基于網絡藥理學烏鱉返春口服液活性成分篩選

摘要" 烏鱉返春口服液是一種結合了現代藥物與食品特性的產品。本研究采用網絡藥理學方法，利用TCMSP數據庫并結合相關文獻查找其活性成分；通過SwissTargetPrediction和PharmMapper數據庫預測其活性成分的可能作用靶點，在Genecards、DisGeNET和OMIM數據庫檢索、篩選活性成分作用的相關靶點；利用STRING數據庫構建潛在作用靶點的蛋白相互作用（PPI）網絡，篩選出該口服液活性成分作用的關鍵靶點網絡，并對這些關鍵靶點進行GO功能和KEGG通路富集分析，確定其核心通路，以構建該口服液活性成分的作用網絡。結果表明，共獲得該口服液活性成分75個，基于活性成分得到384個潛在作用靶點，通過潛在作用靶點PPI網絡篩選得到75個關鍵靶點。GO功能富集到892個條目，KEGG富集到164條通路。綜合以上結果，認為該口服液活性成分作用機制可能是通過大黃蒽醌類、黃酮類和植物甾醇類化合物作用于AKT1、TNF和IL6核心靶點，以PI3K-Akt、HIF-1、mTOR和FoxO為信號通路來實現。

關鍵詞" 烏鱉返春口服液；藥食同源；活性成分篩選；網絡藥理學

中圖分類號" R285"""""" 文獻標識碼" A"""""" 文章編號" 1007-7731（2024）21-0094-05

DOI號" 10.16377/j.cnki.issn1007-7731.2024.21.019

基金項目 江蘇省中醫藥管理局面上項目（MS2021017）。

作者簡介 于茜（1990—），女，江蘇淮安人，碩士，助理研究員，從事藥理學研究數據管理工作。

通信作者 左文婷（1988—），女，江蘇鹽城人，博士，主治中醫師，從事藥物活性成分研究。

收稿日期 2024-07-11

Screening of active ingredients in Wubiefanchun oral liquid based on network pharmacology

YU Qian1""" ZHU Yuanyuan1""" ZHOU Zhuxiu1""" ZUO Wenting2

（1Affiliated Hospital of Nanjing University of Traditional Chinese Medicine， Nanjing 210029， China;

2Jiangsu Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine， Nanjing 210029， China）

Abstract" Wubiefanchun oral liquid is a kind of product which combines the characteristics of modern medicine and food. The active ingredients were found by using TCMSP database and related literature using network pharmacology method. The potential targets of active ingredients were predicted by SwissTargetPrediction and PharmMapper databases， and the related targets were searched and screened in Genecards， DisGeNET and OMIM databases. The protein-protein interaction （PPI） network of the potential target was constructed using STRING database， and the key target network of the active ingredient of the oral liquid was screened out， and the GO function and KEGG pathway enrichment analysis were performed on these key targets to determine their core pathway， so as to construct the action network of the active ingredient of the oral liquid. The results showed that a total of 75 active ingredients were obtained， 384 potential targets were obtained based on the active ingredients， and 75 key targets were obtained through potential target PPI network screening. GO was enriched to 892 entries and KEGG was enriched to 164 pathways. Based on the above results， the mechanism of action of the active ingredients of the oral liquid may be realized through the action of rhubarb anthraquinones， flavonoids and phytosterols on the core targets of AKT1， TNF and IL6， with PI3K-Akt， HIF-1， mTOR and FoxO as signaling pathways.

Keywords" Wubiefanchun oral liquid; homology of medicine and food; screening of active ingredients; network pharmacology

烏鱉返春口服液是一種藥食同源類口服液，其結合了藥物的治療作用與食品的安全性，具有治療部分婦科疾病的功效[1]。其主要功效為補肝腎、健脾胃、調沖任，臨床用于治療卵巢功能早衰及其相關癥狀，如月經失調、閉經和烘熱汗出等[2]。該口服液基于補腎健脾法組方，經過現代制藥技術研制而成，原料由鱉甲（炙）、何首烏、枸杞子、白術、茯苓、續斷和黃狗腎等構成[3]。

關于該口服液的作用機制，已在其藥效、安全性以及臨床應用等方面取得了一定的研究進展[1-3]。藥效方面，該口服液可一定程度上緩解圍絕經期綜合征肝腎陰虛癥患者的臨床癥狀，降低血清卵泡刺激素（Follicle stimulating hormone，FSH）、黃體生成素（Luteinizing hormone，LH）水平，升高雌激素雌二醇（Estradiol，E2）水平，從而明顯改善使用者的整體狀況。在安全性方面，該口服液展示出良好的安全性，使用者的血常規、尿常規、大便常規以及肝腎功能等各項指標均在正常范圍內，未出現明顯的不良反應[3]。此外，該口服液的臨床應用范圍也在不斷擴大。作為一種藥食同源類口服液，其具有一定的治療作用，又相對安全，適用于婦科類疾病治療和康復，但其作用機制有待進一步深入研究。

網絡藥理學主要通過構建生物分子網絡模型，利用系統生物學的理論和方法[4]，來預測和識別藥物中的活性成分及其作用機制[5]。該方法綜合考慮了藥物與生物系統間的相互作用，從而能更準確地篩選出具有潛在療效的活性成分[6]。網絡藥理學因具有系統性層次分析、預測能力強、整合多環節信息、高效篩選以及個性化用藥指導等優勢，在活性成分研究與篩選中得到了廣泛應用[7]。本研究采用網絡藥理學方法，探索烏鱉返春口服液潛在的活性有效成分，分析關鍵靶點及信號通路，為該口服液的推廣應用及試驗研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 活性成分篩選和靶點預測

在中藥系統藥理學數據庫（TCMSP）中檢索烏鱉返春口服液協定藥方中的所有中藥材，采用口服生物利用度≥30%、類藥性≥0.18的標準進行主要成分篩選，獲得枸杞子、白術、茯苓和續斷4種有效成分；再通過中國知網、Pubmed等文獻數據庫[8]獲得鱉甲（炙）、何首烏和黃狗腎3種活性成分。進一步利用PubChem數據庫查找該口服液中活性成分的2D結構，利用SwissTargetPrediction和PharmMapper數據庫預測以上活性成分的靶點基因，匯總合并去重后形成該口服液的活性成分作用靶點。

1.2 潛在作用靶點篩選及獲取

以“早發性卵巢功能不全（Premature ovarian insufficiency，POI）”為關鍵詞，分別在GeneCards、DisGeNE和OMIM數據庫進行疾病靶點檢索。在GeneCards數據庫設定參數relevance score≥5作為篩選條件[9]，篩選結果與DisGeNET和OMIM數據庫所得結果合并去重，得到POI疾病靶點。

使用Venny 2.1.0軟件導入上述藥物活性成分靶點和疾病靶點，繪制韋恩圖，所得的交集靶點即為該口服液活性成分的潛在作用靶點。

1.3 蛋白相互作用（PPI）網絡構建

采用STRING數據庫分析交集靶點，以“Homo sapiens”為物種，設定medium confidence（0.400）得到蛋白相互作用（Protein-protein interaction，PPI）網絡結果。通過Cytoscape 3.7.2軟件分析網絡，使用CytoNCA插件得到核心靶點，并作為該口服液治療POI的關鍵靶點。

1.4 核心靶點基因富集

挖掘其核心靶點的作用機制，利用DAVID數據庫對核心靶點進行GO功能和KEGG通路富集分析。對GO富集中每項排名前10的條目數據以及KEGG富集結果中排名20的通路數據進行處理，分別導入微生信可視化云平臺及Sangerbox 3.0平臺，繪制GO富集柱狀圖和KEGG富集氣泡圖。

1.5 創建“藥物—活性成分—核心靶點”網絡

將活性成分與核心靶點、烏鱉返春口服液進行對應，再將核心靶點與POI進行對應，創建Network和Type文件，通過Cytoscape 3.7.2軟件構建“藥物—活性成分—核心靶點”網絡。

2 結果與分析

2.1 活性成分篩選

通過TCMSP數據庫篩選獲得29個活性成分，其中枸杞子17個、白術1個、茯苓7個和續斷4個。另通過文獻檢索獲得46個活性成分，其中鱉甲（炙）4個、何首烏27個和黃狗腎15個。共獲得75個烏鱉返春口服液活性成分。

2.2 潛在作用靶點篩選

通過SwissTargetPredicton與Pharmmapper數據庫檢索，其中SwissTargetPredicton數據庫檢索得到939個作用靶點，PharmMapper數據庫檢索得到434個作用靶點。合并去重得到75個活性成分的作用靶點共1 166個。利用GeneCards、DisGeNET和OMIM等數據庫共篩選出1 972個POI相關靶點。通過該口服液活性成分的預測靶點交集，得到潛在作用靶點384個，如圖1所示。

2.3 PPI網絡構建

將384個潛在作用靶點導入STRING數據庫，限定物種為“Homo sapiens”，篩選得到交互分數大于0.4的結果，得到383個節點、11 113條邊的PPI網絡。再導入Cytoscape 3.7.2軟件，以平均數為篩選標準，篩選出degree≥58.031 331 592 689 300、betweenness centrality≥367.869 451 697 128和closeness centrality≥0.001 353 103 582 739 770的靶點作為核心靶點，共計75個，作為該口服液的關鍵靶點，其中TNF、AKT1、JUN、IL6與GAPDH處于機制中的核心位置，節點顏色越深，degree值越大。

2.4 核心靶點基因的GO功能及KEGG通路富集

對所篩選的75個關鍵靶點的GO功能和KEGG通路富集，結果見圖2。GO功能富集到892個條目，共涉及694個生物過程相關條目，其中前10個條目涉及細胞凋亡、基因表達、細胞增殖和蛋白質磷酸化等過程；共涉及84個細胞組成相關條目，前10個條目涉及大分子復合物、細胞質、細胞核和膜筏等；共涉及114個分子功能相關條目，前10個條目主要包括酶結合、蛋白質結合、轉錄激活因子結合和蛋白激酶結合等（圖2A）。KEGG通路富集得到164條通路，其中前20條通路包括PI3K-Akt、HIF-1、Estrogen、FoxO和mTOR等信號通路（圖2B）。

2.5 “藥物—活性成分—核心靶點—疾病”網絡創建

該口服液的“藥物—活性成分—核心靶點”網絡見圖3。圖中六邊形節點代表烏鱉返春口服液，倒三角形節點代表其活性成分，圓形節點代表其核心靶點，連接線代表各節點之間的相互作用。該網絡包括148個節點、2 589條邊。該口服液中75個成分均參與網絡調控，其中大黃酚、洋地黃蒽醌、大黃素甲醚、大黃素-8-甲醚、芹菜素、槲皮素、山柰酚和茯苓酸等化合物具有良好的抗炎活性；豆甾醇、谷甾醇和β-谷甾醇等植物甾醇具有一定的卵巢保護作用；以上化合物均是該口服液的中藥活性成分，對其臨床應用均可能發揮著一定作用。該口服液以AKT1、TNF和IL6等為核心靶點，可能通過PI3K-Akt、HIF-1、mTOR和FoxO等多條信號通路發揮作用。

3 結論與討論

黃珊珊[10]研究發現，免疫功能引起的慢性低度炎癥可能是導致POI的重要因素之一，患者的中性粒細胞/淋巴細胞比值會明顯升高，并且與FSH水平呈正相關，這提示了機體炎癥狀態可能是發病過程中的關鍵環節之一。大黃酚、洋地黃蒽醌、大黃素甲醚和大黃素-8-甲醚為蒽醌類成分，具有良好的抗炎活性，大黃蒽醌類化合物通過多靶點、多通路串擾，調控抗炎過程[11]。芹菜素、槲皮素和山柰酚均為黃酮類化合物，具有調節免疫、抗氧化應激和抗炎等作用[12]。因其結構與雌激素相似，可發揮一定程度的雌激素樣作用，具有雙向調節性[13]。茯苓酸是從茯苓中提取的四環三萜類化合物，具有抗氧化、抗炎和降血糖等作用[14]。臨床上主要通過補充外源性雌激素（如戊酸雌二醇等）來改善患者激素狀態，在一定程度上緩解不適癥狀[15]。此外，南楠等[16]研究表明，植物甾醇具有類雌激素作用，能促進內分泌平衡。

本研究中，由核心靶點的PPI網絡可知，AKT1、TNF和IL6等為該口服液治療POI的關鍵靶點。AKT1作為絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（Serine/Threonine kinase proteins，AKT）的亞型之一，在身體各個組織中都有表達[17]，影響細胞增殖、分化、存活和凋亡，對細胞存活至關重要[18]。AKT1活化可以抑制下游促凋亡因子Bad和胱天蛋白酶9（Caspase9）表達，促進顆粒細胞的增殖，抑制顆粒細胞凋亡以及卵泡閉鎖[19]。KEGG富集結果表明，PI3K-Akt等相關信號通路與POI密切相關。磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信號通路是體內的基本信號通路，對卵巢休眠和卵泡的早期激活非常重要，卵泡過度閉合可能會加速卵巢功能衰竭。多項研究表明，在缺氧條件下PI3K-Akt信號通路會被激活，而缺氧的關鍵因子HIF-1是PI3K-Akt的靶蛋白之一，在維持氧穩態方面發揮著重要作用[16，18]。PI3K-Akt通路激活后可能會增加HIF-1的轉錄活性，從而導致其過度表達和加速顆粒細胞凋亡，這是促進卵泡閉鎖的重要因素。

烏鱉返春口服液是一種結合了藥物和食品特性的產品，強調食物與藥物之間的互補和協同作用，其不僅具有營養價值，還有助于預防和治療疾病?；谶@一理念，該口服液將中藥有效成分與營養豐富的食材相結合，形成了獨特的產品，在現代健康管理中發揮一定作用。該類產品可以調節身體機能、增強免疫力、緩解疲勞和改善睡眠質量等，具有廣泛的應用前景和市場需求。隨著人們對健康生活的追求和對藥食同源理念的深入認識，該類產品有望得到更多關注和更遠發展。

綜上，本研究基于網絡藥理學方法探究了藥食同源烏鱉返春口服液的作用機制，分析其主要活性成分、關鍵靶點及信號通路。結果表明，該口服液可能是通過大黃蒽醌類、黃酮類和植物甾醇類化合物等活性成分，以AKT1、TNF和IL6等作為核心靶點，通過PI3K-Akt、HIF-1、mTOR和FoxO等多條信號通路來發揮作用。本研究可為藥食同源口服液的進一步試驗及臨床研究提供參考，相關研究結果仍有待開展進一步的生物學驗證。

參考文獻

[1] 王允吉，王海丹，劉璐，等. 基于UHPLC-Q-Exactive-Orbitrap-MS的苦黃注射液化學成分分析[J]. 中南藥學，2022，20（10）：2295-2304.

[2] 左文婷，郭銀華，談勇，等. 烏鱉返春口服液聯合PPOS方案對卵巢低儲備患者行體外受精-胚胎移植臨床結局的影響[J]. 中醫藥導報，2022，28（10）：59-63.

[3] 方芳. 烏鱉返春口服液治療圍絕經期綜合征肝腎陰虛證的臨床觀察[D]. 南京：南京中醫藥大學，2019.

[4] 才振國. 基于網絡藥理學探討血府逐瘀湯對缺血心肌保護機制的研究及治療穩定型心絞痛的臨床觀察[D]. 哈爾濱：黑龍江中醫藥大學，2023.

[5] 陳春妮. 基于代謝組學和網絡藥理學技術探討黃芩總黃酮改善阿爾茨海默癥的作用機制[D]. 太原：山西大學，2023.

[6] 陳明瑞. 基于網絡藥理學研究枳實薤白桂枝湯組方對治療冠心病的作用機制[D]. 濟寧：濟寧醫學院，2023.

[7] 金渭荃. 基于網絡藥理學與分子對接研究刺山柑果實提取物對類風濕性關節炎的作用機制[D]. 烏魯木齊：新疆農業大學，2022.

[8] 陳文英，盧素杰. 中醫治療早發性卵巢功能不全的機制及療效研究進展[J]. 廣西中醫藥大學學報，2023，26（4）：78-80，85.

[9] 郝海鑫，謝心美，何劍斌. 植物甾醇對去卵巢KM小鼠血清生殖激素及乳腺組織孕激素受體的影響[J]. 現代畜牧獸醫，2014（5）：4-8.

[10] 黃姍姍. 補腎活血方對免疫性卵巢早衰小鼠PI3K、AKT1及MTOR蛋白表達的影響[D]. 長沙：湖南中醫藥大學，2019.

[11] 趙鵬鴻，孫陽龍，田澳凱，等.基于網絡藥理學和分子對接探究牛膝—肉蓯蓉—山茱萸治療帕金森病的作用機制[J].中醫臨床研究，2024，16（14）：43-51.

[12] 曾麗華，朱玲，葉金飛，等. 基于網絡藥理學探討左歸丸治療早發性卵巢功能不全機制[J]. 遼寧中醫藥大學學報，2020，22（10）：58-65，221.

[13] 王鑫. 滋腎活血調經方聯合芬嗎通治療腎虛血瘀型POI的臨床及網絡藥理學研究[D]. 哈爾濱：黑龍江中醫藥大學，2023.

[14] 熊露，劉莉，胡雅君. TNF-α、IFN-γ、IL-2及生殖激素在卵巢早衰中的水平變化及臨床意義[J]. 國際檢驗醫學雜志，2020，41（6）：745-748.

[15] 李德保，周莉，孫祖越. 早發性卵巢功能不全相關信號通路研究進展[J]. 中國比較醫學雜志，2020，30（2）：121-127.

[16] 南楠，杜小利，陳苗，等. 基于PI3K/Akt/HIF-1信號通路探討杞蓉片改善卵巢顆粒細胞凋亡的作用機制[J]. 中國中藥雜志，2023，48（17）：4774-4781.

[17] 張慧，李雯雯，張建濤. 益腎養卵方對早發性卵巢功能不全患者卵巢儲備功能、卵巢顆粒細胞Bcl-2/Bax的表達及PI3K/AKT信號通路的影響[J]. 中醫藥導報，2021，27（9）：108-111，116.

[18] 唐麗，牟珍妮，申思楠，等. 基于PI3K/Akt/mTOR通路探討助卵湯對大鼠早發性卵巢功能不全的保護作用機制[J]. 中國實驗方劑學雜志，2023，29（4）：52-59.

[19] 李昕，馬紅霞，史艷馨. 護巢飲調節PI3K/Akt/Nrf2/HO-1通路對早發性卵巢功能不全大鼠氧化應激的影響[J]. 現代中西醫結合雜志，2023，32（10）：1341-1347.

（責任編輯：何" 艷）