生菜NRT2/3 的生物信息及功能的初步驗證

摘要： 【目的】硝態氮是旱地植物的主要氮源，NRT2/3 是植物吸收硝態氮、調節氮素吸收的重要蛋白家族。本研究對生菜NRT2/3 家族成員進行鑒定，并研究各成員基因理化性質、基因結構等生物信息和其在蔬菜生長中的功能。【方法】在NCBI 網站 （https：//www.ncbi.nlm.nih.gov） 查詢并下載擬南芥、水稻的NRT2/3 及已被注釋的生菜NRT，通過生物信息學手段鑒定生菜NRT2/3 家族成員，并使用DNAMAN 軟件對生菜和擬南芥的NRT2/3 蛋白進行多序列比對，使用MEGA11 軟件對生菜、水稻和擬南芥的NRT2/3 蛋白進行多序列比對，并構建系統發育樹。通過在線軟件對生菜NRT2/3 家族蛋白理化性質、功能結構域、保守基序、親水性、順式作用元件、基因結構和染色體定位進行分析，對生菜NRT2/3 家族蛋白二級結構、磷酸化位點和跨膜區域進行預測。選用‘意大利’和‘綠雅’兩個品種生菜為試材，根據本課題組前期轉錄組測序結果選取表達量相對較高的NRT2/3 基因，進行表達分析：1） 將生長至20 天的兩個生菜品種幼苗定植于培養基質中，用4 個不同濃度NO3?（0、0.35、0.7 和11.5 mmol/L） 澆灌處理，研究NRT2/3 表達水平；2） 利用TRV-VIGS 瞬時沉默，降低該基因在兩種生菜中的表達水平，然后將兩種生菜移栽于正常NO3?水平的營養液中，生長21 天后收獲，調查NRT2/3 家族TRV-VIGS 沉默后生菜的生長狀況。【結果】本研究共鑒定出8 個生菜NRT2/3 家族成員，包括7 個LsaNRT2 蛋白和一個LsaNRT3.1 蛋白，它們不均勻分布在4 條染色體上，其蛋白理化性質、功能結構域、跨膜區域、磷酸化位點、順式作用元件和基因結構等基本符合NRT2/3 家族共有的特征。轉錄組測序結果顯示，兩個生菜品種的LsaNRT2.4 和LsaNRT3.1 基因在葉片中的表達水平相對較高。LsaNRT2.4 和LsaNRT3.1 基因能夠在一定程度上響應低濃度NO3?。VIGS 沉默后的生菜LsaNRT2.4 和LsaNRT3.1 表達量均顯著下降，株高、葉長、葉寬、葉綠素a 含量和葉片硝酸鹽含量也顯著降低，其中沉默生菜LsaNRT3.1 后的葉片硝酸鹽含量顯著低于沉默生菜LsaNRT2.4 后的葉片硝酸鹽含量。通過表型觀察發現，VIGS 沉默后的生菜出現了葉片小、葉片尖端干枯等癥狀，其中沉默LsaNRT3.1 后的生菜具有更明顯的表型效應。【結論】鑒定出的8 個生菜NRT2/3 家族成員大多數特征符合植物NRT2/3 家族共有的特征，其中LsaNRT2.4 和LsaNRT3.1 基因在葉片中的表達量明顯高于其他6 個基因；LsaNRT2.4 和LsaNRT3.1 在生菜硝酸鹽吸收以及對缺氮和低氮脅迫的快速反應中起著關鍵作用，尤其是在根部的表達中。LsaNRT2.4 和LsaNRT3.1 基因表達的上調改善了生菜的氮吸收和生長。

關鍵詞： 生菜；硝酸鹽；生物信息；NRT；VIGS

葉用萵苣 （Lactuca sativa），又稱生菜，菊科萵苣屬，原產自歐洲地中海沿岸，現廣泛栽培于世界各地[1?2]。生菜不僅富含鐵、鎂、鉀、鈣、磷、硫等礦物質和人體必需元素[3]，也富含抗氧化物質和膳食纖維，備受消費者推崇[4]。人工植物工廠可對作物生長的溫度、濕度、光照、營養液成分及濃度等環境進行控制，可縮短作物生長周期，實現作物周年連續生長[5]。在植物工廠內種植水培生菜，可提高生菜的產量和品質[6]。氮素作為植物生長發育所必需的大量元素之一，在植物體內起著重要作用，是許多重要物質如蛋白質、核酸、葉綠素等的組成部分[ 7 ? 8 ]。氮代謝是植物最基本的物質代謝之一，是植物正常發育的物質基礎。因此，提高植物氮的利用效率已成為研究者關注的重點之一。硝態氮是旱地植物能利用的主要氮源，被植物吸收后被運輸至細胞質中進行能量代謝，還有部分被儲存在植物液泡中[9]。根據基質中硝酸鹽濃度的不同，植物的硝酸鹽轉運系統可分為兩類，即低親和力轉運系統 （low-affinitytransport system， LATS） 和高親和力轉運系統 （highaffinitytransport system， HATS）。LATS 在硝酸鹽濃度高于0.5 mmol/L 時發揮作用；HATS 在硝酸鹽濃度低于0.5 mmol/L 時起作用[10]。硝酸鹽轉運蛋白（nitrate transporter， NRT） 主要作用于植物吸收硝態氮，調節氮素吸收等[ 1 1 ]。NRT 家族包括NRT1、NRT2、NRT3 等[12]，NRT1 家族的成員參與LATS，NRT2 家族的成員主要參與HATS[13]，大多數NRT2蛋白需要NRT3 蛋白的輔助才能運輸硝酸鹽[14]。由于植物吸收作用、地表徑流和微生物反硝化作用的影響，土壤中硝酸鹽的含量逐漸降低，為了提高作物的產量，不得不額外施加氮肥。但長期施用氮肥不僅使作物的產量降低，而且會導致土壤酸化，不利于綠色農業的發展[15?16]。因此，提高氮肥的利用效率，已成為當今綠色農業可持續發展的必然要求[17]。本研究對生菜NRT2/3 家族成員進行鑒定、理化性質分析、基因結構分析等，發現生菜NRT2/3 家族成員的大多數特征基本符合NRT2/3 家族的共同特征；通過分析基因的表達模式和運用病毒誘導的基因沉默（TRV-VIGS） 技術分析部分NRT2/3 基因在生菜中的功能，初步驗證了LsaNRT2.4 和LsaNRT3.1 基因在低氮或缺氮條件下發揮重要作用，為后續研究生菜NRT2/3 基因響應硝酸鹽的分子機制提供了一定的理論依據，也為提高生菜氮肥利用率研究提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 生菜NRT2/3 家族成員鑒定及理化性質分析

在NCBI 網站 （https：//www.ncbi.nlm.nih.gov） 查詢并下載擬南芥、水稻的NRT2/3 及已被注釋的生菜NRT。利用上述獲得的生菜NRT 序列與擬南芥BlastP 以驗證結果，篩選生菜NRT2/3。使用MEGA11 軟件構建進化樹，分析生菜和水稻、擬南芥NRT2/3 蛋白之間的親緣關系，檢驗參數為1000[18]，并通過DNAMAN 軟件對各進化分支的NRT2/3 蛋白進行序列比對。利用在線分析網站 ProtParam （https：//www.expasy.org/） 對生菜NRT2/3 蛋白質序列進行分析，預測氨基酸長度、分子量、理論等電點 （pI）、總的親水性平均值等[19]。使用Cell-PLoc 2.0 （http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/） 對蛋白序列進行亞細胞定位預測。

1.2 生菜NRT2/3 蛋白功能結構域和保守基序分析

使用NCBI 中的Conserved Domain Database （CDD）對生菜NRT2/3 家族蛋白進行功能結構域分析。使用MEME （http：//meme-suite.org/） 對生菜NRT2/3 家族蛋白序列的保守基序進行分析，motif 數目設置為15[20]。最后，使用TBtools 軟件進行可視化作圖。

1.3 生菜NRT2/3 順式作用元件、基因結構分析和染色體定位

順式作用元件采用PlantCARE 在線軟件（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/） 進行預測分析。通過在線軟件GSDS 2.0 （http：//gsds.cbi.pku.edu.cn） 對生菜NRT2/3 家族基因組序列以及CDS 序列進行基因結構分析。從NCBI （https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/） 中下載生菜NRT2/3 基因在相關染色體的位置信息和染色體長度信息，并使用TBtools軟件進行可視化作圖。

1.4 生菜NRT2/3 蛋白的二級結構預測、親水性分析、磷酸化位點和跨膜區域預測

生菜NRT2/3 蛋白的二級結構使用SOPMA （https：//npsa.lyon.inserm.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=/NPSA/npsa_sopma.html） 預測，使用NovoPro （https：//novopro.cn/tools/） 對蛋白進行親水性分析，使用NetPhos3.1 （https：//services.healthtech.dtu.dk/services/NetPhos-3.1/） 對蛋白進行磷酸化位點預測，使用TMHMM 2.0（https：//services.healthtech.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/） 預測蛋白跨膜區域。

1.5 基因電子表達譜熱圖

本課題組前期研究發現，“意大利”和“綠雅”兩個生菜品種具有發芽率較高、生長較快、易種植等優點，因此，選用了這兩個生菜品種，并進行轉錄組測序。根據測序結果，從中提取目的基因表達數據，利用TBtools 對數據進行分析并繪制電子表達譜熱圖。選取表達量相對較高的NRT2/3 基因，進行表達分析和TRV-VIGS 瞬時沉默，驗證其功能。

1.6 生菜LsaNRT2/3 基因的表達分析、VIGS 載體的構建及瞬時轉化生菜

試驗于2024 年1—8 月在北京市農林科學院蔬菜研究中心 （116°29′E；39°94′N） 人工光型植物工廠水培系統和栽培樓的陽臺溫室中進行。以“意大利”和“綠雅”2 個生菜品種為試材。將海綿塊浸濕，放入塑料托盤，選取飽滿的種子于海綿塊中心圓孔，置于暗處催芽48 h，之后將生菜苗置于植物工廠栽培架育苗床上，光周期為14 h （光）/10 h （暗），溫度為25℃，營養液采用國家蔬菜工程技術研究中心研發的營養液[pH 值6.0±0.5；電導率（EC） 值1.9±0.1mS/cm][21]。在育苗第20 天，選取長勢一致的生菜苗并將其定植于草炭∶蛭石=1∶5 的培養基質中，在陽臺溫室 （25℃） 進行試驗。試驗設置4 個不同濃度NO3?澆灌處理：0、0.35、0.7 和11.5 mmol/L，其中11.5 mmol/L 為正常Hoagland 營養液的NO3?濃度。NO3?濃度用Ca（NO3 ）2 進行調整，并通過CaCl2 補充缺失的Ca2 +，其它組分與Hoagland 營養液配方一致，每3 天補充1 次營養液，處理依次記為N0、N0.35、N0.7、N11.5。分別在NO3?處理后的第0、3、6、9 天，取生菜相同部位的根尖和葉片并立即浸入液氮中，在?80℃ 下保存，用于RNA 提取和cDNA合成，每個處理3 次重復。

同時，在植物工廠育苗10 天后，根據VIGS 沉默載體構建要求，避開保守區域，選取長度約為300bp 的特異性片段作為VIGS 沉默片段，構建pTRV2-LsaNRT2/3 重組質粒。將含有pTRV2 空載質粒、pTRV2-LsaNRT2/3 重組質粒的GV3101 菌液分別與含有pTRV1 的GV3101 菌液等比例混合，黑暗中活化3 h 后采用子葉注射法轉化生菜，空白對照組（CK） 僅注射蒸餾水[22]。25℃ 暗培養24 h 后，定植于植物工廠內的同一層水培架中，培養20 天，營養液采用國家蔬菜工程技術研究中心研發的營養液（pH 值6.0±0.5；EC 值2.0±0.2 mS/cm；NO3?濃度約為11 mmol/L），光周期為14 h （光）/10 h （暗）。

1.7 TRV 病毒的分子檢測與qRT-PCR 檢測

為了驗證煙草脆裂病毒是否成功侵染生菜葉片基因組并表達，在侵染后的第21 天，分別提取CK、空載TRV：：00、TRV：：NRT2/3 侵染植株新生葉片（內葉和中葉） 樣品的總RNA，并反轉錄成cDNA。通過PCR （反應體系：cDNA 2 μL，正、反向引物各1.5 μL，2×A8 PCR Mix 25 μL，ddH2O 20 μL。反應程序：95℃ 預變性3 min；95℃ 變性10 s，55℃ 退火15 s，72℃ 延伸20 s，35 個循環；72℃ 延伸5 min）擴增，其產物經1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測。通過qRTPCR檢測不同濃度NO3?處理及沉默后LsaNRT2/3 表達水平，反應體系為：SYBR Green Mix （2×） 10.0 μL，上下游引物各0.5 μL，cDNA 2.0 μL，補足ddH2O 至20.0 μL。qRT-PCR 反應程序：95.0℃ 3 min，95.0℃10 s，56.0℃ 10 s，72.0℃ 30 s，44 個循環。試驗設置3 個生物學重復，選用18S 核糖體RNA 為內參基因，以0 mmol/L NO3?處理第0 天的根和葉作為對照，采用2?ΔΔCt 法計算基因相對表達量[23]。本研究中涉及到的引物序列見表1。

1.8 生菜生長指標和葉片葉綠素及硝酸鹽含量測定

在侵染后的第21 天，用直尺測量生菜的株高、葉長和葉寬；采用乙醇浸提比色法[24]測定生菜葉片葉綠素含量；采用水楊酸法[25]測定生菜葉片硝酸鹽含量。同時，取生菜的幼嫩葉片 （內葉和中葉），進行表型觀察并拍照。試驗設置3 個生物學重復。

1.9 數據統計分析

使用PASW Statistics 18 （SPSS 18） 以LSD 和Waller-Duncan 法進行多重比較，檢驗數據差異顯著性；使用EXCEL 2016 軟件分析試驗數據并進行圖表繪制。顯著性分析中的不同字母表示不同處理間差異顯著 （Plt;0.05）。

2 結果與分析

2.1 生菜NRT2/3 家族成員信息和系統進化關系

利用M E G A 1 1 軟件對生菜、水稻和擬南芥NRT2/3 蛋白的全長序列進行比對，同時構建系統發育樹。NRT2/3 蛋白家族可分為4 個保守的進化分支（I～IV），其中分支I 是3 個物種中數量最多的一類NRT2/3 （圖1）。DNAMAN 多序列比對發現，生菜和擬南芥NRT2/3 蛋白在不同進化分支中具有高度的保守性，大約在45%～78% （圖2），推測可能具有相似的功能。

ProtParam 分析 （表2） 表明，生菜NRT2/3 家族成員分子量在23188.64 Da （LsaNRT3.1）～57534.09Da （LsaNRT2.4），平均分子量51496.14 Da，平均氨基酸數目為473.63；理論等電點在8.45 （LsaNRT2.7）～9.19 （LsaNRT2.6），平均理論等電點為8.90，均為堿性蛋白 （pIgt;7）；總平均親水性在?0.257 （LsaNRT3.1）～0.582 （LsaNRT2.7），均值為0.34；不穩定系數在31.70 （LsaNRT2.3）～41.82 （LsaNRT2.2），平均不穩定系數為36.86；生菜NRT 家族蛋白主要定位在細胞膜上，以上結果與NRT2/3 家族共有的特征基本相符[10?14]。

2.2 生菜NRT2/3 蛋白功能結構域和保守基序

生菜NRT2/3 蛋白功能結構域分析顯示，所有LsaNRT2 蛋白均含有PLN00028 （Nitrate transmembranetransporter） 結構域，而LsaNRT3.1 蛋白含有NAR2結構域 （圖3）。生菜NRT2/3 蛋白保守基序分析顯示，7 個NRT2 蛋白均含有MFS （G-x-x-x-D-xx-G-x-R） 序列 （motif7） 和NNP （A-G-W/L-G-N-M/A-G） 序列（motif3）。LsaNRT3.1 蛋白只存在motif15，而L s a N R T 2 . 1、L s a N R T 2 . 2 和L s a N R T 2 . 4 缺失motif15，LsaNRT2.3 和LsaNRT2.6 缺失motif10，L s a N R T 2 . 5 缺失m o t i f 1 0、m o t i f 1 2 - m o t i f 1 5，LsaNRT2.7 缺失motif5、motif10、motif12-motif15（圖4）。推測可能是在進化過程中NRT 功能分化，從而導致了生菜NRT2/3 成員保守基序組成的差異。

2.3 生菜NRT2/3 順式作用元件、基因結構和染色體定位

為確定生菜NRT2/3 基因啟動子區域中的順式作用元件，本研究提取了生菜NRT2/3 基因家族成員上游2000 bp 啟動子序列，使用PlantCare 數據庫進行了順式作用元件預測。結果發現，生菜NRT2/3 基因家族均含有較多的光響應元件，3 個NRT2/3 基因含有水楊酸響應元件，4 個NRT2/3 基因含有干旱誘導和低溫響應元件，5 個NRT2/3 基因含有厭氧誘導元件、茉莉酸甲酯和生長素響應元件，6 個NRT2/3 基因含有脫落酸和赤霉素響應元件 （圖5）。因此，上述結果表明，生菜NRT2/3 基因家族能夠響應多種激素或環境信號，參與相關的調控及生理過程。

利用在線軟件GSDS 2.0 繪制生菜NRT2/3 家族基因結構，結果表明生菜NRT2/3 基因家族成員之間的外顯子數量差異較小，LsaNRT2.1、LsaNRT2.2、LsaNRT2.3 和LsaNRT2.6 均含有3 個外顯子，LsaNRT2.4、LsaNRT2.5、LsaNRT2.7 和LsaNRT3.1 均含有2 個外顯子。同一分支上的成員外顯子―內含子數目和位置方面差異較小 （圖6）。

本研究將8 個NRT2/3 基因定位到生菜染色體上，發現它們不均勻分布在4 條染色體上，其中1號染色體包含最多的NRT2/3 家族基因 （4 個），其次是4 號染色體包含2 個生菜NRT2/3 基因，2 號和6號染色體上均包含1 個生菜NRT2/3 基因。此外，1號染色體上LsaNRT2.1、LsaNRT2.2、LsaNRT2.3 和LsaNRT2.6 位置十分接近 （圖7），表明它們可能是通過片段復制產生的同源基因。

2.4 生菜NRT2/3 蛋白二級結構和親水性

SOPMA 預測了生菜NRT2/3 的蛋白質二級結構，結果顯示，生菜N R T 2 / 3 蛋白含有2 3 . 0 4 %（LsaNRT3.1）～58.07% （LsaNRT2.7） 的α-螺旋，7.55%（LsaNRT2.2）～27.94% （LsaNRT3.1） 的延伸鏈，1.13%（LsaNRT2.1）～3.36% （LsaNRT2.7） 的β-轉角和28.48% （LsaNRT2.7）～46.08% （LsaNRT3.1） 的不規則卷曲 （圖8）。

通過ProtParam 和NovoPro 分析了生菜NRT2/3的蛋白質親水性，結果表明LsaNRT3.1 總平均親水性為?0.257 （lt;0），說明它是一種親水性蛋白，其最大疏水性值為2.9 （183 位點），最小疏水性值為?3.3（111 位點）。其它生菜NRT2/3 蛋白總平均親水性均大于0，表明它們是疏水性蛋白，其中最大疏水性值為3.4，位于LsaNRT2.6 的228 位點，最小疏水性值為?3.4，位于LsaNRT2.5 的9 位點 （表2，圖9）。

2.5 生菜NRT2/3 蛋白磷酸化位點和跨膜區域

NetPhos 3.1 預測結果表明，生菜NRT2/3 的磷酸化位點中，絲氨酸殘基的占比最大，約為50.0%（LsaNRT2.6）～66.7% （LsaNRT3.1），酪氨酸殘基的占比最小，約為6.3% （LsaNRT2.5）～16.0% （LsaNRT2.6），蘇氨酸殘基的占比約為20.8% （LsaNRT3.1）～35.85%（LsaNRT2.2） （圖10）。由此推測，生菜NRT2/3 主要由絲氨酸和其他氨基酸作為輔助因子，完成磷酸化并調節生物功能。

利用TMHMM 2.0 預測，結果表明LsaNRT3.1蛋白存在1 個跨膜區域，共有24.32 個氨基酸位于跨膜區域，LsaNRT2.1 和LsaNRT2.2 蛋白均存在10 個跨膜區域，位于跨膜區域的氨基酸分別有240.59和240.28 個，其它5 個生菜NRT2/3 蛋白均存在11個跨膜區域，位于跨膜區域的氨基酸數目為241.55（LsaNRT2.7）～251.59 （LsaNRT2.5） 個 （圖11）。

2.6 生菜NRT2/3 基因的表達分析

根據本課題組前期轉錄組測序結果，從中提取目的基因表達數據，利用TBtools 對數據進行分析并繪制電子表達譜熱圖，結果發現，兩個品種生菜的LsaNRT2.4 和LsaNRT3.1 基因在葉片中的表達水平相對較高 （圖12）。因此，本研究選擇了這兩個基因進行表達分析及TRV-VIGS 瞬時沉默，驗證其功能。

qRT-PCR 分析結果表明，兩個品種生菜不同部位LsaNRT2.4 和LsaNRT3.1 基因表達對NO3?處理濃度的響應有差異 （圖13）。對于意大利生菜，根部LsaNRT2.4 表達量在N0 和N0.7 處理下，隨處理天數的增加而顯著上調，但N0.7 處理的LsaNRT2.4 上調幅度小于N0，N11.5 處理的LsaNRT2.4 表達水平在第0 天、第3 天和第6 天之間無顯著差異，而N0.35 處理的LsaNRT2.4 表達水平在第3 天達到峰值， 然后隨處理天數增加而顯著下調； 葉部LsaNRT2.4 表達水平在4 個NO3?濃度處理下的前6 天均很低，第9 天除N0.7 外，依然很低；根部LsaNRT3.1 表達水平在N0 和N11.5 處理下，隨處理天數的延長而上調， N 0 . 3 5 和N 0 . 7 處理的L s a N R T 3 . 1 表達水平在第3 天達到峰值；葉部LsaNRT3.1 表達水平在N0.35 和N11.5 處理下的前9 天均很低，而在N0 和N0.7 處理下的第6 天和第9 天均很高。對于綠雅生菜，根部LsaNRT2.4 表達水平在N0 和N0.35 處理下的第3 天達到峰值，然后隨處理天數延長而顯著下調，在N0.7 和N11.5 處理下的前9 天，L s a N R T 2 . 4 表達水平均很低；葉部LsaNRT2.4 表達水平也在N0 和N0.35 處理下的第3 天達到峰值，N0.7 處理下的表達水平在前6 天很低，在第9 天顯著上調，而N11.5處理下的表達水平在前9 天均很低；根部LsaNRT3.1表達水平在N0 和N0.35 處理下的第3 天達到峰值，然后隨處理天數增加而下調；葉部L s a N R T 3 . 1 表達水平均在4 個N O 3?濃度處理下的第6 天達到峰值， 其中N 0、N0.35 和N0.7 處理的基因表達變化幅度較大。由此可見， 意大利和綠雅生菜根部L s a N R T 2 . 4 和LsaNRT3.1 基因能夠在缺氮3 天內即可調整表達量，尤其是對非絕對缺氮的0.35 mmol/L 水平下響應低濃度NO3?。兩個品種生菜的 LsaNRT2.4 和 LsaNRT3.1的 cDNA 及蛋白序列見圖14。

2.7 pTRV2-LsaNRT2/3 載體的構建及TRV 病毒侵染的分子檢測

本研究克隆LsaNRT2.4 和LsaNRT3.1 沉默片段，將片段回收后，與經Xba I 和Kpn I 雙酶切后的線性化pTRV2 載體連接，構建pTRV2-LsaNRT2.4和pTRV2-LsaNRT3.1 載體并通過EcoR I 和Xho I 雙酶切鑒定及測序 （圖15）。測序結果完全正確。

為驗證TRV 病毒是否成功插入生菜葉片基因組并表達，在侵染后的第21 天，分別檢測了CK、空載TRV：：00、TRV：：NRT2.4 和TRV：：NRT3.1 侵染后的植株新生葉片TRV 病毒。結果表明，CK 無條帶，空載處理 （TRV：： 00）、TRV：： NRT2.4 和TRV：：NRT3.1 均出現了相應的條帶 （圖16），TRV 病毒成功侵染到植株中。

2.8 VIGS 沉默后的生菜葉片硝酸鹽含量

qRT-PCR 結果 （圖17） 表明，VIGS 沉默后的生菜LsaNRT2.4 和LsaNRT3.1 表達量均顯著下降，其中，意大利生菜的LsaNRT2.4 和LsaNRT3.1 表達量分別為空載處理 （TRV：： 00） 的52% 和48%，綠雅生菜的LsaNRT2.4 和LsaNRT3.1 表達量分別為空載處理 （TRV：： 00） 的66% 和36%。同時，兩個生菜品種的葉片硝酸鹽含量也顯著降低，其中意大利生菜葉片的硝酸鹽含量比空載處理 （TRV：： 00） 的硝酸鹽含量分別降低了20.61% （TRV：： LsaNRT3.1） 和0.55%（TRV：： LsaNRT2.4），綠雅生菜葉片的硝酸鹽含量比空載處理 （TRV：： 00） 分別降低了22.27% （TRV：：LsaNRT3.1） 和13.22% （TRV：： LsaNRT2.4）。

2.9 VIGS 沉默LsaNRT2.4 和LsaNRT3.1 對生菜生長和葉綠素含量的影響

由表3、圖18 和圖19 可知，沉默LsaNRT2.4和LsaNRT3.1 均顯著抑制了兩個生菜品種的生長，出現了葉片小、葉片尖端干枯等癥狀，與植物缺氮時所表現的部分癥狀[26]相似，其中，意大利品種生菜的株高、葉長、葉寬分別比CK 處理降低了37.64%～39.95%、30.28%～34.38%、29.92%～34.47%，綠雅品種生菜的株高、葉長、葉寬分別比CK 降低了37.42%～37.86%、38.5%～41.06%、7.52%～24.15%。由表4 可知，分別沉默LsaNRT2.4 和LsaNRT3.1 在一定程度上降低了生菜葉綠素a 的含量。

3 討論

氮素是限制植物生長和形成產量的首要因素[27]。在生菜幼苗階段，氮素缺乏會減弱其生長發育，影響總生物量的積累，并最終造成減產[28]。硝酸鹽是旱地植物獲取氮素的主要來源[29]。為了高效地從土壤中吸收硝酸鹽，植物進化出不同功能的NRT 基因，主要有NRT1、NRT2、NRT3 等[30?31]，NRT1 屬于低親和轉運蛋白，NRT2 屬于高親和轉運蛋白，NRT3 通過協助NRT2 參與高親和力硝酸鹽轉運[32?33]。本研究通過生物信息學手段共鑒定出了8 個生菜NRT2/3 家族成員，它們不均勻分布在4 條染色體上，其大多數特征 （蛋白理化性質、功能結構域、跨膜區域、磷酸化位點、順式作用元件和基因結構等） 與很多植物NRT2/3 家族共有的結構特征基本相符[11， 29， 33]。通過不同濃度NO3?處理下的基因表達模式分析和利用TRVVIGS技術，初步驗證了LsaNRT2.4 和LsaNRT3.1 基因在低氮或缺氮條件下發揮重要作用。

3.1 LsaNRT2.4 在生菜對硝酸鹽的吸收過程中起著重要作用

NRT2 是典型的跨膜轉運蛋白，具有6～12 個跨膜區[34]，當環境中硝酸鹽濃度低時，植物從外界環境吸收硝酸鹽主要是NRT2 在發揮作用[35]。在擬南芥中，NRT2.1 和NRT2.2 在低氮條件下的表達量會迅速增加，NRT2.4 和NRT2.5 則在缺氮條件下發揮功能[36?37]。缺氮條件下，擬南芥NRT2 成員中AtNRT2.4基因的表達量是最高的，氮充足會抑制它的表達[38]。長時間缺氮條件下，擬南芥AtNRT2.5 基因的表達量迅速增加，比AtNRT2.1 和AtNRT2.2 表達水平高[10， 39]。在爪蟾 （Xenopus laevis） 卵母細胞中的試驗結果顯示，Atnrt-2.4 突變體在氮匱乏條件下氮吸收減少且地上部的氮含量也明顯下降，在AtNRT2.1 及AtNRT2.2雙突變的基礎上突變AtNRT2.4 （三重突變體） 后，因根部硝酸根內流減少，對低氮下擬南芥地上部的生物量產生更顯著的影響[38]。水稻中的OsNRT2.1和OsNRT2.2 對硝酸鹽的親和力高于OsNRT2.3 和OsNRT2.4[40]。

NRT2 作為NO3?-NO2?共轉運蛋白 （nitrate/nitriteporter， NNP） 家族，在結構上屬于主要協同轉運蛋白超家族 （major facilitator superfamily， MFS）[41]。本試驗對生菜、水稻和擬南芥NRT2/3 蛋白的全長序列進行比對，同時構建系統發育樹，發現生菜LsaNRT2.4與擬南芥AtNRT2.1-AtNRT2.4、AtNRT2.6 和水稻OsNRT2.1、OsNRT2.2 位于同一個保守的進化分支中，可能具有相似的功能。通過對生菜NRT2/3 蛋白功能結構域和保守基序分析，發現7 個NRT2 蛋白均含有MFS （G-x-x-x-D-xx-G-x-R） 序列 （motif7） 和NNP （A-G-W/L-G-N-M/A-G） 序列 （motif3），符合NRT2 家族共有的結構特征。通過不同濃度NO3?處理生菜，發現根部和葉片LsaNRT2.4 均在低濃度NO3?下上調表達水平，與草地早熟禾[11]、擬南芥[38]和水稻[40]中的研究結果基本相符。利用TRV-VIGS 技術沉默生菜LsaNRT2.4 可顯著降低其葉片中的硝酸鹽含量，抑制生菜的生長及降低其葉片的葉綠素a含量。由此可以看出，LsaNRT2.4 在生菜對硝酸鹽的吸收過程中起著重要作用，需要通過擬南芥異源超表達、利用擬南芥相關突變體的遺傳互補分析等試驗進行多方面的驗證。

3.2 LsaNRT3.1 可能與LsaNRT2.4 共同調控生菜對硝酸鹽的吸收，從而影響其生長

NAR2 是高親和力硝酸鹽攝取的必需輔助蛋白，部分NRT2 的活性受NAR2 的協同調控[42]。本研究通過對生菜NRT2/3 蛋白功能結構域和保守基序分析，發現LsaNRT3.1 含有NAR2 結構域，且只存在motif15，通過對生菜NRT2/3 蛋白跨膜區域預測，發現LsaNRT3.1 蛋白只存在1 個跨膜區域，而NRT2蛋白均存在10～11 個跨膜區域，由此推測LsaNRT3.1自身可能不具備吸收硝酸鹽的能力，而是輔助生菜NRT2 吸收硝酸鹽，motif15 則與該功能密切相關。

研究表明，擬南芥AtNRT3 本身不具備轉運功能，通過與AtNRT2 協作發揮功能，例如，AtNRT2.1-2.6 需要與AtNRT3.1 協作進行硝酸鹽吸收[ 4 3 ? 4 4 ]。Atnrt3.1 突變體表現出生長抑制和氮素吸收減少，與Atnrt2.1/2.2 突變體相比，Atnrt3.1 突變體具有更強的表型效應[45?46]。在氮饑餓條件下表達石竹DsNRT3.1的轉化擬南芥幼苗比野生型具有更長的根和更大的鮮重，且硝酸鹽的吸收能力強于野生型幼苗，由此可見，DsNRT3.1 的異源表達通過增強氮饑餓擬南芥中硝酸鹽的吸收來影響幼苗的生長[47]。此外，水稻和菊花中的NRT2 與NRT3 也存在互作，共同調控硝酸鹽的高親和轉運[48?49]，與擬南芥相似。酵母雙雜交試驗表明，OsNRT3.1 與OsNRT2.1-2.3 存在互作關系，OsNRT2.1-2.3 需要與OsNRT3.1 協作以完成硝酸鹽的吸收，敲除OsNRT3.1 極大降低其硝酸鹽的吸收能力[50?51]。本試驗通過不同濃度NO3?處理生菜，發現根部和葉片LsaNRT3.1 能夠在低濃度NO3?下上調表達水平。利用TRV-VIGS 沉默生菜LsaNRT3.1 可顯著降低其葉片中的硝酸鹽含量，且沉默生菜LsaNRT3.1后的硝酸鹽含量顯著低于沉默生菜LsaNRT2.4 后的硝酸鹽含量。大量研究表明，植物常見的缺氮癥狀包括營養生長受阻、葉片變黃、葉片狹窄和生物量下降等[52]。徐夢莎等[53]研究發現，缺氮可導致仁用杏葉片邊緣出現焦黃，并抑制其地上部生長；穆俊祥等[54]研究發現，缺氮可導致番茄植株矮小、瘦弱、葉小色淡，地上部分受影響嚴重。本試驗在TRV-VIGS分別沉默生菜LsaNRT2.4 和LsaNRT3.1 基因后，其葉片硝酸鹽含量不僅顯著降低，其生長也受到了抑制，表現為葉片小、葉片尖端干枯等癥狀，其中沉默LsaNRT3.1 后的生菜具有更明顯的表型效應。由此可以推測，生菜LsaNRT3.1 可能通過輔助LsaNRT2.4吸收基質中的硝酸鹽，從而影響生菜生長，有待通過酵母雙雜交、免疫共沉淀等試驗進一步驗證。

4 結論

本研究通過生物信息學手段共鑒定出了8 個生菜NRT2/3 家族成員，它們不均勻分布在4 條染色體上，其蛋白理化性質、功能結構域、跨膜區域、磷酸化位點、順式作用元件和基因結構等特征符合多數植物NRT2/3 家族共有的特征。前期轉錄組測序結果顯示，LsaNRT2.4 和LsaNRT3.1 基因在葉片中的表達量明顯高于其他6 個基因。通過基因的表達模式分析和TRV-VIGS 技術，初步驗證了低氮或缺氮條件可誘導LsaNRT2.4 和LsaNRT3.1 基因的表達，尤其缺氮條件顯著增加LsaNRT2.4 基因在根部的表達，提高生菜的氮素吸收和生長。

參 考 文 獻：

[ 1 ]Han Y Y， Fan S X， Zhang Q， Wang Y N. Effect of heat stress on the MDA， proline and soluble sugar content in leaf lettuce seedlings[J].Agricultural Sciences， 2013， 4（5B）： 112?115.

[ 2 ]Lu Y M， Bai X F， Zheng S L， et al. Genetic variation and phylogenetic relationship among different leaf lettuce （Lactuca sativa L.） varieties in Korea[J]. Pakistan Journal of Botany， 2021， 53（3）： 975?979.

[ 3 ]許夢男， 郝新迪， 陳麗， 韓瑩琰. 病毒誘導基因沉默對葉用萵苣內源激素含量的影響[J]. 北京農學院學報， 2021， 36（4）： 35?38.

Xu M N， Hao X D， Chen L， Han Y Y. Effects of virus induced gene silencing on endogenous hormone content of lettuce[J]. Journal of Beijing University of Agriculture， 2021， 36（4）： 35?38.

[ 4 ]楊曉， 余志， 高麗偉， 黃丹楓. 葉用萵苣抗氧化物及其生物活性研究進展[J]. 中國蔬菜， 2015， （2）： 17?24.

Yang X， Yu Z， Gao L W， Huang D F. Research progress of antioxidants and its bioactivity in lettuces[J]. China Vegetables，2015， （2）： 17?24.

[ 5 ]李冠男， 郭奇梅， 高峰， 等. 植物工廠項目建設的價值及關鍵技術和創新探究[J]. 現代園藝， 2021， 44（4）： 193?194.

Li G N， Guo Q M， Gao F， et al. The value and key technology and innovation exploration of plant factory project construction[J].Modern Horticulture， 2021， 44（4）： 193?194.

[ 6 ]滕巍， 馬藝蕎， 馬燕， 等. 植物工廠水培生菜的栽培環境研究進展[J]. 黑龍江農業科學， 2018， （5）： 156?158.

Teng W， Ma Y Q， Ma Y， et al. Research progress on the cultivation environment of hydroponic lettuce in plant growing factory[J].Heilongjiang Agricultural Sciences， 2018， （5）： 156?158.

[ 7 ]李詩奇， 李政， 王仙寧， 張沛東. 植物對氮磷元素吸收利用的生理生態學過程研究進展[J]. 山東農業科學， 2019， 51（3）： 151?157.

Li S Q， Li Z， Wang X N， Zhang P D. Advances in research of physiological and ecological process of nitrogen and phosphorus absorption and utilization in plant[J]. Shandong Agricultural Sciences， 2019， 51（3）： 151?157.

[ 8 ]王平， 陳舉林. 植物氮素吸收過程研究進展[J]. 安徽農業科學，2016， 44（1）： 33?35.

Wang P， Chen J L. Research progress on nitrogen absorption in plant[J]. Journal of Anhui Agricultural Science， 2016， 44（1）： 33?35.

[ 9 ]史云勇. 梨硝酸鹽轉運蛋白NRT2基因家族分析及PbrNRT2.1功能驗證[D]. 江蘇淮安： 淮陰工程學院碩士學位論文， 2023.

Shi Y Y. Analysis of the NRT2 gene family of pear nitrate turnaround protein and functional verification of PbrNRT2.1[D]. Huai’an，Jiangsu： MS Thesis of Huaiyin Institute of Technology， 2023.

[10]Lezhneva L， Kiba T， Bourrellier A B F， et al. The Arabidopsis nitrate transporter NRT2.5 plays a role in nitrate acquisition and remobilization in nitrogen-starved plants[J]. Plant Journal， 2014， 80： 230?241.

[11]陳陽， 金一峰， 金忠民， 等. 草地早熟禾硝酸鹽轉運蛋白NRT2.4基因序列的克隆及表達分析[J]. 華北農學報， 2021， 36（2）： 1?8.

Chen Y， Jin Y F， Jin Z M， et al. Cloning and expression analysis of NRT2.4 gene in Kentucky bluegrass[J]. Acta Agriculturae Boreali-Sinica， 2021， 36（2）： 1?8.

[12]Mao P J， Run Y H， Wang H H， et al. Genome-wide identification and functional characterization of the chloride channel TaCLC gene family in wheat （Triticum aestivum L.）[J]. Frontiers in Genetics，2022， 13： 846795.

[13]Nacry P， Bouguyon E， Gojon A. Nitrogen acquisition by roots： Physiological and developmental mechanisms ensuring plant adaptation to a fluctuating resource[J]. Plant and Soil， 2013， 370：1?29.

[14]艾偉偉， 魏淑紅. 小麥氮素吸收利用的調控機制研究進展[J]. 植物生理學報， 2024， 60（5）： 784?798.

Ai W W， Wei S H. Research advance on the regulation mechanisms of nitrogen uptake and utilization in wheat[J]. Plant Physiology Journal， 2024， 60（5）： 784?798.

[15]Deng N， Wang H L， Hu S， Jiao J Y. Effects of afforestation restoration on soil potential N2O emission and denitrifying bacteria after farmland abandonment in the Chinese loess plateau[J]. Frontiers in Microbiology， 2019， 10（1）： 262?271.

[16]Miller A J， Cramer M D. Root nitrogen acquisition and assimilation [J]. Plant and Soil， 2005， 274（2）： 1?36.

[17]張苗苗， 王伯仁， 李冬初， 等. 長期施加氮肥及氧化鈣調節對酸性土壤硝化作用及氨氧化微生物的影響[J]. 生態學報， 2015， 35（19）：6362?6370.

Zhang M M， Wang B R， Li D C， et al. Effects of long-term N fertilizer application and liming on nitrification and ammonia oxidizers in acidic soils[J]. Acta Ecologica Sinica， 2015， 35（19）：6362?6370.

[18]殷小雨， 何國仁， 畢蒙蒙， 等. 卷丹側生器官邊界域基因LlLBD18的克隆和功能分析[J]. 園藝學報， 2023， 50（10）： 2117?2127.

Yin X Y， He G R， Bi M M， et al. Cloning and functional analysis of LlLBD18 in Lilium lancifolium[J]. Acta Horticulturae Sinica， 2023，50（10）： 2117?2127.

[19]Panu A， Manohar J， Konstantin A， et al. ExPASy： SIB bioinformatics resource portal[J]. Nucleic Acids Research， 2012， 40（W1）： 597?603.

[20]Bailey T L， Williams N， Misleh C， Li W W. MEME： Discovering and analyzing DNA and protein sequence motifs[J]. Nucleic Acids Research， 2006， 34（2）： 369?373.

[21]姜岳叢， 佟靜， 王麗萍. 氯化鈣溶液對植物工廠生菜品質及干燒心病情的影響[J]. 北方園藝， 2023， （5）： 46?52.

Jiang Y C， Tong J， Wang L P. Effects of foliar spraying calcium chloride on quality and heartburn of lettuce in factory[J]. Northern Horticulture， 2023， （5）： 46?52.

[22]任政， 薛婉瑩， 鄒小麗， 等. VIGS技術分析ARF6基因對葉用萵苣高溫抽薹的影響[J]. 分子植物育種， 1?10. [2024-10-21]. http：//kns.

cnki.net/kcms/detail/46.1068.S.20230517.1128.020.html. Ren Z， Xue W Y， Zou X L， et al. Analysis of the effect of ARF6 gene on high temperature bolting of leaf lettuce by VIGS technique[J].Molecular Plant Breeding， 1?10. [2024-10-21]. http：//kns.cnki.net/ kcms/detail/46.1068.S.20230517.1128.020.html.

[23]魏群. 分子生物學實驗指導 （第4版）[M]. 北京： 高等教育出版社，2021.

Wei Q. Laboratory manual for molecular biology （fourth edition）[M]. Beijing： Higher Education Press， 2021.

[24]Arnon D L. Copper enzymes in isolated chloroplasts， polyphenol oxidase in Brta vulgaris[J]. Plant Phsiology， 1949， 24： 1?15.

[25]李合生. 植物生理生化實驗原理和技術[M]. 北京： 高等教育出版社， 2000.

Li H S. Principles and techniques of plant physiological and biochemical experiments[M]. Beijing： Higher Education Press，2000.

[26]張俊伶. 植物營養學[M]. 北京： 中國農業大學出版社， 2021.

Zhang J L. Plant nutrition[M]. Beijing： China Agricultural University Press， 2021.

[27]于晟玥， 牛銀星， 王澤平， 等. 黃腐酸添加量對低氮脅迫下小麥生長和根系形態的影響[J]. 植物營養與肥料學報， 2023， 29（2）： 323?333.

Yu S Y， Niu Y X， Wang Z P， et al. Effects of fulvic acid addition rate on wheat growth and root morphology under low nitrogen stress[J].Journal of Plant Nutrition and Fertilizers， 2023， 29（2）： 323?333.

[28] Zhang H J， Dong H Z， Li W J， Zhang D M. Effects of soil salinity and plant density on yield and leaf senescence of field-grown cotton[J]. Journal of Agronomy and Crop Science， 2012， 198（1）：27?37.

[29]劉文平， 梁烜赫， 張春宵， 等. 植物氮素利用途徑中硝酸鹽轉運基因的研究進展[J]. 中國土壤與肥料， 2022， （7）： 238?246.

Liu W P， Liang X H， Zhang C X， et al. Research progress of gene encoding nitrate transports involved in nitrogen use pathway in plants[J]. Soil and Fertilizer Sciences in China， 2022， （7）： 238?246.

[30]Parker J L， Newstead S. Molecular basis of nitrate uptake by the plant nitrate transporter NRT1.1[J]. Nature， 2014， 507： 68?72.

[31]郭志強， 梁月秀， 馮凡， 等. 高粱全基因組NRT1基因鑒定、表達與DNA變異分析[J]. 激光生物學報， 2021， 30（5）： 459?467.

Guo Z Q， Liang Y X， Feng F， et al. Genome-wide identification of NRT1 gene， expression profiling and DNA variation analysis in Sorghum[J]. Acta Laser Biology Sinica， 2021， 30（5）： 459?467.

[32]Okamoto M， Vidmar J J， Glass A D M. Regulation of NRT1 and NRT2 gene families of Arabidopsis thaliana： Responses to nitrate provision[J]. Plant amp; Cell Physiology， 2003， 44（3）： 304?317.

[33]Wang Y Y， Hsu P K， Tsay Y F. Uptake， allocation and signaling of nitrate[J]. Trends in Plant Science， 2012， 17（8）： 458?467.

[34]李晨依， 朱紫童， 湛佳偉， 等. 煙草高親和硝酸鹽轉運蛋白基因NtNRT2.5的克隆及表達模式分析[J]. 中國煙草學報， 2024， 30（2）：71?79.

Li C Y， Zhu Z T， Zhan J W， et al. Cloning and expression pattern analysis of tobacco high affinity nitrate transporter gene NtNRT2.5[J].Acta Tabacaria Sinica， 2024， 30（2）： 71?79.

[35]Luo L， Zhang Y， Xu G. How does nitrogen shape plant architecture？[J]. Journal of Experimental Botany， 2020， 71（15）： 4415?4427.

[36]Liu R R， Jia T， Cui B， Song J. The expression patterns and putative function of nitrate transporter 2.5 in plants[J]. Plant Signaling amp; Behavior， 2020， 12（15）： 1815980.

[37]Jacquot A， Chaput V， Mauries A， et al. NRT2.1 C-terminus phosphorylation prevents root high affinity nitrate uptake activity in Arabidopsis thaliana[J]. New Phytologist， 2020， 228（3）： 802?804.

[38]Kiba T， Feria-Bourrellier A B， Lafouge F， et al. The Arabidopsis nitrate transporter NRT2.4 plays a double role in roots and shoots of nitrogen-starved plants[J]. Plant Cell， 2012， 24（1）： 245?258.

[39]Kotur Z， Glass A D. A 150 KDa plasma membrane complex of AtNRT2.5 and AtNRT2.1 is the major contributor to constitutive high-affinity nitrate influx in Arabidopsis thaliana[J]. Plant Cell， and Environment， 2015， 38（8）： 1490?1502.

[40]黃慧梅， 高永康， 臺玉瑩， 等. 硝酸鹽轉運蛋白NRT2在植物中的功能及分子機制研究進展[J]. 植物學報， 2023， 58（5）： 783?798.

Huang H M， Gao Y K， Tai Y Y， et al. Research advances in elucidating the function and molecular mechanism of the nitrate transporter 2 （NRT2） proteins in plants[J]. Chinese Bulletin ofBotany， 2023， 58（5）： 783?798.

[41]Forde B G. Nitrate transporters in plants： Structure， function and regulation[J]. Biochimica et Biophysica Acta， 2000， 1465（1/2）：219?235.

[42]趙姍姍， 郭志強， 朱立勛， 等. 高粱高親和硝酸鹽轉運蛋白NRT2/3基因家族鑒定、表達與DNA變異分析[J]. 生物工程學報，2023， 39（7）： 2743?2761.

Zhao S S， Guo Z Q， Zhu L X， et al. Identification， expression and

[43]DNA variation analysis of high affinity nitrate transporter NRT2/3 gene family in Sorghum bicolor[J]. Chinese Journal of Biotechnology，2023， 39（7）： 2743?2761.Yong Z H， Kotur Z， Glass A D M. Characterization of an intact twocomponent high-affinity nitrate transporter from Arabidopsis roots[J].Plant Journal， 2010， 63（5）： 739?748.

[44]Kotur Z， Mackenzie N， Ramesh S， et al. Nitrate transport capacity of the Arabidopsis thaliana NRT2 family members and their interactions with AtNAR2.1[J]. The New Phytologist， 2012， 194（3）：724?731.

[45]Okamoto M， Kumar A， Li W B， et al. High-affinity nitrate transport in roots of Arabidopsis depends on expression of the NAR2-like gene AtNRT3.1[J]. Plant Physiology， 2006， 140（3）： 1036?1046.

[46]Orsel M， Chopin F， Leleu O， et al. Characterization of a twocomponent high-affinity nitrate uptake system in Arabidopsis. physiology and protein-protein interaction[J]. Plant Physiology， 2006，142（3）： 1304?1317.

[47]Ma H P， Zhao J C， Feng S， et al. Heterologous expression of nitrate assimilation related-protein DsNAR2.1/NRT3.1 affects uptake of nitrate and ammonium in nitrogen-starved Arabidopsis[J].International Journal of Molecular Sciences， 2020， 21（11）： 4027?4039.

[48]Gu C S， Zhang X X， Jiang J F， et al. Chrysanthemum CmNAR2 interacts with CmNRT2 in the control of nitrate uptake[J]. Scientific Reports， 2014， 4（1）： 5833.

[49]Yan M， Fan X R， Feng H M， et al. Rice OsNAR2.1 interacts with OsNRT2.1， OsNRT2.2 and OsNRT2.3a nitrate transporters to provide uptake over high and low concentration ranges[J]. Plant， Cellamp; Environment， 2011， 34（8）： 1360?1372.

[50]Feng H M， Yan M， Fan X R， et al. Spatial expression and regulation of rice high-affinity nitrate transporters by nitrogen and carbon status[J]. Journal of Experimental Botany， 2011， 62（7）： 2319?2332.

[51]Lima J E， Serezino L H D， Alves M K， et al. Root nitrate uptake in sugarcane （Saccharum spp.） is modulated by transcriptional and presumably posttranscriptional regulation of the NRT2.1/NRT3.1transport system[J]. Molecular Genetics and Genomics， 2022， 297（5）：1403?1421.

[52]黃偉韜. 缺氮對柑橘實生苗生長和生理特性的影響[D]. 福建福州：福建農林大學碩士學位論文， 2022.

Huang W T. Effects of nitrogen-deficiency on growth and physiological characteristics in Citrus seedlings[D]. Fuzhou， Fujian：MS Thesis of Fujian Agriculture and Forestry University， 2022.

[53]徐夢莎， 朱高浦， 付貴全， 等. 氮磷鉀缺乏對苗期仁用杏生長和養分 吸收的影響[J]. 西北農林科技大學學報 （自然科學版）， 2017， 45（5）：81?90.

Xu M S， Zhu G P， Fu G Q， et al. Effects of N， P， and K deficiency on growth and nutrient uptake of Prunus armeniaca seedlings[J]. Journal of Northwest A amp; F University （Natural Science Edition）， 2017，45（5）： 81?90.

[54]穆俊祥， 曹興明， 劉拴成. 氮、磷、鉀缺素培養對番茄幼苗生長的影響[J]. 北方園藝， 2015， （6）： 40?42.

Mu J X， Cao X M， Liu S C. Effect of N， P， K element deficiency on growth of tomato seedlings[J]. Northern Horticulture， 2015， （6）：40?42.