電針對紫杉醇誘導大鼠神經病理性疼痛的影響

摘要：目的 觀察電針（EA）對紫杉醇誘導神經病理性疼痛大鼠脊髓背角NKCC1、KCC2表達和小膠質細胞活化的影響及其可能機制。方法 將48只雄性SD大鼠隨機分為溶媒組（Vehicle組）、紫杉醇組（PTX組）、紫杉醇+電針組（PTX+EA組）、紫杉醇+假電針組（PTX+Sham EA組），每組12只。采用腹腔注射PTX的方法建立PTX誘導的神經病理性疼痛大鼠動物模型，建模完成后，PTX+EA組給予“足三里”、“陽陵泉”電針刺激，連續7 d。于紫杉醇注射前2 d和注射后第1、3、5、7、14、21天進行機械撤足閾值和熱縮足潛伏期痛行為學測試。利用免疫熒光染色技術和Western blot技術檢測脊髓背角組織中鈉鉀氯聯合轉運蛋白1（NKCC1）、鉀氯聯合轉運蛋白2（KCC2）和小膠質細胞標志物離子鈣結合銜接分子1（Iba1）表達的變化。結果 與Vehicle組比較，PTX組大鼠出現雙后足機械和熱痛覺過敏，脊髓背角組織中NKCC1表達升高和活化的小膠質細胞數增加。與PTX組比較，PTX+EA組大鼠在第14、21天的機械和熱痛覺過敏得到顯著改善，脊髓背角組織中NKCC1和Iba1表達量降低，4組間KCC2表達差異無統計學意義。結論 電針可有效緩解紫杉醇誘導的神經病理性疼痛，其機制可能與抑制大鼠脊髓背角組織中NKCC1表達和小膠質細胞活化有關。

關鍵詞：電針；紫杉醇；神經痛；脊髓背角；小神經膠質細胞；鈉鉀氯化物協同轉運子；神經病理性疼痛

中圖分類號：R245 文獻標志碼：A DOI：10.11958/20240609

The effect of electroacupuncture on paclitaxel-induced neuropathic pain in rats

OUYANG Jie， ZHAO Haiqian， KONG Yun， NIU Qin， CHEN Ying， SI Yongyu△

Department of Anesthesiology， the Second Affiliated Hospital of Kunming Medical University， Kunming 650504， China

△Corresponding Author E-mail： siyongyu@kmmu.edu.cn

Abstract： Objective To observe the effect of electroacupuncture （EA） on the expression of NKCC1， KCC2 and activation of microglia in spinal dorsal horn of paclitaxel （PTX）-induced neuropathic pain rats and its possible mechanism. Methods Male SD rats were randomly divided into the vehicle group （vehicle）， the PTX group， the PTX + EA group and the PTX + sham EA group， with 12 rats in each group. The rat model of PTX-induced neuropathic pain was established by intraperitoneal injection of PTX. After modeling， EA was applied to \"Zusanli\" and \"Yanglingquan\" for 7 days in the PTX + EA group. Paw withdrawal threshold and paw withdrawal latency were tested at 2 days before and 1， 3， 5， 7， 14 and 21 days after PTX injection. Immunofluorescence and Western blot assay were used to detect expression levels of sodium-potassium-chloride cotransporter 1 （NKCC1）， potassium-chloride cotransporters 2 （KCC2） and" microglia markers - ionized calcium binding adapter molecule 1 （Iba1） in spinal dorsal horn. Results Compared with the vehicle group， mechanical and thermal hyperalgesia of both hind feet were found in the PTX group， and the expression of NKCC1 and the number of activated microglia in dorsal horn tissue of spinal cord were increased. Compared with the PTX group， mechanical and thermal hyperalgesia were significantly improved in the PTX+EA group at day 14 and 21， and the expression levels of NKCC1 and Iba1 in dorsal horn tissue of spinal cord were decreased. There was no significant difference in KCC2 expression between the four groups. Conclusion Electroacupuncture can effectively relieve paclitaxol-induced neuropathic pain， which may be related to the inhibition of NKCC1 expression and microglia activation in spinal dorsal horn of rats.

Key words： electroacupuncture; paclitaxel; neuralgia; spinal cord dorsal horn; microglia; sodium-potassium-chloride symporters; neuropathic pain

紫杉醇（paclitaxel，PTX）是被廣泛應用的一線化療藥物，周圍神經病變是紫杉醇化療中常見的不良反應［1］，表現為肢端呈手套襪子狀麻木、四肢感覺喪失和肌肉疼痛等神經病理性疼痛（neuropathic pain，NP）。現有研究表明，電針（electroacupuncture，EA）可以緩解包括紫杉醇誘導的NP在內的多種類型的病理性疼痛［2-4］，但其具體機制尚不清楚。脊髓背角的小膠質細胞激活，鈉鉀氯聯合轉運蛋白1（sodium-potassium-chloride co-transporter 1，NKCC1）和鉀氯聯合轉運蛋白2（potassium-chloride cotransporters 2，KCC2）的功能失調導致氯離子穩態改變，被認為是NP發病的關鍵因素［5-6］。然而，電針能否通過調控小膠質細胞活化及NKCC1/KCC2緩解紫杉醇誘導的NP尚鮮見報道。本研究建立了紫杉醇誘導的NP大鼠模型，觀察針刺“足三里（ST36）”和“陽陵泉（GB34）”穴位對模型大鼠疼痛行為學的改變，檢測脊髓背角小膠質細胞活化狀態與NKCC1/KCC2表達的變化，探討電針改善紫杉醇誘導的NP的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 SPF級雄性SD大鼠48只，體質量180～200 g，購于昆明醫科大學實驗動物中心，生產許可證號：SCXK（滇）K2020-0004。大鼠分籠飼養，12 h/12 h明暗交替，自由攝食攝水。適應性喂養1周后進行實驗操作。利用隨機數字表法將大鼠分為4組：溶媒組（Vehicle組）、紫杉醇組（PTX組）、紫杉醇+電針組（PTX+EA組）、紫杉醇+假電針組（PTX+Sham EA組），每組12只。本實驗過程嚴格遵守《關于善待實驗動物的指導性意見》。所有動物飼養和實驗操作程序已經通過昆明醫科大學實驗動物倫理委員會批準（倫理批號：kmmu20220723）。

1.2 實驗試劑與儀器 紫杉醇（上海麥克林生物科技有限公司）；異氟醚（深圳瑞沃德生命科技有限公司）；聚氧乙烯蓖麻油（山東優索化工科技有限公司）；無水乙醇（天津致遠化學試劑有限公司）；RIPA裂解液、BCA蛋白定量檢測試劑盒（武漢賽維爾生物科技有限公司）；4%多聚甲醛溶液、超敏ECL化學發光液、通用型抗體稀釋液、山羊血清、脫脂奶粉、TBST緩沖液、PBS緩沖液、含DAPI的抗熒光淬滅封片劑（合肥白鯊生物科技有限公司）；PAGE彩色快速凝膠制備試劑盒、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（蘇州優逸蘭迪生物科技有限公司）。一抗：兔源NKCC1、兔源離子鈣結合銜接分子1（Iba1）、小鼠源GAPDH（武漢三鷹生物技術有限公司），小鼠源KCC2（美國CST公司）。二抗：HRP標記的山羊抗兔IgG、HRP標記的山羊抗小鼠IgG、Elab Fluor 488山羊抗兔IgG、Elab Fluor 594山羊抗兔和山羊抗小鼠IgG（武漢伊萊瑞特生物科技有限公司）。電針儀、一次性使用無菌電針（蘇州醫療用品廠）；電泳及成像系統（美國Bio-Rad公司）；切片機（美國Leica公司）；共聚焦熒光顯微鏡（日本Olympus公司）；機械痛測試用Von Frey纖維絲（美國Ugo basile公司）；熱痛刺激儀（成都泰盟有限公司）；小動物麻醉機（深圳瑞沃德生命科技有限公司）。

1.3 造模方法 適應性飼養后，參照Polomano等［7］的方法，PTX組于第0、2、4、6天腹腔注射紫杉醇溶液（2 mg/kg），總量達到8 mg/kg，以此構建NP模型。Vehicle組在相同時間點腹腔注射等體積的溶劑。紫杉醇溶液配制方法如下：采用聚氧乙烯蓖麻油和無水乙醇等體積混合將紫杉醇溶解至5 g/L后，再用0.9%氯化鈉注射液稀釋至1 g/L。溶劑按照聚氧乙烯蓖麻油∶無水乙醇∶0.9%氯化鈉 = 1∶1∶8體積配制。大鼠機械撤足閾值下降至基線的50%或以下為建模成功。

1.4 干預手段 PTX+EA組大鼠于第8天開始電針治療，持續7 d，參照文獻［8］穴取“足三里”和“陽陵泉”。大鼠經0.5%～1.5%異氟醚吸入淺麻醉后固定并剃毛消毒，然后使用一次性無菌針垂直進針2～3 mm，連接神經刺激儀，選用2 Hz/100 Hz交替波脈沖電流連續刺激，刺激強度為1.5 mA，針刺30 min/次。Vehicle組、PTX組給予麻醉和固定相同的時長，PTX+Sham EA組予以麻醉固定以及針刺，但不通電刺激。實驗流程見圖1。

1.5 觀察指標及測試方法 于紫杉醇注射前2 d和注射后第1、3、5、7、14、21天進行痛行為學測試。機械撤足閾值參照Chaplan等［9］報道的“Up-Down”法進行測定，基線測試開始前3 d對大鼠進行適應性訓練。正式測試時將大鼠置于測試網上適應30 min。從2 g開始，纖毛通過測試網眼垂直刺向大鼠后爪的足底皮膚，用力至其稍彎成S形，保持3～5 s，觀察大鼠反應。大鼠在刺激時間內出現舔足或縮足反應記為陽性反應；若無，則記為陰性。陽性使用相鄰遞減力量的纖毛刺激，陰性則遞增。結束測試的原則為：（1）使用至最大或最小刺激強度時仍然沒有出現陽性反應。（2）出現陽性反應后，依據測量規則測3次。熱縮足潛伏期：按Hargreaves等［10］報道的方法將大鼠置于測試玻璃板上適應環境30 min后開始測試。為避免熱灼傷，設置刺激上限為20 s。在測量基礎值時調整熱輻射刺激強度，使熱縮足潛伏期基礎值維持在9～12 s，記錄此時的輻射強度，接下來的測試均固定使用此強度進行。測試時調整測試玻璃板下的輻射光源，輻射點對準大鼠后足掌心后啟動，當大鼠出現縮足反應后，輻射自動停止，記錄此時的時間。每只大鼠每側足測量3次后取平均值，每次至少間隔5 min。

1.6 脊髓組織取材 大鼠置于小動物麻醉機與麻醉揮發罐相連接的麻醉誘導盒內，保持氣體流量2 L/min，維持揮發罐異氟醚濃度為4%～5%，利用吸入過量異氟醚的麻醉方法處死大鼠。利用隨機數字表法每組抽取5只大鼠，剪開胸腔，經主動脈灌注PBS溶液約200 mL后灌注4%多聚甲醛約300 mL固定，完整取出大鼠腰膨大部位的脊髓組織，放入30%蔗糖溶液脫水備用。每組中剩下的7只大鼠，經主動脈灌注PBS溶液約400 mL后取出腰膨大部位的脊髓組織，液氮速凍后放入-80 ℃冰箱備用。

1.7 免疫熒光染色評估脊髓背角組織中NKCC1、KCC2、Iba1表達變化 脫水完畢的組織，通過包埋、切片（厚度10 μm），切片收集于0.01 mol/L的PBS液中，挑選適宜數量的脊髓切片轉移至盛有PBST液的24孔板中，PBST洗片3次，每次5 min后吸干液體，10%山羊血清封閉1 h、4 ℃孵一抗NKCC1（1∶200）、KCC2（1∶150）、Iba1（1∶200）過夜，PBST洗片3次，每次5 min，室溫避光孵育熒光二抗（1∶200）2 h，用PBS液洗滌3遍后，用含DAPI的抗熒光淬滅的封片劑進行封片。最后于共聚焦顯微鏡下拍照，用Image J軟件分析脊髓背角陽性表達百分比。

1.8 Western blot檢測脊髓背角組織中NKCC1、KCC2、Iba1蛋白表達變化 于腰膨大部位的脊髓背角組織加入300 μL的RIPA裂解液，勻漿后離心，BCA法測定蛋白濃度。電泳時，上樣蛋白總量為40 μg，轉膜，封閉后，4 ℃一抗NKCC1（1∶1 000）、KCC2（1∶1 000）、Iba1（1∶1 000）孵育過夜。經TBST洗滌后室溫孵育二抗（1∶5 000）2 h，TBST洗滌后用ECL顯影液顯影拍照，用Image J軟件分析條帶灰度值。

1.9 統計學方法 用GraphPad Prism 10.0繪圖和統計分析，所有數據以均數±標準差（[x] ±s）表示。大鼠體質量、行為學測試的結果進行重復測量資料的雙因素方差分析，Western blot和免疫熒光檢測結果采用單因素方差分析，組間多重比較用Tukey檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠體質量變化 隨著飼養時間的延長，各組大鼠的體質量均呈現上升趨勢，相同時間點的體質量差異均無統計學意義（P＞0.05），見圖2。

2.2 大鼠機械撤足閾值變化 各組大鼠機械撤足閾值在紫杉醇注射前2 d和注射后第1天差異無統計學意義（P＞0.05）。與Vehicle組相比，PTX組、PTX+Sham EA組大鼠的機械撤足閾值在第3、5、7、14、21天降低（P＜0.05），PTX+EA組在第3、5、7、14天降低（P＜0.05）。與PTX組相比，PTX+EA組大鼠的機械撤足閾值在第14和21天時升高（P＜0.05），見表1。

2.3 大鼠熱縮足潛伏期變化 各組大鼠熱縮足潛伏期在紫杉醇注射前2 d和注射后第1天差異無統計學意義（P＞0.05）。與Vehicle組相比，PTX組、PTX+Sham EA組大鼠的熱縮組潛伏期在第3、5、7、14、21天均降低（P＜0.05），PTX+EA組在第3、5、7天降低（P＜0.05）。與PTX組相比，PTX+EA組大鼠的熱縮足潛伏期在第14和21天時增加（P＜0.05），見表2。

2.4 大鼠脊髓背角組織中NKCC1、KCC2、Iba1蛋白表達量變化 Western blot結果表明，與Vehicle組比較，PTX組、PTX+Shane EA組NKCC1和Iba1蛋白表達量均顯著增加，與PTX組比較，PTX+EA組NKCC1和Iba1蛋白表達量均明顯下調（均P＜0.05），4組間KCC2蛋白表達量差異無統計學意義（P＞0.05），見圖3、表3。

2.5 大鼠脊髓背角組織中NKCC1、KCC2、Iba1陽性染色面積占比變化 免疫熒光染色結果表明，與Vehicle組比較，PTX組、PTX+Sham EA組NKCC1和Iba1陽性染色面積占比顯著增加；與PTX組比較，PTX+EA組NKCC1和Iba1陽性染色面積占比明顯下調（均P＜0.05），4組間KCC2陽性染色面積占比差異無統計學意義（P＞0.05），見表4、圖4。

3 討論

目前紫杉醇誘導的NP發病機制尚不清楚，西醫臨床治療以緩解疼痛癥狀為主，但長期服用易出現不良反應［11］。中醫針刺緩解NP的效果得到肯定而且有良好的應用前景［12］。在既往研究中，不同類型的NP多以下肢近端取穴為主，表明針刺可以通過調控神經遞質及受體，調控膠質細胞和細胞因子等中樞和外周機制，起到緩解NP的作用［13-14］。研究表明，針刺足三里可以通過內源性阿片系統有效緩解奧沙利鉑誘導的NP［15］。本研究采用大鼠腹腔注射紫杉醇以建立NP動物模型，建模成功后選取足三里、陽陵行持續1周的電刺激，與PTX組對比，PTX+EA組大鼠機械撤足閾值和熱縮足潛伏期顯著提高，表明電針可以有效緩解紫杉醇誘導的NP。

小膠質細胞相當于腦和脊髓內的“巨噬細胞”，但過度的激活會引發神經毒性［16-17］。小膠質細胞是神經病理性疼痛發生和維持的關鍵細胞類型之一［18］。其對中樞神經系統損傷反應靈敏，能迅速增殖、活化，釋放大量細胞因子和多種細胞毒性物質，誘導小膠質細胞中受體及相關信號通路功能改變，加劇神經病理性疼痛的發生和維持，甚至在沒有神經損傷的正常生理狀態下，誘導活化小膠質細胞也會出現痛覺過敏［19］。在本研究中，紫杉醇誘導的NP大鼠脊髓背角的小膠質細胞活化增加，電針刺激減少了NP大鼠脊髓背角的小膠質細胞的活化，說明電針緩解紫杉醇誘導的NP與其抑制了小膠質細胞的增殖和活化有關。此外，研究發現小膠質細胞可以通過BDNF-TrkB-KCC2通路改變神經元氯離子穩態，從而導致脊髓背角γ-氨基丁酸（GABA）能神經元去抑制誘發痛覺超敏［20］。NKCC1和KCC2是主要的陽離子-氯離子共轉運體，NKCC1將氯離子運至胞內，提高胞內氯離子濃度，KCC2則將氯離子運至胞外，降低胞內氯離子濃度，生理狀態下，NKCC1和KCC2處于動態平衡，共同維持細胞膜內外氯離子濃度梯度，使胞內維持在一個低氯狀態，這也是γ-氨基丁酸A型受體（GABAAR）發揮抑制作用的基礎［21］。病理狀態下，NKCC1和KCC2功能或表達異常，導致胞內氯離子異常升高，GABA能神經元去抑制，GABAAR發揮興奮性效應，介導病理性疼痛的產生。本研究結果表明，與Vehicle組相比，PTX組大鼠脊髓背角的NKCC1表達量增加，KCC2表達量沒有改變。同時，電針刺激可明顯逆轉紫杉醇誘導NKCC1的表達增加和小膠質細胞活化。Chen等［22］研究證實，在紫杉醇誘導的NP大鼠模型中，脊髓背角NKCC1的蛋白水平顯著增加，KCC2表達量未發生變化，且抑制NKCC1可有效緩解紫杉醇誘導的大鼠痛覺過敏，這與本研究結果一致。

綜上，電針緩解了紫杉醇誘導的NP，其機制可能與其抑制脊髓背角小膠質細胞活性，以及降低NKCC1表達量有關。本研究對電針在臨床上應用以緩解化療藥物誘導的NP具有積極作用，但未探索小膠質細胞活化與NKCC1和KCC2表達是否存在上下游調控關系，這也將是本課題組后續研究的重點內容。

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（2024-05-16收稿 2024-06-20修回）

（本文編輯 李國琪）