GDNF、GAP-43、NSE 及 S-100 蛋白在先天性巨結腸患兒中的表達水平及意義

【摘要】 目的 探討與分析膠質細胞源性神經生長因子（GDNF）、生長相關蛋白-43（GAP-43）、神經元特異性烯醇化酶（NSE）、S-100蛋白在先天性巨結腸（HD）患兒中的表達水平及意義。

方法 選擇2019年9月至2022年10月診治的先天性巨結腸患兒72例作為巨結腸組，選擇同期因其他非腸神經節病變而行結腸手術的患兒 72 例作為參照組。取兩組的結腸全層病理標本并進行 GDNF、GAP-43、NSE 及 S-100 蛋白表達免疫組化分析，同時進行先天性巨結腸相關性小腸結腸炎（HAEC）診斷評分與相關性分析，取巨結腸組的不同腸段組織標本進行檢測。

結果 巨結腸組的結腸全層 GDNF、GAP-43、NSE、S-100 蛋白表達陽性率分別為77.8%、73.6%、81.9%、83.3%，顯著高于參照組的 22.2%、26.4%、20.8%、22.2%（Plt;0.001）。先天性巨結腸患兒不同結腸區域（狹窄段、移行段、擴張段、正常段）的GDNF、GAP-43、NSE、S-100 蛋白表達陽性率對比差異有統計學意義（Plt;0.001）。巨結腸組的 HAEC 診斷評分與參照組相比明顯提高（Plt;0.001）。在巨結腸組中，Spearman 分析顯示 HAEC 診斷評分與結腸全層GDNF、GAP-43、NSE、S-100 蛋白表達陽性率呈正相關（Plt;0.001）。

結論 先天性巨結腸患兒多伴有 GDNF、GAP-43、NSE、S-100 蛋白的高表達，與患兒病情存在相關性，值得臨床關注。

【關鍵詞】 先天性巨結腸；小兒；膠質細胞源性神經生長因子；神經元特異性烯醇化酶；生長相關蛋白-43；S-100 蛋白；相關性

中圖分類號：R726.5 ""文獻標志碼：A ""DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2024.10.009

Expression levels and significance of GDNF， GAP-43， NSE， and

S-100 proteins in children with Hirscbsprung's disease

YAN Ran1a， GUO Chunna1a， XU Ke2， XU Jinzhong1b

（1a. Department of Pathology， 1b. The Second Department of Surgery， 1. Kaifeng Children's Hospital， Kaifeng 475000，

Henan， China; 2. Department of General Surgery， Affiliated Children's Hospital of Zhengzhou University—Henan

Provincial Children's Hospital ［Zhengzhou Children's Hospital］， Zhengzhou 450000， Henan， China）

【Abstract】 Objective To explore and analyze the expression levels and significance of glial cell derived neurotrophic factor （GDNF）， growth-associated protein-43 （GAP-43）， neuron-specific enolase （NSE）， and S-100 protein in children with Hirschsprung's disease （HD）.

Methods 72 children with HD who were diagnosed and treated from September 2019 to October 2022 were selected as HD group， and 72 children who underwent colon surgery for other non intestinal ganglion lesions during the same period were selected as control group. Colon full-thickness pathological specimens of the two groups were taken， and immunohistochemical analysis of GDNF， GAP-43， NSE， and S-100 protein expressions was performed. At the same time， diagnostic scoring and correlation analysis for Hirschsprungs-associated enterocolitis （HAEC） were conducted， and tissue samples from different intestinal segments of the HD group were collected for testing.

Results The positive expression rates of GDNF， GAP-43， NSE， and S-100 proteins in the full-thickness colonic specimens of the HD group were 77.8%， 73.6%， 81.9%， and 83.3%， respectively， which were significantly higher than those in the control group （22.2%， 26.4%， 20.8%， and 22.2%， respectively） （Plt;0.001）. There were statistically significant differences in the positive expression rates of GDNF， GAP-43， NSE， and S-100 proteins in different colonic regions （narrow segment， transitional segment， dilated segment， and normal segment） of children with HD （Plt;0.001）. The HAEC diagnostic score of the HD group was significantly improved compared to that of the control group （Plt;0.001）. In the HD group， Spearman analysis showed that there was a positive" correlation between the HAEC diagnostic score and the positive expression rates of GDNF， GAP-43， NSE， and S-100 proteins in the full-thickness of the colon （Plt;0.001）.

Conclusion Children with HD are mostly accompanied by high expressions of GDNF， GAP-43， NSE and S-100 protein， which is related with the condition of children and deserves clinical attention.

【Keywords】 Hirscbsprung' s disease（HD）; children; glial cell derived neurotrophic factor （GDNF）; neuron-specific enolase （NSE）; growth related protein-43; S-100 protein; relativity

先天性巨結腸（Hirschsprung's disease，HD）又稱為腸管無神經節細胞癥，是一種腸神經系統的先天性異常疾病，主要發生于小兒［1］。該疾病屬于胃腸道先天性發育畸形，是造成新生兒期低位腸梗阻的原因之一［2］。HD的基本病理改變包括肌間神經叢內缺乏、神經纖維排列紊亂及遠端痙攣結腸腸管組織的黏膜下層部分缺乏神經節細胞（intestinal ganglion cells，IGCs），導致腸管無法舒張，呈現痙攣狀態［3］。目前的分子生物學實驗研究表明，多種蛋白的異常表達與HD的發生有關［4］。然而，關于膠質細胞源性神經生長因子（glia cells derived neurotrophic factor，GDNF）、生長相關蛋白-43（growth-associated protein，GAP-43）、神經元特異性烯醇化酶（neuron-specific enolase，NSE）及S-100蛋白與HD發生相關的研究較為匱乏。本文具體探討了GDNF、GAP-43、NSE及S-100蛋白在HD患兒中的表達水平及其意義，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象

2019年9月到2022年10月，選擇在河南省開封市兒童醫院診治的 HD 患兒 72例作為巨結腸組，選擇同期因其他非腸神經節病變而行結腸手術的患兒 72 例作為參照組。兩組患兒的基線資料對比差異均無統計學意義（Pgt;0.05）。見表 1。巨結腸組中長段型 22 例，普通型 38 例，短段型12 例；參照組中肛門閉鎖 35 例，直腸閉鎖 37例。倫理委員會批準了此次研究；患兒家長知情同意。

1.2 樣本量計算方法

將合格率提高至80%，進行病例的篩選，檢驗水準α取雙側檢驗0.05，把握度（1-β）取80%，最終得出巨結腸組、參照組各需要樣本量72例。

1.3 納入與排除標準

納入標準：符合HD診斷標準（結合臨床查體肛查直腸壺腹部空虛，肛管狹窄，拔指后有爆破樣排氣、排便，腹脹可暫時緩解者；在病理診斷中，發現腸神經節細胞缺失或神經干肥大）；其他非腸神經節病變也依據病理確診（神經節細胞減少、變形、消失等）；所有患兒都為首次手術；取樣前未給予任何治療；具有手術指征的患兒；年齡 2～8 歲。排除標準：合并其他主要臟器的先天性畸形患兒；合并高危傳染性疾病的患兒；合并嚴重心肝腎功能異常者。

1.4 GDNF、GAP-43、NSE 及 S-100 蛋白表達情況

所有患兒術前均行常規經肛門鋇灌腸檢查，術中經肛門切除腸段至擴張結腸近端形態學上正常腸管處，包括結腸全層病理標本，同時將巨結腸組的標本在切除腸段中立即分出狹窄段、移行段、擴張段、正常段。將標本固定脫水后，進行常規石蠟包埋與切片，保持切片厚度為4 μｍ。將所有石蠟切片進行免疫組化分析，抗體包括 GDNF、GAP-43、NSE、S-100，所有試劑均為鼠抗人單克隆抗體，購自武漢三鷹生物技術有限公司，稀釋濃度分別為 1∶200、1∶500、1∶200、1∶500。

1.5 HD 相關性小腸結腸炎（HAEC）診斷評分

巨結腸組所有患兒都給予 HAEC 診斷評分，評估的項目包括臨床病史、食鹽水檢查、體格檢查、腹部立位 X線片影像學檢查等，HAEC評分系統≥10 分可診斷為 HD相關性小腸結腸炎，病情與患者的 HAEC 評分呈現正相關性。同時調查與記錄所有患兒的一般資料。

1.6 統計學方法

本次研究的統計軟件為SPSS 25.00，HAEC 評分等計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間兩兩對比采用獨立樣本t檢驗；GDNF 蛋白表達陽性率等計數資料以頻數（n）和百分率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗，相關性分析采用 Spearman 分析，檢驗水準為 α=0.05，雙側檢驗。

2 結 "果

2.1 兩組患兒結腸全層GDNF、GAP-43、NSE、S-100 蛋白表達陽性率對比

巨結腸組的結腸全層 GDNF、GAP-43、NSE、S-100 蛋白表達陽性率分別為 77.8%、73.6%、81.9%、83.3%，顯著高于參照組的 22.2%、26.4%、20.8%、22.2%（P＜0.001）。見表2。

2.2 HD患兒不同結腸區域的GDNF、GAP-43、NSE、S-100 蛋白表達陽性率對比

HD 患兒不同結腸區域（狹窄段、移行段、擴張段、正常段）的 GDNF、GAP-43、NSE、S-100 蛋白表達陽性率對比有明顯差異（P＜0.001），狹窄段和移行段顯著高于擴張段和正常段（P＜0.001）。見表3。

2.3 HAEC診斷評分對比

巨結腸組的 HAEC 診斷評分與參照組相比明顯提高（Plt;0.001）。見表 4。

2.4 相關性分析

在巨結腸組中，Spearman分析顯示 HAEC 診斷評分與結腸全層 GDNF、GAP-43、NSE、S-100蛋白表達陽性率呈正相關（Plt;0.001）。見表 5。

3 討 "論

HD在小兒先天性消化道畸形中發病率居第二位，男女比例約為4∶1。HD患兒在臨床上主要表現為近端正常腸管的代償性擴張、糞便淤積和遠端結腸痙攣等［5］。目前，越來越多的HD患兒在早期能夠被診斷，這可有效改善患兒的預后?，F代研究表明，在胚胎發育過程中，如果受到內外部負面因素的刺激，神經嵴細胞的發育、遷移和分化出現障礙，會導致腸神經節細胞缺失和腸神經系統的發育停頓，從而誘發HD的發生［6］。本研究顯示，巨結腸組的結腸全層GDNF、GAP-43、NSE和S-100蛋白的表達陽性率顯著高于參照組，表明HD患兒普遍伴有GDNF、GAP-43、NSE和S-100蛋白的高表達。從機制上分析，GDNF與其受體結合后能夠激活酪氨酸激酶，進一步使細胞內靶蛋白磷酸化，傳遞與細胞生長、細胞凋亡、細胞分化和細胞增殖等相關的信號，導致神經化學信號傳導異常，同時伴隨神經與腸壁的連接受限，從而引發HD的發生［7］。GAP-43是一種神經營養因子，在調節神經再生和促進神經突觸生長過程中發揮重要作用。GAP-43表達上升會導致其傳遞的腸神經系統抑制性神經遞質相應減少，從而增強腸管收縮，導致抑制性神經減弱，誘發HD的發生。NSE可介導中樞神經系統中突觸的產生，高表達的NSE可抑制突觸的分化和構成，并影響軸突生長能力，導致神經與效應器之間的連接異常，從而造成神經化學信號傳導異常，導致機體出現腸道功能障礙［8］。S-100是一種神經膠質細胞特異性蛋白，在細胞內蛋白質的分解代謝中發揮關鍵作用。作為腸壁神經元細胞的一種標記，S-100蛋白的高表達可導致細胞體結合區域結構的改變，使得神經節細胞不能移行至腸壁內，這也是導致腸功能障礙的重要因素［9］。

HD是一種由多種基因改變引起的遺傳性先天性疾病，確診的依據是發現病變腸管中無神經節細胞［10］。主要的病理變化為病變腸段持續性痙攣或狹窄狀態，腸內容物在近端結腸處發生梗阻，進而導致近端結腸的代償性肥厚和增生等現象［11］。本研究顯示，HD患兒不同結腸區域（狹窄段、移行段、擴張段、正常段）中，GDNF、GAP-43、NSE、S-100蛋白的表達陽性率存在明顯差異，狹窄段和移行段的陽性率顯著高于擴張段和正常段。巨結腸組的HAEC診斷評分與參照組相比明顯提高；Spearman分析顯示，HD患兒的HAEC診斷評分與結腸全層中GDNF、GAP-43、NSE、S-100蛋白的表達陽性率呈正相關，表明HD患兒的GDNF、GAP-43、NSE、S-100蛋白的表達水平與病情存在相關性。與趙平等的研究結果相似，他們發現S-100蛋白的表達與先天性巨結腸的發生和發展密切相關［9］。任傳濤等人也發現GAP-43可能參與HD的發病過程，這與本研究的結果一致［10］。分析顯示，HD多發生于狹窄段和移行段，在病理上可表現為突觸結構異常和抑制性神經遞質減少。而GDNF、GAP-43、NSE、S-100的高表達可能導致神經分化受限，從而增加腸壁肌層中的巨噬細胞數量，損傷腸間隙中的星形膠質細胞網絡，最終導致結腸炎的發生［11-12］。GDNF、GAP-43、NSE、S-100的高表達并未促進神經元的發育，反而可能影響神經元的定植、存活和分化，導致相關區域的腸管缺乏神經節細胞，因此出現運動功能異常，并形成相應的HD組織病理學表現［13-14］。

總之，先天性巨結腸患兒多伴有GDNF、GAP-43、NSE、S-100蛋白的高表達，這與患兒的病情存在相關性，值得臨床關注。

參 考 文 獻

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（收稿日期：2023-09-20 修回日期：2024-02-27）

（編輯：梁明佩）