高效液相色譜法測定金銀花中綠原酸及木犀草苷含量

摘 要：為同時測定鮮金銀花中綠原酸及木犀草苷的含量，建立了一種反向高效液相色譜法，使用超聲萃取進行前處理，優化了提取溶劑、提取溫度、流動相等條件，并進行了方法學考察。結果表明，綠原酸和木犀草苷在0.5～100.0 mg/mL內呈現良好的線性，R2gt;0.999，加標回收率為96%～108%，重復性RSD分別為2.05%和2.44%。說明該方法操作簡便，結果準確，可用于鮮金銀花中綠原酸及木犀草苷含量的測定。

關鍵詞：金銀花；綠原酸；木犀草苷；反向高效液相色譜法

中圖分類號：R284.1 文獻標志碼：A 文章編號：1008-1038（2024）07-0017-06

DOI：10.19590/j.cnki.1008-1038.2024.07.004

Determination of Chlorogenic Acid and Galuteolin

in Honeysuckle by HPLC

Abstract： This paper established a reverse high performance liquid chromatography （RP-HPLC） technique for the simultaneous determination of chlorogenic acid and galuteolin in honeysuckle. The ultrasonic extraction method was used for pretreatment， and the extraction solvent， extraction temperature and flow conditions were optimized. The results showed that the chlorogenic acid and galuteolin showed a good linear relationship over 0.5-100.0 mg/mL and correlation coefficients above 0.999. Recovery rate was 96%-108%， the RSD of repeatability was 2.05% and 2.44%， respectively. The method was simple and accurate， and it could be suitable for the determination of chlorogenic acid and galuteolin in fresh honeysuckle.

Keywords： Honeysuckle; chlorogenic acid; galuteolin; reverse high performance liquid chromatography

近年來，山東平邑金銀花產業發展迅猛，年產干花1 800萬kg，產量占全國產量的60%以上，平邑縣鄭城鎮以7 333 hm2的種植面積、600萬kg的干花產量，獲得“中國金銀花第一鎮”的稱號[1-2]。金銀花為忍冬科植物忍冬（Lonicera japonica Thunb）的干燥芽或早花，常用于治療癰腫疔瘡、喉痹、丹毒、熱毒血痢、風熱感冒、溫病發熱等疾病[3-6]。金銀花的功能性成分主要有酚酸類和黃酮類物質，其中酚酸類物質以綠原酸為主，黃酮類物質以木犀草苷為主。《中國藥典》中對金銀花中綠原酸和木犀草苷含量的規定分別為不低于1.5%和0.05%（均以干基計）[4]。綠原酸是由咖啡酸與奎寧酸組成的縮酚酸，又名咖啡單寧酸，化學名3-O-咖啡酰奎寧酸，是植物體在有氧呼吸過程中經莽草酸途徑產生的一種苯丙素類化合物。綠原酸受熱見光易分解，在水中溶解度約為4%，易溶于乙醇、丙酮、甲醇等極性溶劑，微溶于乙酸乙酯，難溶于氯仿、乙醚、苯等親脂性有機溶劑[7]。木犀草苷又名木犀草素-7-O-葡萄糖苷、青蘭苷，是一種天然黃酮類化合物，微溶于水、甲醇、乙腈，可溶于熱水、熱甲醇及乙醇，不溶于氯仿、乙醚、苯等親脂性有機溶劑[8-9]。

目前測定金銀花中功效成分的方法遵循《中國藥典》[4]，檢測方法相對獨立，綠原酸及木犀草苷的提取方法、定性定量方法均不相同，但兩種方法所用的提取、分析方法原理相近。吳香婷等[10]嘗試采用高效液相色譜法同時測定杞菊葉黃素酯顆粒中綠原酸、木犀草苷、異綠原酸A，方法簡便、準確、可靠，可用于杞菊葉黃素酯顆粒的含量測定。本研究采用有機溶劑超聲提取的方法，將金銀花功效成分提取后，經C18反向色譜柱分離，二極管陣列檢測器檢測，外標法定量，旨在同時對金銀花中的綠原酸和木犀草苷含量進行定性定量分析，將兩種特征成分合并檢測，可大幅降低金銀花中功效成分測試的時間、人力、物力成本，減少浪費。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金銀花：采自山東平邑，用熱風干燥法進行預處理。

乙醇，分析純，國藥集團化學試劑有限公司；乙腈、磷酸，色譜純，美國Thermo公司；超純水，實驗室自制；木犀草苷，純度≥98%，上海麥克林生化科技股份有限公司；綠原酸，純度≥98%，上海麥克林生化科技股份有限公司。

1.2 儀器與設備

U-3000高效液相色譜儀，美國Thermo公司；明澈D24 UV超純水儀，美國Millipore公司；KQ-500E超聲波提取機，昆山禾創超聲儀器有限公司；渦旋振蕩儀，德國IKA公司；高速離心機，美國Thermo公司；MS105十萬分之一電子天平，德國Mettler公司；PL2002百分之一電子天平，德國Mettler公司；KS-1053高速粉碎機，廣州市祁和電器有限公司；GZX-9240MBE熱風干燥箱，上海博迅實業有限公司醫療設備廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品制備

取新鮮樣品500 g，采用熱風干燥法干燥至含水率約11%。

干燥條件：溫度45 ℃、風速2 m/s、濕度65%，干燥4 h；溫度50 ℃、風速2 m/s、濕度50%，干燥6 h；溫度55 ℃、風速2 m/s、濕度30%干燥至含水率11%時停止干燥[11]。將干燥后的樣品放入高速粉碎機，粉碎后過65目篩[4]。

1.3.2 前處理

準確稱取2.00 g樣品至50 mL離心管中，加入20 mL乙醇，渦旋振蕩1 min混勻后，超聲20 min（60 ℃、2 500 W），10 000 r/min離心5 min，將上清液轉移至50 mL容量瓶中，殘渣再提取1次，合并上清液并定容至刻度，混勻后取10 mL至氮吹管中，40 ℃氮吹近干，用1 mL流動相溶解殘渣，過0.22 μm濾膜待上機。

1.3.3 色譜條件

固定相為Thermo公司Acclaim C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）。流動相為乙腈∶0.1%磷酸水溶液=15∶85。進樣量20 μL，柱溫40 ℃，檢測波長340 nm。

1.4 數據處理

試驗重復測定3次，數據采用Thermo Chromeleon 7處理，以綠原酸和木犀草苷為參照峰，用相對保留時間定位綠原酸和木犀草苷色譜峰，外標法定量。

2 結果與討論

2.1 前處理條件的優化

2.1.1 提取溶劑的優化

根據陳剛等[12]的研究及綠原酸、木犀草苷的性質，選用50%甲醇水溶液、50%乙醇水溶液及乙醇作為備選提取溶劑。精密稱取3份試樣，分別選用上述提取溶液，按照1.3.2的條件處理后上機（50%甲醇水溶液、50%乙醇水溶液提取時無需氮吹濃縮），試樣中綠原酸及木犀草苷含量見表1。由表可知，用純乙醇作為提取溶液可提取出更多的綠原酸和木犀草苷，因此選用純乙醇作為提取溶劑。

2.1.2 提取方法的優化

根據文獻資料，木犀草苷在加熱條件下溶解度較高[8-9]。稱取18份樣品按照1.3.2的條件處理后上機，試樣中綠原酸及木犀草苷含量見表2。

結果表明，60 ℃、20 min重復提取3次效果最佳，但與60 ℃、20 min重復提取2次效果差異較小，綜合考慮時間成本、人力成本等，最終確定采用60 ℃、20 min重復提取2次的提取方法。

2.2 HPLC條件的選擇

2.2.1 色譜柱的選擇

根據《中國藥典》[4]及周湧智等[13]、張繼環等[14]的研究，綠原酸及木犀草苷在C18色譜柱上有較好的保留及分離度，因此選用Thermo公司Acclaim C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）。

2.2.2 流動相及洗脫程序的優化

在流動相的選擇上，根據《中國藥典》[4]及周湧智等[13]、張繼環等[14]的研究，分別用流動相1，V（乙腈）∶V（0.1%磷酸水）=15∶85；流動相2，V（乙腈）∶V（0.5%乙酸水）=5∶95；流動相3，V（乙腈）∶V（0.1%磷酸水）=5∶95對試樣上機液進行試驗[15-16]。根據圖譜可知，流動相1的分離度較好，色譜峰清晰，且樣品流出時間較短，故選用流動相V（乙腈）∶V（0.1%磷酸水）=15∶85的比例等度洗脫對于檢測金銀花中綠原酸和木犀草苷較為適宜。

2.2.3 檢測波長的優化

根據文獻資料，木犀草苷最大紫外吸收波長為255、350 nm，綠原酸的最大紫外吸收波長為329 nm[9-10，17-19]（木犀草苷和綠原酸實際測量光譜圖如圖2、3所示），故選用340 nm為金銀花中綠原酸和木犀草苷的檢測波長，可同時兼顧二者。

2.3 定性和定量分析

2.3.1 標準曲線

精密稱取20.00 mg綠原酸標準品，將其轉移至50 mL容量瓶中，用乙醇溶解并定容，得到400 mg/L綠原酸標準品母液。精密稱取20.00 mg木犀草苷標準品，將其轉移至50 mL容量瓶中，用乙醇溶解并定容，得到400 mg/L木犀草苷標準品母液。

分別取綠原酸母液、木犀草苷母液0.012 5、0.025、0.25、1.25、2.5 mL至10 mL容量瓶中，用初始流動相稀釋至刻度，得到梯度標準混合工作液（綠原酸和木犀草苷濃度分別為0.5、1.0、10.0、50.0、100.0 mg/L）。將配制好的梯度標準混合工作液進樣測試并用外標法分析，結果見表3。結果表明，在0.5～100.0 mg/mL濃度范圍內，兩組分線性關系均良好，R2大于0.999，符合相關標準要求[20]。

2.3.2 測定低限

方法測定低限一般采用3倍的20次空白值標準偏差比方法校準曲線的斜率得到[20]，如表4知，最終計算得到綠原酸和木犀草苷的測定低限分別為0.005 65 mg/L和0.007 03 mg/L，代入計算公式得到最終樣品中濃度分別為0.000 141 g/100 g和0.000 176 g/100 g，遠低于相關標準中對金銀花中綠原酸和木犀草苷含量的要求[20]。

2.4 回收率和精密度

2.4.1 回收率

對金銀花樣品進行3水平加標回收試驗，結果如表5所示，在不同加標水平下，綠原酸的平均回收率為100.44%，木犀草苷的平均回收率為102.67%，表明該方法準確高，能滿足定量分析相關標準的要求[20]。

2.4.2 重復性

精密稱取7個供試樣品，重復測定7次，得到綠原酸和木犀草苷的平均濃度、相對標準偏差（RSD），結果見表6。由表6可知，綠原酸和木犀草苷的相對標準偏差（RSD）分別為2.05%和2.44%，結果表明該方法重復性好，能滿足實驗室檢測的需要[20]。

2.5 平邑地區金銀花中功效成分含量

由表6可知，平邑地區金銀花中綠原酸和木犀草苷含量分別為2.86 g/100 g和0.67 g/100 g，該數值符合《中國藥典》中對金銀花特征指標的要求[4]。

3 結論

研究建立了HPLC法檢測金銀花中綠原酸和木犀草苷的定量方法，優化了提取溶液中乙醇和水的比例、流動相的選用、流動相的比例、固定相的選用和檢測波長，確定了HPLC法檢測金銀花中綠原酸和木犀草苷含量的最優條件。結果表明，綠原酸和木犀草苷的線性關系、檢出限、精密度、重復性以及加標回收率等都滿足檢測需要，方法簡便、快速，檢測設備要求低，結果準確。該方法的建立為金銀花及其加工產品質量評價技術的提升提供了依據，同時也為其他相關農產品中功能成分的快速HPLC定量分析方法的開發提供了參考。

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