℃以上，出現抑郁、厭食、消瘦等癥狀。眼結膜和鼻黏膜可能出現炎癥，牛只會有大量唾液分泌，在體溫升高后的48h內，皮膚開始出現病變。病情加重之后再患病，牛的病變皮膚出現直徑2～4cm的堅實、圓形結節，開始時可能局限于頭頸、四肢、乳房、生殖器和會陰部，隨后可能擴散至全身，結節可能破潰、壞死，并最終纖維化，這個過程可能持續數月，部分小結節可能自行消退。發病后期結節干癟、脫落，留下疤痕，脫落后的皮膚上可能存活有病毒，導致持續的感染狀態。病情嚴重之后，由于出現繼發性感染，如肺炎和乳腺炎，導致牛只消瘦、生產性能下降，恢復緩慢。懷孕母牛可能出現流產或長時間不發情，犢牛可出現全身性結節，且癥狀可能更為嚴重。

三、牛結節性皮膚病的病理學變化

病死牛解剖之后皮膚病變是牛結節性皮膚病的主要特征，病變初期，皮膚出現紅斑、瘙癢，隨后出現結節，結節呈圓形或橢圓形，直徑約1～2cm，表面光滑，質地堅硬。隨著病情發展，結節逐漸增大，數量增多，相鄰結節融合，形成大的結節，嚴重時，皮膚表面出現潰瘍、壞死，甚至脫落。腫大部位短淋巴結腫大、充血，隨后出現炎癥細胞浸潤，隨著病情發展淋巴結發生壞死、液化，形成膿腫，膿腫破裂后，形成瘺管，排出膿液。另外，病毒還可以侵犯內臟器官，如肺、脾、腎等，導致內臟器官充血、水腫，隨后出現炎癥細胞浸潤。隨著病毒的入侵內臟器官發生壞死、纖維化，導致功能減退或喪失。

四、牛結節性皮膚病的實驗室診斷

1、牛結節性皮膚病的病毒中和試驗

在病毒綜合實驗過程中，需要提前準備好牛結節性皮膚病病毒分離株、牛結節性皮膚病病毒陽性免疫血清、牛結節性皮膚病病毒陰性血清、細胞培養體系（Vero細胞或MDBK細胞）、細胞培養基、培養板、移液器、混勻器、孵箱。實驗操作期間首先將病毒分離株稀釋至合適的滴度，通常為100TCID50/0.1mL，然后將陽性和陰性血清分別稀釋預處理為1∶10，將病毒稀釋液與血清稀釋液等體積混合，并混勻，病毒與血清混合液在37℃下孵育1h，將孵育后的混合液接種到細胞培養板中，細胞培養板在37℃下培養5～7d。實驗結束之后觀察細胞培養板中是否存在細胞病變效應（CPE），如細胞融合、變圓、脫落等，緊接著計算病毒在細胞培養中的TCID50，即引起50%細胞病變的病毒稀釋倍數，然后計算中和滴度，即病毒稀釋液中能被血清中和90%CPE的血清稀釋倍數。中和滴度=病毒稀釋倍數×（1+血清稀釋倍數），陽性免疫血清的中和滴度較高，表明血清中含有針對病毒的中和抗體顯示為陽性。陰性血清的中和滴度較低或不存在，表明血清中不含有針對病毒的中和抗體顯示為陰性。如果中和滴度介于陽性和陰性結果之間，表示為可疑，需要進一步檢測或重復試驗以確認結果。

2、牛結節性皮膚病的酶聯免疫吸附試驗

正式實驗操作之前需要準備好牛結節性皮膚病病毒抗原、牛結節性皮膚病病毒陽性血清、牛結節性皮膚病病毒陰性血清、96孔ELISA板、阻斷液、洗滌液、二抗酶標試劑、底物溶液、終止液、酶標儀。實驗操作步驟是，將病毒抗原稀釋至1∶20濃度，加入ELISA板孔中，4℃過夜，用洗滌液洗滌ELISA板，去除未結合的抗原，加入阻斷液孵育，以阻斷非特異性結合位點，緊接著加入樣品（血清稀釋液）并孵育，使抗體與抗原結合，然后再次洗滌ELISA板，去除未結合的抗體，緊接著加入二抗酶標試劑，其與樣品中的抗體結合，再次洗滌ELISA板，去除未結合的二抗酶標，向其中加入底物溶液，使二抗酶標顯色，最終加入終止液，停止酶促反應，使用酶標儀在特定波長（通常為450nm）下讀板。計算方法是樣品/陽性對照（S/P）比值=樣品吸光度值/陽性對照吸光度值，當S/P比值≥0.5陽性結果，表明樣品中存在針對牛結節性皮膚病病毒的抗體，S/P比值lt;0.5陰性結果，S/P比值介于0.2和0.5之間疑似結果，需要進一步檢測或重復試驗以確認結果。

3、牛結節性皮膚病的熒光聚合酶鏈式反應

實驗操作過程中涉及的試劑和設備主要有牛結節性皮膚病病毒特異性引物、qPCR試劑盒、樣品DNA、陽性對照DNA、陰性對照DNA、qPCR儀。根據qPCR試劑盒說明配制反應混合物，包括引物、探針、DNA聚合酶和其他試劑。其中引物用于擴增LSD病毒基因組特定區域的DNA序列，設計應基于已知的LSD病毒基因序列，以確保特異性。引物的序列和濃度應根據實驗需求確定。探針通常標記有熒光染料如FAM、ROX等，以便在PCR儀器上進行實時監測，探針的序列應與擴增產物中的特定序列互補。DNA聚合酶是PCR反應的核心酶類，用于在PCR過程中合成新的DNA鏈，通常使用熱穩定DNA聚合酶，如Taq聚合酶。緩沖液用于提供適宜的反應環境，維持酶的活性和穩定性，根據所使用的PCR反應體系和DNA聚合酶的要求確定。dNTPs即脫氧核糖核苷酸三磷酸鹽，是PCR反應的原料，用于合成新的DNA鏈。MgCl2鎂離子是DNA聚合酶的輔助因子，對PCR反應的擴增效率有重要影響，MgCl2的濃度通常在0.5～2.0mM之間優化。將樣品DNA、陽性對照DNA和陰性對照DNA加到反應混合物中，反應混合物轉移到qPCR儀中，根據試劑盒說明進行擴增，利用qPCR儀記錄每個擴增周期的熒光信號。樣品擴增曲線呈指數增長，且擴增閾值（Ct）值低于陽性對照的Ct值表示為陽性，樣品沒有明顯的擴增曲線，或擴增曲線呈線性增長，且Ct值高于陽性對照的Ct值表示為陰性，樣品的Ct值介于陽性和陰性結果之間，或擴增曲線呈弱陽性表示可疑需要進一步檢測或重復試驗以確認結果。

五、牛結節性皮膚病的疫病處置

我國針對牛結節性皮膚病這類動物疫病的處置主要依據相關法規、規章和標準進行。同時還需要詳細執行《動物疫病報告制度》《動物防疫技術規范》《牛結節性皮膚病防治技術規范》《動物及其產品檢疫規程》《病害動物及其產品無害化處理規程》《動物防疫設施建設標準》。發現牛結節性皮膚病的疫病后，應立即向當地動物衛生監督機構報告，包括疫病發生的時間、地點、規模、癥狀、疑似病因等。當地動物衛生監督機構接到疫病報告后，應立即組織專業人員進行診斷確認，通過臨床癥狀觀察、病理組織學檢查、病毒分離鑒定來判定病情。對確診的牛結節性皮膚病疫病，應立即采取隔離和封鎖措施，將病牛及其接觸過的牛只進行隔離，限制牛只流動，防止疫病擴散，對病牛及其接觸過的牛只進行采樣檢測，采集血液、皮膚病變組織等樣本，進行病毒檢測和血清學檢測。檢測陽性的病牛，應立即進行撲殺，采用掩埋或者焚燒處理方法進行無害化處置，防止疫病擴散。對疫病發生場所及其周邊環境進行消毒，堅持每天上午下午各消毒一次，推薦使用2%的過氧化氫、2%～5%的氫氧化鈉溶液、0.1%的過氧乙酸溶液，生石灰5%～10%的漂白粉溶液，加強動物防疫設施建設，提高防疫能力。疫病處置之后，應該對所在地區的牛結節性皮膚病疫病進行持續監測和評估，掌握疫病動態，及時調整防疫措施。撲殺完成30d內禁止疫病所在縣域的牛調出，各地在檢疫監督過程中，應該加強對牛結節性皮膚病的臨床癥狀檢查和血型檢測。同時要進一步加強疫病溯源，對疫病發生前30d內引入本地區的牛和相關品種進行嚴格的溯源調查，分析疫病的主要來源，當有明確證據表明是輸入牛引發的疫病之后應該對輸出地牛群進行針對性的隔離觀察和樣品采集，開展流行病學調查，并嚴格落實疫病處置方案和衛生消毒方案。

六、牛結節性皮膚病的預防措施

1、疫病所在區和相鄰區域的緊急免疫接種

疫病所在地區和相鄰的縣域所有牛養殖場應該選擇國家批準的山羊痘疫苗進行緊急免疫接種，接種劑量為山羊接種量的5倍，并在免疫接種7～14d之后，對牛群進行抗體水平監測，保證抗體水平達標。

2、預防期間對外引種規范化

在預防期間，對外引種需要嚴格執行國家標準和引種檢疫規程，以防止疫病傳入。在引進牛只前，選擇有良好信譽、具備合法資質的引種單位或個人進行引種，對引進地進行全面了解，掌握當地的動物疫病、獸醫防疫措施等信息，與引進地的獸醫部門溝通，了解當地的檢疫規定和標準，確保引進的牛只來源可靠，遵循相關法律法規。同時，及時向當地動物衛生監督機構申報，并提供牛只的來源、數量、品種、年齡、性別等信息。引進的牛只應在指定的隔離場所進行隔離觀察，觀察期一般為45d，在隔離期間，對牛只進行健康檢查，采集血液、唾液、鼻咽拭子等樣本，進行病毒檢測、血清學檢測等，根據檢疫結果，對牛只進行相應的防疫措施。如接種疫苗、進行疫病治療等。經過隔離觀察、疫病檢測和防疫措施后，對符合要求的牛只進行審批，辦理相關手續，予以放行。

3、加強環境清理衛生消毒

在疫病防控期間，養殖場環境清理消毒至關重要，消毒期間應該詳細地評估疫病嚴重程度、受感染動物數量、潛在的傳播途徑，確定需要隔離和處理的區域，并要加強人員培訓確保他們了解疾病、消毒程序和自身安全防護。選擇使用高效的消毒劑如10%的氫氧化鈉溶液、5%～10%的漂白粉，并準備足夠的消毒劑，以滿足全場消毒的需要。確定清理時間表，確保所有受感染動物被移除，先使用高壓水槍清洗牛舍、設備、圍欄等，清理牛舍內的糞便、墊料等有機物，緊接著使用高壓水槍噴灑消毒劑，確保所有表面都被覆蓋，對于難以清潔的表面和設備，使用消毒劑進行浸泡或噴灑，在消毒后，再次使用清水清潔所有表面，確保所有區域完全干燥，以防止消毒劑殘留造成傷害。消毒期間還是要詳細地記錄所有消毒過程，明確消毒劑種類、濃度、時間，監控消毒效果，確保消毒徹底，消毒后，實施有效的生物安全措施，防止疾病再次傳入。

綜上所述，牛結節性皮膚病是近年來傳入我國的一種新型的接觸性病毒性傳染性疾病，目前已知該種病毒只能感染牛，包括了多種類的牛，發病率在30%～60%之間，死亡率在1%～10%。一旦受到疾病感染，養殖戶會面臨較為嚴重的經濟損失，所以需要飼養管理人員提高重視程度，要注重加強流行病學調查，明確該種疾病簡單有效的診斷方法，并加強生物安全防范，對于患病牛應該立即進行撲殺處理，未發病牛群應該持續進行血清檢測，并進行緊急免疫接種，保證抗體水平達標，有效切斷病原傳播渠道，確保養殖安全。

（作者單位：814000青海省果洛州動物疫病預防控制中心）