柳枝稷生長、生理和基因差異表達(dá)對(duì)供磷水平的響應(yīng)

摘要： 【目的】探究柳枝稷 （Panicum virgatum L.） 在不同磷水平下的生理代謝及轉(zhuǎn)錄水平變化，以解析柳枝稷磷響應(yīng)特征，挖掘磷高效利用基因。【方法】以‘Pathfinder’品種柳枝稷為供試材料，采用水培方法（Hoagland 營養(yǎng)液） 進(jìn)行培養(yǎng)試驗(yàn)。營養(yǎng)液設(shè)置4 個(gè)KH2PO4 供應(yīng)水平：20、100、200、500 μmol/L （分別記為P20、P100、P200、P500）。在生長箱中培養(yǎng)45 天后，取樣測(cè)定柳枝稷生長和根系表型指標(biāo)、抗逆酶活性，并進(jìn)行葉片和根系轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，分析不同磷水平下柳枝稷葉片和根系的響應(yīng)差異。最后，從糖酵解和苯丙素生物合成途徑挑選了部分基因進(jìn)行qRT-PCR 分析，以證實(shí)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的準(zhǔn)確性。【結(jié)果】隨著供磷水平的提高，葉片超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD） 和過氧化氫酶（CAT） 活性呈先降低后增加的趨勢(shì)；根系總長度、根系總面積和根系活力呈先增加后減少的趨勢(shì)；葉片和根系中酸性磷酸酶活性和磷含量呈先增加后減少的趨勢(shì)。不同供磷濃度下，葉片和根系中各磷處理共同表達(dá)差異表達(dá)基因（DEGs） 分別有1091、1762 個(gè)。GO 富集注釋顯示，葉片中DEGs 富集在離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、氧化還原酶上，根系則富集在特異DNA 序列結(jié)合、主動(dòng)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)和裂合酶上。兩器官共同富集的DEGs 主要定位于抗氧化酶、轉(zhuǎn)移酶、無機(jī)分子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白上。KEGG 富集分析發(fā)現(xiàn)，柳枝稷葉片和根系中共有9 個(gè)共同代謝通路，其中氨基糖和核苷糖代謝、糖酵解/糖異生、苯丙素生物合成、蔗糖和淀粉代謝通路DEGs 顯著富集，具體為：糖酵解和苯丙素生物合成途徑各有16 個(gè)DEGs，涉及磷吸收轉(zhuǎn)運(yùn)基因共20 個(gè)。糖酵解途徑中關(guān)鍵酶基因 （AE、PGM、HK、PFK），苯丙素生物合成途徑中關(guān)鍵酶基因 （PAL、CCR、CAD、C4H、4CL） 和磷吸收轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)控基因 （GPT2、PHT2;1、TPT、PPT1、PPT2、PPT3、PiC3、APC2）的差異化表達(dá)，引起柳枝稷葉片和根系對(duì)磷營養(yǎng)的代謝反應(yīng)差異。【結(jié)論】適當(dāng)提高供磷水平，可改善柳枝稷根系特征，降低葉片抗逆酶活性，提高葉片和根系中酸性磷酸酶活性，從而提高植株磷含量和干物質(zhì)量。此外，糖酵解、苯丙素生物合成和磷吸收轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的關(guān)鍵基因在葉片和根系中均表現(xiàn)出顯著差異表達(dá)。

關(guān)鍵詞： 供磷水平；柳枝稷；生理指標(biāo)；轉(zhuǎn)錄組；糖酵解；苯丙素生物合成；磷吸收轉(zhuǎn)運(yùn)

柳枝稷 （Panicum virgatum L.） 是一種多年生C4植物，原產(chǎn)于北美大草原，具有生長速度快、環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)、生物質(zhì)產(chǎn)量潛力高和投入需求相對(duì)較低的特點(diǎn)，被視為理想的生物能源作物和牧草作物[1?2]。磷是植物體內(nèi)蛋白質(zhì)、磷脂、脂肪酸、核苷酸和ATP 等重要有機(jī)物的組成元素，對(duì)于能量代謝、酶促反應(yīng)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等生命活動(dòng)至關(guān)重要[3]。因此，研究柳枝稷在不同供磷水平下的生理和分子調(diào)控機(jī)制，不僅可以為能源物質(zhì)生產(chǎn)和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)提供重要的資源，還有助于優(yōu)化磷素的循環(huán)和利用。

在供磷水平不足條件下，植物會(huì)表現(xiàn)出一系列適應(yīng)性變化，這些變化涉及表型、生理生化和分子層面，最終影響植株的生長。磷缺乏會(huì)抑制葉片代謝過程，導(dǎo)致活性氧 （ROS） 過度積累，從而損傷DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)[4]。為了抵抗ROS 的破壞，植物會(huì)激活抗氧化系統(tǒng)，包括超氧化物歧化酶 （SOD）、過氧化物酶 （POD） 和過氧化氫酶 （CAT） 等酶類[5]。根系作為吸收磷的主要器官，在供磷不足的環(huán)境下會(huì)增加根毛長度，擴(kuò)大根系與土壤的接觸面積，從而提高磷的吸收和利用效率[6?7]。除了通過分析葉片和根系的生長發(fā)育來研究植物對(duì)磷水平變化的適應(yīng)性外，轉(zhuǎn)錄組學(xué)也是解析植物磷調(diào)控機(jī)制的有效方法。研究人員在擬南芥 （Arabidopsis thaliana）[8]、玉米（Zea mays）[9]、水稻 （Oryza sativa）[10]和小麥 （Triticumaestivum）[11]葉片和根系中發(fā)現(xiàn)了多個(gè)響應(yīng)磷水平變化的差異表達(dá)基因 （DEGs），這些基因參與調(diào)控糖酵解途徑、離子轉(zhuǎn)運(yùn)、活性氧清除、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、苯丙素生物合成等過程。其中，糖酵解是植物細(xì)胞能量代謝的核心途徑，可確保植物在低磷環(huán)境下仍能合成必要的能量物質(zhì)[12]。苯丙素生物合成途徑產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，如黃酮類、花青素、單寧和木質(zhì)素等，不僅提高植物的抗氧化能力，還參與病害防御和脅迫信號(hào)傳遞，有助于植物在不利環(huán)境條件下生存和發(fā)育[13]。同時(shí)，Yan 等[14]通過對(duì)水稻 （Oryza sativa） 在磷充足和磷缺乏條件下的第一葉片 （上部） 和第四葉片（下部） 進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，OsPHO1;3 基因在植物正常生長的無機(jī)磷酸鹽 （Pi） 再動(dòng)員過程中發(fā)揮著重要作用。

已有大量研究探討了植物適應(yīng)磷營養(yǎng)水平的表型變化以及生化和分子反應(yīng)機(jī)制，但這些研究的材料絕大多數(shù)為模式作物，研究結(jié)果對(duì)特定作物的適應(yīng)性機(jī)制的代表性缺少驗(yàn)證。本研究選擇高地型柳枝稷作為研究對(duì)象，探究不同供磷水平下葉片和根系的表型和生理調(diào)控效應(yīng)；通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)，采用FPKM （Fragments Per Kilobases per Millionreads）方法和P-adjust≤0.05 且|log2FC|≥1 標(biāo)準(zhǔn)，鑒定葉片和根系的差異表達(dá)基因 （DEGs） ，通過GO （geneontology） 功能富集分析和KEGG （Kyoto Encyclopediaof Genes and Genomes） 代謝途徑分析，對(duì)低磷水平下的DEGs 進(jìn)行功能注釋，以揭示葉片和根系在分子層面上的適應(yīng)性差異，為進(jìn)一步探索柳枝稷耐低磷候選基因提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2022 年4—10 月在寧夏銀川市寧夏大學(xué)試驗(yàn)研究基地大棚溫室開展。以Hoagland 營養(yǎng)液為基礎(chǔ)，參考Ding 等[ 1 5 ]設(shè)置4 個(gè)營養(yǎng)液KH2PO4 水平：20 μmol/L （P20）、100 μmol/L （P100）、200 μmol/L（P200） 和500 μmol/L （P500）。供試材料為高地型柳枝稷 （Panicum virgatum L.） Pathfinder 品種，由北京市農(nóng)林科學(xué)院草業(yè)與環(huán)境發(fā)展研究中心提供。

試驗(yàn)采用無土盆栽試驗(yàn)，培養(yǎng)基質(zhì)為石英砂、蛭石和珍珠巖混合物 （體積比1∶3∶1）。柳枝稷種子經(jīng)3% H2O2 消毒后育苗，三葉期幼苗移栽至準(zhǔn)備好的花盆中，每盆4 株，每個(gè)處理3 次重復(fù)，共12 盆，于光照箱中培養(yǎng)45 天，生長條件為光周期12 h 光照/12 h 黑暗，光照強(qiáng)度600 μmol/（m2 ·s），晝夜溫度（25±2）℃/（20±2）℃，相對(duì)濕度60%～70%。每間隔5天澆1.5 L 含不同KH2PO4 配比的Hoagland 培養(yǎng)液，澆培養(yǎng)液前用2.0 L 蒸餾水浸潤花盆中培養(yǎng)基質(zhì)，以保證營養(yǎng)充足以及磷濃度相對(duì)穩(wěn)定。于第46 天上午9：30，各處理挑選3 株長勢(shì)均勻的柳枝稷幼苗測(cè)定生理指標(biāo)，再采集3 株幼苗分為葉片和根系樣品，用超純水清洗3 次，用濾紙吸干植株表面水分后置于液氮中冷凍，在?80℃ 下保存，用于后續(xù)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。

1.2 植株生理指標(biāo)測(cè)定

幼苗干物質(zhì)量采用烘干稱重法測(cè)定，將幼苗分為地上部和地下部置于烘箱中，70℃ 烘干至恒重。根系形態(tài)采用全自動(dòng)根系掃描分析儀STD1600 （Epson，Japan） 進(jìn)行測(cè)定，然后使用分析軟件Win-RHIZO（Regent instrument，Canada） 對(duì)根系形態(tài)進(jìn)行分析。根系活力采用TTC 法測(cè)定[16]。葉片SOD、POD 和CAT 活性分別采用NBT 法、愈創(chuàng)木酚法和TBA 法測(cè)定[ 1 7 ]。葉片和根系酸性磷酸酶活性采用試劑盒（Solarbio，貨號(hào)BC2130） 測(cè)定。葉片和根系全磷含量采用釩鉬比色法測(cè)定[18]。

1.3 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及差異基因功能注釋分析

委托蘇州帕諾米克生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。采用天根多糖多酚試劑盒（QIAGEN，Germany） 從柳枝稷葉片和根系組織中提取RNA，隨后對(duì)RNA 樣品進(jìn)行嚴(yán)格質(zhì)控，主要利用Agilent2100 bioanalyzer 精確檢測(cè)RNA 完整性。文庫構(gòu)建采用NEBNext? Ultra? Directional RNA Library Prep Kitfor Illumina?試劑盒。庫檢合格后，采用illuminaNovaSeq 6000 （illumina， USA） 進(jìn)行雙端測(cè)序，獲得原始數(shù)據(jù) （raw reads），通過質(zhì)控軟件fastp （version0.19.7） 去除低質(zhì)量的讀數(shù)，獲得高質(zhì)量的序列數(shù)據(jù)（clean reads）。使用HISAT2 軟件將clean reads 與參考基因組 （Phytozome Panicum virgatum v4.1） 進(jìn)行精確比對(duì)，獲取在參考基因組上的位置信息以及測(cè)序樣本特有的序列特征信息。計(jì)算每千個(gè)堿基轉(zhuǎn)錄每百萬映射讀取的fragments （FPKM 值），分別使用差異基因Padj 數(shù)值BH 法和DESeq2 軟件計(jì)算P-adjust和Fold Change 值，以P-adjust≤0.05 且|log2FC|≥1為篩選標(biāo)準(zhǔn)，獲得不同處理下DEGs。然后對(duì) DEGs進(jìn)行GO 富集和 KEGG 富集功能注釋。

1.4 qRT-PCR 驗(yàn)證

從糖酵解和苯丙素生物合成途徑挑選6 個(gè)基因，采用qRT-PCR 方法對(duì)葉片和根系轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，利用Primer 3 plus 設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物（表1），以柳枝稷Actin 為內(nèi)參基因。每個(gè)處理進(jìn)行3 次生物學(xué)重復(fù)，采用2–ΔΔCt 方法計(jì)算差異基因相對(duì)表達(dá)量。

1.5 數(shù)據(jù)處理

利用Microsoft Excel 2019 和SPSS 20.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析，采用單因素方差分析（ANOVA） 比較處理間差異，采用相關(guān)性分析和隨機(jī)森林模型分析植株磷變化的主控因子，采用Origin 2024 軟件以及R4.3.2 的ggplot2、pheatmap、rfPermute、psych、reshape2、patchwork、randomForest、rfUtilities、linkET、cols4all、dplyr 包等繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 供磷水平對(duì)柳枝稷生理特性的影響

供磷水平顯著影響柳枝稷葉片的抗氧化酶 （POD、SOD 和CAT） 活性 （圖1）。隨供磷水平的提高，葉片抗氧化酶活性均呈先減后增趨勢(shì)，POD、SOD 和CAT活性在P200 處理達(dá)到最低，較P20 處理分別顯著降低了54.15%、38.60% 和80.42%，P100 和P500 處理的葉片抗氧化酶活性差異不顯著。總根長、總根面積和根系活力隨磷水平提高均呈先增加后降低的趨勢(shì) （圖1），P200 處理下的總根長、總根面積和根系活力達(dá)到峰值，分別較P20 顯著提高了103.80%、82.55% 和160.21%。干物質(zhì)量、磷含量和酸性磷酸酶活性同樣在P200 處理達(dá)到峰值（圖1），其幼苗地上部、地下部干物質(zhì)量分別較P20 處理顯著增加77.73%、150.46%，葉片和根系酸性磷酸酶活性分別顯著增加42.77% 和278.49%，葉片和根系磷含量分別顯著增加23.81% 和15.56%。

進(jìn)行柳枝稷磷含量與各指標(biāo)之間的相關(guān)性分析及隨機(jī)森林模型分析，結(jié)果 （圖2） 顯示，葉片磷含量與葉片磷酸酶活性、總根面積極顯著正相關(guān) （Plt;0.01），與葉片POD 活性顯著負(fù)相關(guān) （Plt;0.05），地下部干物質(zhì)量、地上部干物質(zhì)量是顯著影響因素；根系磷含量與根系磷酸酶活性極顯著正相關(guān) （Plt;0.01），與葉片POD 活性顯著負(fù)相關(guān) （Plt;0.05），地下部干物質(zhì)量、地上部干物質(zhì)量和根系磷酸酶活性是顯著影響因素。綜上所述，供磷水平顯著影響柳枝稷的表型特征與生理特性，低磷脅迫顯著提高了柳枝稷葉片的抗氧化酶活性，且提高供磷水平有利于植株干物質(zhì)積累，促進(jìn)磷的吸收。

2.2 不同供磷水平下葉片和根系差異表達(dá)基因數(shù)目統(tǒng)計(jì)

和P20 處理比，隨磷水平升高葉片的差異表達(dá)基因 （上調(diào)、下調(diào)） 總數(shù)逐漸降低，而根系呈先增加后減少趨勢(shì) （圖3）。葉片中，和P20 處理比，P100中上調(diào)基因3979 個(gè)，下調(diào)基因4334 個(gè)；P200 中上調(diào)基因2651 個(gè)，下調(diào)基因3393 個(gè)；P500 中上調(diào)基因4075 個(gè)，下調(diào)基因1669 個(gè)，檢測(cè)到各磷處理共同表達(dá)的差異表達(dá)基因有1091 個(gè)。根系中，和P20處理比，P100中上調(diào)基因1918 個(gè)，下調(diào)基因2157個(gè)；P200 中上調(diào)基因3418 個(gè)，下調(diào)基因4022 個(gè)；P500 中上調(diào)基因3484 個(gè)，下調(diào)基因3292 個(gè)，檢測(cè)到各磷處理共同表達(dá)的差異表達(dá)基因有1762 個(gè)。

2.3 葉片和根系差異表達(dá)基因GO 富集功能注釋

從生物合成過程看，和P20 處理比，P100 處理的葉片差異表達(dá)基因（DEGs） 顯著富集于陽離子運(yùn)輸、有機(jī)磷代謝、碳水化合物衍生物代謝、小分子生物合成、核苷酸、有機(jī)酸生物合成、氧化應(yīng)激、細(xì)胞脂質(zhì)代謝和有機(jī)磷生物合成等過程 （圖4），根系DEGs 顯著富集于小分子生物合成、氧化應(yīng)激、有機(jī)酸生物合成、細(xì)胞脂質(zhì)代謝、脂質(zhì)生物合成、單羧酸代謝、單羧酸生物合成、脂肪酸代謝和脂肪酸生物合成等過程。從功能看，葉片DEGs 顯著富集于特異DNA 序列結(jié)合、離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性、無機(jī)分子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性、抗氧化活性、裂合酶活性、氧化還原酶活性、過氧化物酶、主動(dòng)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性和陽離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性等條目，根系DEGs 顯著富集于酰基轉(zhuǎn)移酶活性、非氨基酰基轉(zhuǎn)移酶活性、抗氧化活性、過氧化物酶活性、主動(dòng)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性和三磷酸腺苷酶活性等條目。

和P20 比，P200 處理的生物學(xué)過程中，葉片DEGs 顯著富集于氧化應(yīng)激和碳水化合物代謝等過程，根系DEGs 顯著富集于小分子生物合成、有機(jī)酸生物合成、單羧酸代謝和氧化應(yīng)激等過程 （圖5）。分子功能中，葉片DEGs 顯著富集于調(diào)節(jié)過氧化物酶活性、氧化還原酶活性、抗氧化活性、序列特異性DNA 結(jié)合、酰基轉(zhuǎn)移酶活性、非氨基酰基轉(zhuǎn)移酶活性、絲氨酸水解酶活性和裂合酶活性等條目，根系DEGs 顯著富集于調(diào)節(jié)酰基轉(zhuǎn)移酶活性、非氨基酰基轉(zhuǎn)移酶活性、裂合酶活性、過氧化物酶活性、氧化還原酶活性、抗氧化活性和主動(dòng)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性等條目。

和P20 處理比， P500 處理的生物學(xué)過程中，葉片DEGs 顯著富集于氧化應(yīng)激等過程，根系DEGs 顯著富集于小分子生物合成、碳水化合物衍生物代謝、有機(jī)酸合成、有機(jī)磷合成、單羧酸代謝、輔因子代謝、細(xì)胞脂質(zhì)代謝和核苷酸代謝等過程 （圖6）。分子功能中，葉片DEGs 顯著富集于特異DNA 序列結(jié)合、過氧化物酶活性、氧化還原酶活性、抗氧化活性、非氨基酰基轉(zhuǎn)移酶活性和主動(dòng)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性等條目，根系DEGs 主要富集于酰基轉(zhuǎn)移酶活性、非氨基酰基轉(zhuǎn)移酶活性、裂合酶活性、電子傳遞活性、三磷酸腺苷酶活性、抗氧化活性和主動(dòng)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性等條目。

2.4 葉片和根系差異基因 KEGG 富集分析

根據(jù)KEGG 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行通路富集分析，解析差異表達(dá)基因?qū)Υx通路的影響，揭示柳枝稷緩解低磷脅迫的分子機(jī)制 （圖7）。環(huán)境信息處理相關(guān)通路中，葉片和根系共有通路為植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和植物?病原互作通路，其中植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在葉片中顯著表達(dá)。遺傳信息處理相關(guān)通路中，葉片和根系中共有通路為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)加工通路，葉片和根系中均未達(dá)到顯著水平。代謝相關(guān)通路中，葉片和根系富集到的共同通路有氨基糖和核苷糖代謝、半胱氨酸和蛋氨酸代謝、脂肪酸代謝、谷胱甘肽代謝、糖酵解/糖異生、苯丙素生物合成以及蔗糖和淀粉代謝通路，其中氨基糖和核苷糖代謝、糖酵解/糖異生、苯丙素生物合成、蔗糖和淀粉代謝通路在葉片和根系中顯著表達(dá)，而脂肪酸代謝和谷胱甘肽代謝通路主要在根系中顯著表達(dá)。

2.5 糖酵解和苯丙素生物合成代謝通路相關(guān)基因的表達(dá)分析

糖酵解是代謝的重要途徑之一，在能量代謝和生物合成中起著舉足輕重的作用。不同供磷水平下糖酵解途徑的相關(guān)基因差異表達(dá)，本試驗(yàn)中共篩選出16 個(gè)差異表達(dá)基因 （圖8a）。由β-葡萄糖切入生成α-葡萄糖進(jìn)入糖酵解途徑的變旋酶 （AE） 基因在葉片中的表達(dá)量高于根系；由1-磷酸葡萄糖切入糖酵解途徑的磷酸葡萄糖變位酶 （PGM） 基因主要在根系中表達(dá)。己糖激酶 （HK） 基因和6-磷酸果糖激酶 （PFK）基因在葉片中的表達(dá)量高于根系，三磷酸異構(gòu)酶 （TPI）基因在葉片中表達(dá)量較高，3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPD） 基因在根系中表達(dá)量高于葉片，磷酸甘油醛激酶 （PGK） 基因LOC120664222、LOC120698254 分別在葉片的P20 處理以及根系的P500 處理中表達(dá)量較高。最后，糖酵解產(chǎn)物丙酮酸通過丙酮酸脫羧酶（PDC） 和乙酰輔酶A 合成酶 （ACS） 進(jìn)入三羧酸循環(huán)。

葉片及根系的苯丙素生物合成途徑共涉及到16個(gè)差異表達(dá)基因 （圖8b）。催化苯丙氨酸生成對(duì)香豆酸的苯丙氨酸裂解酶 （PAL） 基因LOC120642393 主要在柳枝稷葉片中表達(dá)，并在P200 和P500 處理中表達(dá)量較高；LOC120709328 和LOC120683054 基因主要在根系中表達(dá)，同樣在P200 和P500 處理中表達(dá)量較高。反式肉桂酸-4-羧化酶 （C4H） 基因和香豆酸輔酶A 連接酶 （4CL） 基因在葉片和根系中表達(dá)量無明顯差異。參與對(duì)香豆酸合成木質(zhì)素過程的肉桂酰輔酶A 還原酶 （CCR） 基因、肉桂醇脫氫酶 （CAD）基因、Class Ⅲ型植物過氧化物酶 （CIII Prxs） 基因主要在柳枝稷葉片中表達(dá)，并主要以P20 處理下的基因表達(dá)量較高。

2.6 磷吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)及其調(diào)控相關(guān)基因的差異表達(dá)

共有20 個(gè)磷吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)及調(diào)控基因在葉片和根系中差異表達(dá) （圖9）。其中，編碼G6P/Pi 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的GPT2 基因，編碼無機(jī)Pi 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的PHT2;1 基因，編碼磷酸三糖/Pi 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的TPT 基因，編碼磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）/Pi 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的PPT1、PPT2以及PPT3 基因在葉片中的表達(dá)量高于根系，而編碼線粒體Pi 載體蛋白的PiC3 基因和編碼鈣依賴性線粒體ATP-鎂/Pi 載體蛋白的APC2 基因在根系中的表達(dá)量高于葉片。

2.7 qRT-PCR 驗(yàn)證

為驗(yàn)證柳枝稷幼苗葉片及根系轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果中基因表達(dá)量的準(zhǔn)確性，從糖酵解和苯丙素生物合成途徑挑選了6 個(gè)基因進(jìn)行不同供磷水平處理下的qRT-PCR 驗(yàn)證 （圖10）。將qRT-PCR 結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)比對(duì)發(fā)現(xiàn)，6 個(gè)差異表達(dá)基因變化趨勢(shì)表現(xiàn)與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)基本一致。

3 討論

3.1 供磷水平對(duì)柳枝稷葉片和根系生理特性的影響

供磷水平對(duì)植物的生長和生理過程有著顯著影響。在供磷不足條件下，植物可以通過激活SOD、POD 和CAT 等抗氧化酶，增強(qiáng)植物的抗氧化能力，從而減輕活性氧 （ROS） 的損害[19?20]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，柳枝稷的SOD、POD 和CAT 活性顯著受到供磷水平的影響，與Su 等[21]研究結(jié)果相似。隨供磷水平的提高，柳枝稷葉片抗氧化酶活性呈現(xiàn)先降低后增加的趨勢(shì)，P200 處理下的POD、SOD 和CAT 的活性達(dá)到最低，較P20 處理分別顯著降低了54.15%、38.60%和80.42%。值得注意的是，P500 處理提高了抗氧化酶活性。根據(jù)前人研究推測(cè)，過高的磷水平增加了葉片中的丙二醛 （MDA） 和過氧化氫 （H2O2） 含量，刺激SOD、POD 和CAT 活性提高，加快自由基清除進(jìn)度，進(jìn)而減少脅迫對(duì)植株的損害[22]。

調(diào)整根系形態(tài)是植物適應(yīng)磷水平變化的關(guān)鍵策略之一，根系總長度和根系表面積反映了植物根系的吸收能力[23]。Wang 等[24]發(fā)現(xiàn)，施磷顯著降低了低密度種植下的柳枝稷根平均直徑，而對(duì)比根長無顯著影響，導(dǎo)致根系較細(xì)，根系組織密度較高。在本試驗(yàn)中，同P20 處理相比，P200 處理下的總根長、總根面積和根系活力分別顯著提高了103.80%、82.55%和160.21%。隨著磷水平提高，柳枝稷葉片和根系的酸性磷酸酶活性、磷含量以及干物質(zhì)量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，這與根系總長度、根系總面積和根系活力的變化規(guī)律相吻合。隨機(jī)森林模型分析發(fā)現(xiàn)，植株干物質(zhì)量和磷酸酶活性是影響葉片和根系磷含量的重要因素。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，根系中的酸性磷酸酶活性高于葉片，而磷含量則表現(xiàn)出相反的趨勢(shì)。這反映了柳枝稷對(duì)磷的重新分配，提高磷水平促使根系中的酸性磷酸酶分解磷并將其輸送到柳枝稷地上部分，參與如光合作用、碳分配、能量代謝、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和酶調(diào)節(jié)等關(guān)鍵代謝途徑，從而影響了葉片酸性磷酸酶的活性和磷含量。然而，過高的供磷水平并沒有進(jìn)一步提高柳枝稷對(duì)磷素的吸收和利用。在實(shí)際生產(chǎn)中，柳枝稷通常比其他植物更能適應(yīng)低磷土壤環(huán)境[25]。根據(jù)形態(tài)和生境偏好，柳枝稷分為低地生態(tài)型和高地生態(tài)型，高地生態(tài)型在較干燥和寒冷的地區(qū)生長良好，并且我國北方地區(qū)土壤中有效磷含量通常較低[26]。因此，探究高地生態(tài)型柳枝稷品種的表型、生理生化對(duì)供磷水平的響應(yīng)，對(duì)北方地區(qū)發(fā)展可再生飼料資源和生物質(zhì)能源資源具有重要意義。

3.2 供磷水平對(duì)柳枝稷葉片和根系差異表達(dá)基因表達(dá)的影響

在柳枝稷適應(yīng)不同磷供應(yīng)水平的過程中，差異表達(dá)基因發(fā)揮了關(guān)鍵作用。與P20 相比，P100 及P200 處理中，葉片和根系的差異表達(dá)基因主要呈現(xiàn)下調(diào)趨勢(shì)，與Hou 等[27]和Shao 等[28]研究結(jié)果相似。而在P500 處理中，葉片和根系的差異表達(dá)基因則以上調(diào)為主，這表明過量的磷素可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)磷酸鹽水平失衡，影響細(xì)胞的能量代謝和信號(hào)傳導(dǎo)，柳枝稷通過上調(diào)一系列防御基因來減輕磷毒性的影響。通過GO 富集注釋分析得知，差異表達(dá)基因主要在分子功能上顯著富集。在葉片中，主要受影響的是離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性、無機(jī)分子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性、酰基轉(zhuǎn)移酶活性、抗氧化活性、氧化還原酶活性、過氧化物酶活性等，這與葉片中SOD、POD和CAT 活性的變化相符合，表明柳枝稷可能通過調(diào)控抗氧化酶相關(guān)基因的表達(dá)來響應(yīng)磷水平變化，與朱晨璐等[29]研究結(jié)果相似。在根系中，主要受影響的是酰基轉(zhuǎn)移酶活性、非氨基酰基轉(zhuǎn)移酶活性、抗氧化活性、特異DNA 序列結(jié)合、主動(dòng)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性、裂合酶活性、無機(jī)分子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性等。KEGG 富集分析進(jìn)一步揭示了柳枝稷葉片和根系中差異表達(dá)基因調(diào)控的生物代謝途徑，包括植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、植物?病原互作、苯丙素生物合成、氨基糖和核苷糖代謝、半胱氨酸和蛋氨酸代謝、脂肪酸代謝、谷胱甘肽代謝、糖酵解和糖異生、蔗糖和淀粉代謝通路等。通過這些調(diào)控機(jī)制，柳枝稷能夠在各種磷供應(yīng)條件下維持正常的生長和發(fā)育。

3.3 糖酵解途徑相關(guān)基因在葉片及根系中差異表達(dá)

糖酵解代謝途徑是生物體碳代謝的中心途徑，連通了核酸代謝、蛋白質(zhì)代謝、脂類代謝及次生代謝等多個(gè)代謝途徑[30?31]，磷水平變化直接影響糖酵解途徑，進(jìn)而調(diào)控對(duì)磷的吸收和運(yùn)輸[32?34]。本研究發(fā)現(xiàn)，有16 個(gè)基因在柳枝稷葉片和根系中表現(xiàn)出差異化表達(dá)。AE 基因在葉片中的表達(dá)量高于根系，而PGM 基因在根系中表達(dá)量更高。這一表達(dá)模式表明，在葉片中主要通過AE 催化β-葡萄糖生成α-葡萄糖；而在根系中主要通過PGM 催化1-磷酸葡萄糖生成6-磷酸葡萄糖，從而參與糖酵解途徑，揭示了柳枝稷不同器官磷代謝反應(yīng)和調(diào)控機(jī)制的差異。己糖激酶（HK） 和磷酸果糖激酶（PFK） 是糖酵解中的關(guān)鍵酶和限制酶，磷脅迫將抑制兩者基因的表達(dá)[35]。但本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，葉片內(nèi)的HK 基因和PFK 基因的表達(dá)水平在不同磷水平下差異不明顯，后續(xù)糖酵解酶基因表達(dá)量總體高于根系。根據(jù)前人研究推測(cè)，供磷不足將降低HK 和PFK 代謝底物 （ATP） 的含量，而焦磷酸二酯 （PPi） 可以作為一種ATP 的替代能量供體，參與UDP-葡萄糖合成6-磷酸果糖的過程[36]。因此，為了適應(yīng)磷水平變化，葉片提高了UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因 （UGP） 和磷酸葡萄糖異構(gòu)酶基因 （GPI） 的表達(dá)。在PPi 作用下，UGP 和GPI 將UDP-葡萄糖轉(zhuǎn)化為6-磷酸葡萄糖，從而維持柳枝稷葉片中糖酵解代謝途徑的進(jìn)行。

3.4 苯丙素生物合成途徑相關(guān)基因在葉片及根系中差異表達(dá)

在植物體內(nèi)，苯丙氨酸 （或酪氨酸） 經(jīng)過脫氨基、羥基化、甲基化、氧化還原反應(yīng)和聚合生成H木質(zhì)素、G 木質(zhì)素和S 木質(zhì)素等木質(zhì)素單體[37]，苯丙氨酸解氨酶（PAL） 和4-香豆酸輔酶A 連接酶（4CL）是整個(gè)代謝途徑的關(guān)鍵酶和限速酶，PAL 在苯丙素生物合成途徑的前端催化苯丙氨酸轉(zhuǎn)化為肉桂酸，4CL 控制苯丙氨酸走向不同的代謝途徑[ 3 8 ]。另外，C4H、CCR、CAD 等基因在木質(zhì)素的合成過程中也起著極為重要的調(diào)控作用，有的還參與緩解相關(guān)生物或非生物脅迫[ 3 9 ? 4 0 ]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)16 個(gè)關(guān)鍵酶基因在柳枝稷葉片和根系的苯丙素生物合成途徑中呈現(xiàn)差異化表達(dá)。其中，PAL 注釋到3 個(gè)基因，LOC120642393 基因主要在柳枝稷葉片中表達(dá)，而LOC120709328 和LOC120683054 基因主要在根系中表達(dá)。CCR 和CAD 基因在葉片P20 處理中表達(dá)量較高，這與低磷脅迫下葉片抗氧化酶活性顯著提高相符合。C4H 基因和4CL 基因在葉片和根系中的表達(dá)量沒有明顯差異，表明其在柳枝稷整個(gè)植物體中都是苯丙素生物合成的重要調(diào)控點(diǎn)。煙草 （Tobacco）[41]、百日草 （Zinnia）[42]等植物中證實(shí)了Class Ⅲ型植物過氧化物酶 （CIII Prxs） 參與木質(zhì)素合成。在CIII Prxs催化下，各種木質(zhì)素單體被氧化形成木質(zhì)素聚合物而使細(xì)胞壁硬化，或者通過其生長素氧化酶活性控制細(xì)胞伸長[43?44]。Vance 等[45]認(rèn)為，磷脅迫將促進(jìn)防御代謝物的生物合成，如細(xì)胞壁木質(zhì)化的增加。本研究中，CIII Prxs 基因在葉片中的表達(dá)量高于根系，同時(shí)發(fā)現(xiàn)供磷水平會(huì)降低CIII Prxs 的表達(dá)量，這表明磷的供應(yīng)水平可能通過調(diào)節(jié)關(guān)鍵酶基因的表達(dá)來影響柳枝稷的木質(zhì)素合成和細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)。

3.5 磷吸收轉(zhuǎn)運(yùn)及其調(diào)控相關(guān)基因在葉片及根系中差異表達(dá)

在高等植物中，磷以無機(jī)磷酸鹽 （Pi，即PO43?、HPO42 ?和H2PO4? ） 的形式從土壤中通過一個(gè)依賴于H+的共轉(zhuǎn)運(yùn)過程獲得[ 4 6 ]。相關(guān)研究表明，PHT1～PHT4 基因編碼磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體，使磷酸鹽可以在植物組織和細(xì)胞器內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)[47]；TPT 基因編碼磷酸三糖/Pi 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，催化TP、3-PGA 和Pi 在葉綠體包膜上進(jìn)行嚴(yán)格的1∶1 交換，在光合作用中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[ 4 8 ? 4 9 ]；PPT 基因編碼PEP/Pi 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，可以將PEP 輸入質(zhì)體[50]；GPT2 基因編碼質(zhì)體G6P/Pi 轉(zhuǎn)運(yùn)體，可以通過葉綠體和細(xì)胞質(zhì)之間的G6P 分配信號(hào)以及光合作用相關(guān)蛋白質(zhì)組的重置等機(jī)制，使光合作用適應(yīng)輻照度增加[51?52]。據(jù)前人研究結(jié)果，PHT2;1 活性影響植物體內(nèi)的Pi 分配，并調(diào)節(jié)Pi 饑餓反應(yīng)，包括Pi 饑餓反應(yīng)基因的表達(dá)和Pi在葉片內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)[53]。提高磷酸鹽或外源糖供應(yīng)會(huì)上調(diào)GPT2 表達(dá)水平并促進(jìn)淀粉積累[54?55]。本研究中，P20 處理降低了GPT2、PHT2;1、TPT、PPT1、PPT2和PPT3 基因在葉片的中表達(dá)，在P100～P500 處理下基因表達(dá)量遠(yuǎn)高于根系。PiC 作為一種膜嵌入蛋白，主要負(fù)責(zé)將Pi 從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到線粒體基質(zhì)中，以支持ATP 合成過程中的Pi 需求[56]。在本試驗(yàn)中，PiC3 和APC2 基因在根系中的表達(dá)量則高于葉片。以上表明，葉片和根系在磷的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制上存在明顯的組織特異性，通過調(diào)控不同基因在葉片和根系中的差異表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)Pi 轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，以應(yīng)對(duì)磷脅迫，保障柳枝稷幼苗在低磷環(huán)境下的磷吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)。

4 結(jié)論

磷水平對(duì)柳枝稷根系表型和根系活力具有顯著影響。供磷不足條件下，柳枝稷可通過激活葉片SOD、POD 和CAT 活性，增強(qiáng)其抗氧化能力。適宜磷水平可提高柳枝稷葉片和根系的酸性磷酸酶活性、磷含量。供磷水平變化會(huì)引起糖酵解途徑、苯丙素生物合成途徑和磷吸收轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因（PGM、HK、PFK、PAL、4CL、TPT、PPT 基因家族等） 在葉片和根系中的差異表達(dá)。

參 考 文 獻(xiàn)：

[ 1 ]Casler M D， Tobias C M， M K S， et al. The switchgrass genome：Tools and strategies[J]. The Plant Genome， 2011， 4（3）： 273?282.

[ 2 ]Meyer E， Aspinwall M J， Lowry D B， et al. Integrating transcriptional，metabolomic， and physiological responses to drought stress and recovery in switchgrass （Panicum virgatum L.）[J]. Bmc Genomics，2014， 15： 527.

[ 3 ]Wu W W， Zhu S N， Chen Q Q， et al. Cell wall proteins play critical roles in plant adaptation to phosphorus deficiency[J]. International Journal of Molecular Sciences， 2019， 20（21）： 5259.

[ 4 ]Zhang K W， Liu H H， Tao P L， Chen H. Comparative proteomic analyses provide new insights into low phosphorus stress responses in maize leaves[J]. PLoS ONE， 2014， 9（5）： 98215.

[ 5 ]Snezhkina A V， Kudryavtseva A V， Kardymon O L， et al. ROS generation and antioxidant defense systems in normal and malignant cells[J]. Oxidative Medicine and Cellular Longevity，2019， 4： 6175804.

[ 6 ]Brown L K， George T S， Thompson J A， et al. What are the implications of variation in root hair length on tolerance to phosphorus deficiency in combination with water stress in barley （Hordeum vulgare）？[J]. Annals of Botany， 2012， 110（2）： 319?328.

[ 7 ]Bustos R， Castrillo G， Linhares F， et al. A central regulatory system largely controls transcriptional activation and repression responses to phosphate starvation in Arabidopsis[J]. PLoS Genetics， 2010， 6（9）：1001102.

[ 8 ]Morcuende R， Bari R， Gibon Y， et al. Genome-wide reprogramming of metabolism and regulatory networks of Arabidopsis in response to phosphorus[J]. Plant， Cell amp; Environment， 2007， 30（1）： 85?112.

[ 9 ]Pei L， Jin Z， Li K P， et al. Identification and comparative analysis of low phosphate tolerance-associated microRNAs in two maize genotypes[J]. Plant Physiology and Biochemistry， 2013， 70：221?234.

[10]Wasaki J， Shinano T， Onishi K， et al. Transcriptomic analysis indicates putative metabolic changes caused by manipulation of phosphorus availability in rice leaves[J]. Journal of Experimental Botany， 2006， 57（9）： 2049?2059.

[11]Oono Y， Kobayashi F， Kawahara Y， et al. Characterisation of the wheat （triticum aestivum L.） transcriptome by de novo assembly for the discovery of phosphate starvation-responsive genes： Gene expression in Pi-stressed wheat[J]. Bmc Genomics， 2013， 14： 77.

[12]Plaxton W C， Tran H T. Metabolic adaptations of phosphate-starved plants[J]. Plant Physiology， 2011， 156（3）： 1006?1015.

[13]Dixon R A， Paiva N L. Stress-induced phenylpropanoid metabolism[J]. [J]. Plant Cell， 1995， 7（7）： 1085?1097.

[14]Yan M， Xie M Y， Chen W， et al. Transcriptome analysis with different leaf blades identifies the phloem-specific phosphate transporter OsPHO1;3 required for phosphate homeostasis in rice[J].The Plant Journal， 2024， 118（3）： 905?919.

[15]Ding N， Huertas R， Torres J I， et al. Transcriptional， metabolic， physiological and developmental responses of switchgrass to phosphorus limitation[J]. Plant， Cell amp; Environment， 2021， 44（1）：186?202.

[16]李小芳. 植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M]. 北京： 高等教育出版社， 2016.

Li X F. Experiment guide for plant physiology[M]. Beijing： Higher Education Press， 2016.

[17]常福辰， 陸長梅， 莎莎. 植物生物學(xué)實(shí)驗(yàn)[M]. 江蘇南京： 南京師范大學(xué)出版社， 2007.

Chang F C， Lu C M， Sha S. The plant biology experiment[M]. Nanjing， Jiangsu： Nanjing Normal University Press， 2007.

[18]鮑士旦. 土壤農(nóng)化分析[M]. 北京： 中國農(nóng)業(yè)出版社， 2000.

Bao S D. Soil and agricultural chemistry analysis[M]. Beijing： China Agriculture Press， 2000.

[19]Rohman M， Talukder M， Hossain M， et al. Saline sensitivity leads to oxidative stress and increases the antioxidants in presence of proline and betaine in maize （Zea mays L.） inbred[J]. Plant Omics， 2016，9（1）： 35?47.

[20]Hasanuzzaman M， Alam M M， Rahman A， et al. Exogenous proline and glycine betaine mediated upregulation of antioxidant defense and glyoxalase systems provides better protection against salt-induced oxidative stress in two rice （Oryza sativa L.） varieties[J]. Biomed Research International， 2014， 1： 757219.

[21]Su B Q， Wang L F， Shangguan Z P. Morphological and physiological responses and plasticity in Robinia pseudoacacia to the coupling of water， nitrogen and phosphorus[J]. Journal of Plant Nutrition and Soil Science， 2021， 184（2）： 271?281.

[22]Song Y Z， Kong F F， Xue Y， Qin B Q. Responses of chlorophyll and MDA of Vallisneria natans to nitrogen and phosphorus availability and epiphytic algae[J]. Journal of Freshwater Ecology， 2015， 30（1）：85?97.

[23]Feng S L， Sikdar A， Wang J X， et al. Response of Amorpha fruticosa seedlings to drought and rewatering in arid and semi-arid environment[J]. Pakistan Journal of Botany， 2021， 53（2）： 419?424.

[24] Wang S Q， Liu J B， Kang J Y， et al. Root growth and morphology of switchgrass （Panicum virgatum L.） and bush clover （Lespedeza davurica S.） in mixed plantation under varying soil water and phosphorus supply conditions[J]. Pakistan Journal of Botany， 2021，53（4）： 1227?1237.

[25]Hao Z， Wang Y， Ding N， et al. Spectroscopic analysis reveals that soil phosphorus availability and plant allocation strategies impact feedstock quality of nutrient-limited switchgrass[J]. Communications Biology， 2022， 5（1）： 227.

[26]Porter C L. An analysis of variation between upland and lowland switchgrass， Panicum virgatum L. ， in Central Oklahoma[J]. Ecology，1966， 47（6）： 980?992.

[27]Hou Z H， Yin J L， Lu Y F， et al. Transcriptomic analysis reveals the temporal and spatial changes in physiological process and gene expression in common buckwheat （Fagopyrum esculentum Moench）grown under drought stress[J]. Agronomy， 2019， 9（10）： 569.

[28]Shao A， Wang W， Fan S G， et al. Comprehensive transcriptional analysis reveals salt stress-regulated key pathways， hub genes and time-specific responsive gene categories in common bermudagrass [Cynodon dactylon （L.） Pers.] roots[J]. BMC Plant Biology， 2021，21（1）： 175.

[29]朱晨璐， 武欣怡， 喻君保， 等. 基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序金絲草葉片響應(yīng)鉛脅 迫的抗氧化酶相關(guān)基因[J]. 農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)， 2022， 41（10）：2158?2169.

Zhu C L， Wu X Y， Yu J B， et al. Antioxidant enzyme-related genes of Pogonatherum crinitum leaves in response to lead stress based on RNA-Seq[J]. Journal of Agro-Environment Science， 2022， 41（10）：2158?2169.

[30]董文科， 馬祥， 張玉娟， 等. 低溫脅迫對(duì)不同早熟禾品種糖酵解代謝及其相關(guān)基因表達(dá)的影響[J]. 草地學(xué)報(bào)， 2019， 27（6）： 1503?1510.

Dong W K， Ma X， Zhang Y J， et al. Effects of low-temperature stress on glycolysis metabolism and related gene expression of different Poa pratensis varieties[J]. Acta Agrestia Sinica， 2019， 27（6）：1503?1510.

[31]Zhang J T， Zhang Y， Du Y Y， et al. Dynamic metabonomic responses of tobacco （Nicotiana tabacum） plants to salt stress[J]. Journal of Proteome Research， 2011， 10（4）： 1904?1914.

[32]Hernández G， Valdés-López O， Ramírez M， et al. Global changes in the transcript and metabolic profiles during symbiotic nitrogen fixation in phosphorus-stressed common bean plants[J]. Plant Physiology， 2009， 151（3）： 1221?1238.

[33]Stevens G G， Pérez-Fernández M A， Morcillo R J L， et al. Roots and nodules response differently to P starvation in the mediterranean-type legume Virgilia divaricata[J]. Frontiers in Plant Science， 2019， 10：73.

[34]Sun J J， Li Q L， Xu H， Zhang W T. Analysis of metabolomic changes in xylem and phloem sap of cucumber under phosphorus stresses[J].Metabolites， 2022， 12（4）： 361.

[35]Li H Y， Xu L T， Li J X， et al. Multi-omics analysis of the regulatory effects of low-phosphorus stress on phosphorus transport in soybean roots[J]. Frontiers in Plant Science， 2022， 13： 992036.

[36]Stitt M. Pyrophosphate as an energy donor in the cytosol of plant cells： An enigmatic alternative to ATP[J]. Botanica Acta， 1998，11（3）： 167?175.

[37]郭光艷， 柏峰， 劉偉， 秘彩莉. 轉(zhuǎn)錄因子對(duì)木質(zhì)素生物合成調(diào)控的研究進(jìn)展[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2015， 48（7）： 1277?1287.

Guo G Y， Bai F， Liu W， Mi C L. Advances in research of the regulation of transcription factors of lignin biosynthesis[J]. Scientia Agricultura Sinica， 2015， 48（7）： 1277?1287.

[38]Sui Z， Luo J， Yao R， et al. Functional characterization and correlation analysis of phenylalanine ammonia-lyase （PAL） in coumarin b i o s y n t h e s i s f r o m P e u c e d a n u m p r a e r u p t o r u m D u n n [ J ] .Phytochemistry， 2019， 158： 35?45.

[39]Wang Y X， Teng R M， Wang W L， et al. Identification of genes revealed differential expression profiles and lignin accumulation during leaf and stem development in tea plant [Camellia sinensis （L.）O. Kuntze][J]. Protoplasma， 2019， 256（2）： 359?370.

[40]Cheng X， Li M L， Li D H， et al. Characterization and analysis of CCR and CAD gene families at the whole-genome level for lignin synthesis of stone cells in pear （Pyrus bretschneideri） fruit[J].Biology Open， 2017， 6（11）： 1602?1613.

[41]Blee K A， Choi J W， O'Connell A P， et al. A lignin-specific peroxidase in tobacco whose antisense suppression leads to vascular tissue modification[J]. Phytochemistry， 2003， 64（1）： 163?176.

[42]Gabaldo?n C， Lo?pez-Serrano M， Pedren?o M A， et al. Cloning and molecular characterization of the basic peroxidase isoenzyme from Zinnia elegans， an enzyme involved in lignin biosynthesis[J]. Plant Physiology， 2005， 139（3）： 1138?1154.

[43]Francoz E， Ranocha P， Nguyen-Kim H， et al. Roles of cell wall peroxidases in plant development[J]. Phytochemistry， 2015， 112：15?21.

[44]Cosio C， Vuillemin L， Meyer M D， et al. An anionic class III peroxidase from zucchini may regulate hypocotyl elongation through its auxin oxidase activity[J]. Planta， 2009， 229： 823?836.

[45]Vance C P， Uhde-Stone C， Allan D L. Phosphorus acquisition and use： Critical adaptations by plants for securing a nonrenewable resource[J]. New Phytologist， 2003， 157（3）： 423?447.

[46]Li R L， Wang J L， Xu L， et al. Functional analysis of phosphate transporter OsPHT4 family members in rice[J]. Rice Science， 2020，27（6）： 493?503.

[47]Ayadi A， David P， Arrighi J F， et al. Reducing the genetic redundancy of Arabidopsis PHOSPHATE TRANSPORTER1 transporters to study phosphate uptake and signaling[J]. Plant Physiology， 2015，167（4）： 1511?1526.

[48]Loddenkotter B， Kammerer B， Fischer K， Flügge U I. Expression of the functional mature chloroplast triose phosphate translocator in yeast internal membranes and purification of the histidine- tagged protein by a single metal-affinity chromatography step[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences， 1993， 90（6）：2155?2159.

[49Lee Y， Nishizawa T， Takemoto M， et al. Structure of the triosephosphate/ phosphate translocator reveals the basis of substrate specificity[J]. Nature Plants， 2017， 3（10）： 825?832.

[50]Streatfield S J， Weber A， Kinsman E A， et al. The phosphoenolpyruvate/ phosphate translocator is required for phenolic metabolism， palisade cell development， and plastid-dependent nuclear gene expression[J].Plant Cell， 1999， 11（9）： 1609?1622.

[51]Karim M F， Johnson G N. Acclimation of photosynthesis to changes in the environment results in decreases of oxidative stress in Arabidopsis thaliana[J]. Frontiers in Plant Science， 2021， 12： 683986.

[52]Gamez-Arcas S， Munoz F J， Ricarte-Bermejo A， et al. Glucose-6- P/phosphate translocator 2 mediates the phosphoglucose-isomerase1-independent response to microbial volatiles[J]. Plant Physiology，2022， 190（4）： 2137?2154.

[53]Versaw W K， Harrison M J. A chloroplast phosphate transporter， PHT2;1， influences allocation of phosphate within the plant and phosphate-starvation responses[J]. Plant Cell， 2002， 14（8）： 1751?1766.

[54]Weise S E， Liu T， Childs K L， et al. Transcriptional regulation of the glucose-6-phosphate/phosphate translocator 2 is related to carbon exchange across the chloroplast envelope[J]. Frontiers in Plant Science， 2019， 10： 827.

[55]Lei M G， Liu Y D， Zhang B C， et al. Genetic and genomic evidence that sucrose is a global regulator of plant responses to phosphate starvation in Arabidopsis[J]. Plant Physiology， 2011， 156（3）： 1116?1130.

[56]Ferreira G C， Pedersen P L. Phosphate transport in mitochondria： Past accomplishments， present problems， and future challenges[J]. Journal of Bioenergetics and Biomembranes， 1993， 25（5）： 483?492.