SPI基茶多酚納米復合物的制備及其分子間相互作用研究

摘 要：大豆分離蛋白（soybean protein isolated，SPI）因其功能和營養價值被認為是一種廣泛應用于食品工業的植物蛋白。然而，天然蛋白的功能有限，可對SPI的結構進行改性，以作為活性物質的優良載體。本研究利用Maillard反應，用葡萄糖（glucose，Glu）和SPI制備了糖基化大豆分離蛋白（GSPI）。使用SPI和GSPI負載茶多酚（tea polyphenols，TP），得到負載TP的SPI納米復合物（S-T）和負載TP的糖基化大豆分離蛋白納米復合物（GS-T）。探討了Glu對GSPI的影響，并進一步探討了TP與SPI和GSPI的相互作用。相比于S-T，GS-T平均粒徑更小，穩定性較好，且表現出良好的抗氧化活性。分子間相互作用結果顯示，GS-T可能是通過疏水相互作用形成的，且可能增加蛋白的溶解性。總之，GSPI有希望成為功能食品、飲料和醫藥產品中TP類物質的一種新型有效的載體材料。

關鍵詞：大豆分離蛋白；茶多酚；糖基化；納米復合物

中圖分類號：S529 文獻標志碼：A 文章編號：1008-1038（2024）07-0042-07

DOI：10.19590/j.cnki.1008-1038.2024.07.008

Preparation of SPI-based Tea Polyphenol Nanocomposites and Their Intermolecular Interactions

Abstract： Soybean protein isolate （SPI） is considered to be a plant protein widely used in the food industry due to its function and nutritional value. However， the functionality of native proteins is limited， and the structure of SPI can be modified to serve as an excellent carrier for active substances. In this study， glycosylated soybean protein isolate （GSPI） was prepared with glucose （Glu） and SPI using the Maillard reaction. SPI and GSPI-loaded tea polyphenols （TP） were used to obtain TP-loaded SPI nanocomposites （S-T） and TP-loaded glycosylated soybean protein isolate nanocomplexes （GS-T）. The effect of Glu on GSPI was discussed， and the interaction of TP with SPI and GSPI was further explored. Compared with S-T， GS-T had a smaller average particle size， better stability， and good antioxidant activity. The results of intermolecular interactions suggested that GS-T might be formed through hydrophobic interactions， and increase the solubility of proteins. These results suggested that GSPI had the potential to be a new and effective delivery material for TP-like substances in functional foods， beverages and pharmaceutical products.

Keywords： Soybean protein isolated; tea polyphenols; glycosylation; nanocomposite

豆類蔬菜富含蛋白質且飲食中攝入更多的植物類蛋白（如大豆蛋白）可降低與飲食相關的死亡率[1]。在韓國，人們將大豆作為蔬菜食用[2]。大豆及其制品有著獨特的高蛋白源、豐富的生物活性成分等優點，從而成為大豆科研工作者及廣大消費者關注的焦點[3]。大豆蛋白是大豆中所含的蛋白，是優質營養蛋白資源，其中的大豆分離蛋白（soybean protein isolated，SPI）含蛋白質90%以上，是一種優良的食品原料[4]。但SPI本身功能特性存在一定不足，容易受到外界環境因素的影響。蛋白質改性技術是提高SPI功能性質的必要手段，目前SPI的改性手段可分為物理改性（熱處理、超聲處理、高壓處理、擠壓蒸煮、冷等離子體技術），化學改性（糖基化、酰化和琥珀酰化、磷酸化）和生物/酶改性（酶解、酶交聯、發酵）[5]。在眾多的改性手段中，通過物理或化學手段構建蛋白質與多糖的復合體系，因具有較高的生物相容性和生物安全性而被廣泛地研究與應用。

化學改性中的Maillard反應是一種有前途的蛋白質修飾方法，按其本質而言是氨羰基間的加縮反應，它可以在醛、酮、還原糖及脂肪氧化生成的羰基化合物與胺、氨基酸、肽、蛋白質甚至氨之間發生反應[6]。Maillard反應經過復雜的過程，最終生成棕色甚至是棕黑色的大分子物質類黑精或稱擬黑素，所以又被稱為羰胺反應。除產生類黑精外，還會生成食品色澤和風味的主要來源——還原酮、醛和雜環化合物。幾乎所有含有羰基和氨基食品在加熱條件下均能產生Maillard反應。Maillard反應能賦予食品獨特的風味和色澤，所以，Maillard反應成為現代食品工業密不可分的一項技術，在食品加工業、餐飲服務、食品貯藏和食品營銷等領域廣泛應用[7]。王忠合等[8]用超聲波輔助法促進Maillard修飾并且在與Glu的反應中發現Maillard反應產物的功能特性和抗氧化活性得到了增強。茶多酚（tea polyphenols，TP）是茶葉中多酚類物質的總稱，天然提取的TP抗氧化能力強，無毒副作用且無異味[9]，同時，茶多酚還能通過調節腸道微生物菌群的組成、改善腸道微環境，被廣泛應用于改善腸道健康等方面，成為代謝綜合征治療的熱點選擇[10]。然而，研究發現，TP在人體中穩定性較差。因此，可以采用納米復合體系包埋的方式提高其穩定性[11]。

本實驗對SPI糖基化后負載TP得到納米復合物，測量復合物的粒徑、多分散系數（PDI）、Zeta電位和負載率等指標，再通過紅外光譜和熒光光譜分析其分子間相互作用，并對納米復合物的乳化性和抗氧化活性進行了探索，以期為SPI類植物蛋白和TP類物質在功能性食品領域的應用提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

SPI，南京都萊生物技術有限公司；Glu，國藥集團化藥試劑有限公司；TP（純度97%）、2，2-聯苯基-1-苦基肼基（DPPH），上海麥克林生化科技有限公司；以上試劑均為分析純。

UV-1800PC紫外分光光度計，翱藝儀器（上海）有限公司；TGL-21離心機，四川蜀科儀器有限公司；SCIENTZ-10N/A真空冷凍干燥機，寧波新芝生物科技股份有限公司；JSW-5510LV掃描電子顯微鏡，日本電子株式會社；NICOLET6700傅里葉紅外光譜儀，美國ThermoFisher公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 GSPI的制備

根據張夢玥等[12]的方法稍作修改。配制5%的SPI，600 r/min攪拌2 h后于4 ℃ 冰箱水化過夜得到SPI蛋白分散液。配制SPI與Glu質量比為1∶3的混合體系，磁力攪拌2 h，后置于95 ℃水浴鍋中2 h。待樣品冷卻后抽濾，濾液4 000 r/min離心20 min，取上清液透析48 h，樣液冷凍干燥后得GSPI樣品。

1.2.2 GSPI中的Glu含量的測定

將0.01 g GSPI溶于2.5 mL、6 mol/L鹽酸，置于安瓿管中，然后用氮氣吹去管內空氣以防止氧化。密封后，將安瓿管在100 ℃下培養8.5 h進行酸水解。隨后，立即冷卻樣品并過濾。然后，將1 mL、6 mol/L的NaOH加入1 mL的樣品溶液中進行反應。然后，將0.5 mL的混合溶液和1 mL的DNS試劑混合均勻，沸水浴加熱5 min后立即冷卻。加入4.5 mL蒸餾水后，在540 nm處用分光光度法測量吸光度并繪制標準曲線。通過公式（1）計算GSPI中結合的Glu含量。

Y=23.779X-0.118 6"" （1）

式中，X為Glu含量，mg Glu/g GSPI；Y為在此濃度下的吸光度值。

1.2.3 GS-T納米復合物的制備

根據袁丹等[13]的方法并加以改進。配制質量分數為1%的GSPI樣液，600 r/min磁力攪拌2 h，調節pH至9.0，在95 ℃加熱30 min后立即冷卻，置于離心機中4 000 r/min離心20 min，取上清液即為GSPI樣液。

配制質量分數為1%的GSPI樣液，600 r/min攪拌2 h，調節pH至9.0，加入質量分數0.1%的TP，600 r/min磁力攪拌30 min，后操作同上，即得GS-T。將部分樣液冷凍干燥后磨成粉末備用。此外，用SPI代替GSPI以相同方法制備SPI和S-T樣品參與分析。

1.2.4 包載率（EE）的測定

根據涂曉燕等[14]的方法并加以改進。用蒸餾水配制不同濃度的TP溶液，測定其在280 nm處的吸光度值。以TP的濃度X為橫坐標，吸光度值Y為縱坐標繪制標準曲線，即公式（2）。

Y=16.819X-0.119 2""" （2）

將一定量的GS-T凍干粉溶于蒸餾水，用檸檬酸將樣液pH調至4.5，再4 000 r/min離心20 min，于280 nm處測定吸光度，并使用標準曲線計算TP的含量。根據公式（3）計算TP的EE。

式中，m1和m0分別為1 mL制備的納米復合物中包載TP和總TP的質量，mg。

1.2.5 粒徑、多分散系數（PDI）和Zeta電位的測定

參照王團結[15]的方法，并加以改進。用動態光散射（dynamic light scattering，DLS）測定粒子大小、PDI和Zeta電位。將樣品在室溫下用超純水稀釋至適當體積，在25 ℃下進行測量，所有的測量都平衡120 s。粒度分布是以散射強度為基礎的。

1.2.6 乳化容量和乳化穩定性的測定

（1）乳化容量的測定

根據胡湘蜀[16]的方法并加以改進。將20 mL GS-T樣品溶液與20 mL大豆油充分混合后，10 000 r/min均質1 min，得到GS-T乳化溶液。分別取乳化層高度（H乳1）及溶液總高度（H總1），并計算其乳化容量。以相同方法制備S-T乳化溶液作為對照。乳化容量按公式（4）計算。

（2）乳化穩定性的測定

將（1）中得到的乳化液置于80 ℃水浴30 min，冷卻10 min，1 300 r/min離心5 min，分別量取保持乳化狀態的乳化層高度（H乳2）及溶液總高度（H總2），按公式（5）計算乳化穩定性。

1.2.7 抗氧化活性測定

將2 mL樣品與2 mL DPPH乙醇溶液（0.16 mmol/L）充分混勻后在黑暗中靜置1 h，并在517 nm處測定吸光度（As）。空白吸光度（Ab）和對照（Ac）采用相同的方法測定。空白用乙醇代替DPPH溶液，對照用乙醇代替樣品溶液。自由基清除率按公式（6）計算得出。

1.2.8 傅里葉紅外光譜

將樣品納米復合物粉末與溴化鉀按比例混合，置于研缽內充分研磨，壓片。使用傅里葉變換紅外光譜儀掃描，得到樣品紅外光譜圖。檢測條件：室溫、干燥的環境。掃描范圍：4 000～400 cm-1，分辨率4 cm-1，累加64次，以空氣為背景，每次掃描前剔除背景。

1.2.9 熒光光譜

實驗通過熒光分光光度計對蛋白的內源熒光光譜進行掃描，發射波長掃描范圍為290～500 nm，激發波長為280 nm，掃描速度為240 nm/min，激發狹縫及發射狹縫為5 nm，在25 ℃下進行。

1.3 數據處理

試驗數據均以三次平行測量的“平均值±標準差”表示，采用Excel 2019和Origin 2018進行數據處理及繪圖，采用IBM SPSS Statistics 27，對樣品均值之間進行ANOVA顯著性分析（Plt;0.05）。

2 結果與分析

2.1 GSPI的接糖量

在本研究中，與SPI結合的Glu量為89.20±1.39 mg Glu/g GSPI。杜玉含等[17]用濕發條件利用乳清分離蛋白和Glu發生Maillard反應制備乳液凝膠，得到的Maillard產物親水性增加，抗氧化性顯著提高。除此之外，其最佳接糖量高于本研究所得結果，可能是因為其延長了Maillard反應時間，研究了TP與蛋白之間最佳反應比例，從而得到較好的糖基化產物。

2.2 不同納米顆粒的粒徑、多分散系數和Zeta電位

SPI作為藥物載體的優良選擇，其粒徑和Zeta電位對其在體內的命運有非常關鍵的影響[18]。由表1可知，糖基化處理使SPI粒徑更小，由68.5 nm變成60.1 nm；負載TP后兩者的粒徑增大，可能是TP與蛋白發生反應，增加了蛋白的疏水性內核的體積，從而導致納米粒子的粒徑增大[19]。

PDI通常用來反映粒子的粒徑分布[20]。納米體系的PDI小于0.3時，表明其分散良好，樣液能穩定存在。GSPI和GS-T的PDI分別為0.288和0.292，均小于0.3，表明樣品分散均勻；相比SPI和S-T，糖基化組PDI都有所減小，相比S-T，GS-T分散更均勻，體現出糖基化處理對SPI起到增強穩定性的作用。

SPI和GSPI的Zeta電位分別為-31.0、-25.7 mV，說明糖基化處理使SPI表面所帶的同性電荷變少，靜電排斥作用減弱；而在加入TP后，兩者的Zeta電位分別為-35.1、-37.4 mV，其Zeta電位絕對值均顯著增加，可能是加入TP后，蛋白表面同性電荷增多，蛋白分子疏水基團相互聚集，非疏水基團外露，較低的負電荷表明體系的穩定性增加[21]。結果表明，S-T和GS-T是通過疏水相互作用形成的。

2.3 不同納米顆粒的EE

本實驗得到SPI和GSPI的EE分別為40.3%±0.03%和55.2%±0.07%。GSPI的EE高于SPI，表明蛋白質經過糖基化后，可以提高其對TP的包載效果。原因可能是SPI經過糖基化后，蛋白分子更多的親水基團外露，從而更好地與TP結合，提高了蛋白質的包載能力。有報道稱糖基化可以提高酪蛋白與EGCG的結合能力[22]，與本實驗結果相似。由此可得，糖基化處理能顯著提升SPI與TP的結合能力。

2.4 不同納米顆粒的乳化容量和乳化穩定性

與糖類發生Maillard反應是提升蛋白乳化活性的重要手段[23]，多酚的共價鍵合同樣會影響蛋白的乳化性能。

由圖1可知，SPI與GSPI的乳化容量相差較小，但SPI在與TP結合后其乳化容量下降了約20%，這可能是由于反應過程中TP的羥基與SPI的氨基酸殘基結合，導致蛋白質的結構改變，減弱了SPI與油滴的結合能力，因此乳化容量減小。而GSPI的乳化容量下降較少，可能是糖基化使SPI的蛋白結構改變，使得其與TP結合后暴露在蛋白表面的親水基團相對較少，因此乳化容量下降較少。

此外，相比于SPI和GSPI，S-T和GS-T的乳化穩定性也有所下降，這是因為蛋白質表面吸附大量糖后，蛋白質分子之間的強靜電斥力會產生空間位阻，形成的乳液液滴較小[24]，然而和TP結合之后生成新的大分子物質，破壞了其內部平衡，使得兩者的乳化穩定性皆有不同程度的減小。

S-T and GS-T

2.5 不同納米顆粒的抗氧化性能分析

化合物清除自由基的活性部分是來源于其具有的標準單電子還原電位（E0'），即在標準狀況下這種物質能夠提供氫原子或電子供體，形成分子內氫鍵，使分子結構重排，從而有效穩定自由電子[25]。E0'是體現抗氧化能力的一個重要因素。

如圖2所示，結合蛋白后的S-T和GS-T的自由基清除率皆小于TP，且GS-T自由基清除率大于S-T。前者可能是蛋白與TP內活潑氫結合，形成分子內氫鍵，使TP中E0'減少，和自由基的結合能力減弱，從而導致S-T和GS-T的自由基清除率都比TP小。然而后者可能是因為糖基化使蛋白疏水基團內卷，親水基團暴露出來，有提高蛋白質溶解度的可能性[26]，負載了更多的TP，使得GS-T自由基清除能力強于S-T。DPPH自由基清除實驗表明，將SPI糖基化后再包載TP可提高納米復合物的抗氧化活性。

2.6 不同納米顆粒的傅里葉紅外光譜分析

作為鑒別物質和分析物質結構的有效手段，傅里葉變換紅外光譜已被廣泛用于研究各種物質分子間和分子內部的相互作用。蛋白分子中的不同化學鍵和官能團對紅外輻射的吸收有明顯的差異，因此可根據紅外光譜圖推測蛋白分子結構變化。紅外吸收圖譜中，蛋白質的酰胺I～Ⅲ帶的特征吸收峰分別位于1 658、1 542、1 405 cm處，分別對應C=О鍵伸縮振動、N—H鍵振動、C—N鍵伸縮[27]。

如圖3所示，與SPI相比，在酰胺I～Ⅲ帶處，GSPI的吸收峰強度均增大。這表明，葡萄糖與SPI經Maillard反應后生成的糖基化產物可使酰胺I～Ⅲ帶處的吸收峰強度增加。GSPI的酰胺帶都略有藍移，這可能與糖基化過程中形成新的物質有關。與SPI相比，GSPI在3 000～2 500 cm-1范圍的峰相對較寬，這表明SPI和Glu二者之間發生了相互作用，因此導致了峰形狀的改變。SPI和GSPI在酰胺帶產生區別，說明糖基化改變了大豆分離蛋白的二級結構[28]；在3 600～3 200 cm-1之間和3 500～3 100 cm-1之間有區別，證明糖基化過程中糖分子的羥基會和蛋白分子進行反應，影響了分子中的羥基或氨基等帶有活性氫原子的官能團的數量和位置[29]。

傅里葉紅外光譜表明，SPI的自由氨基與Glu的羰基發生共價結合形成共價鍵，導致糖基化產物的紅外光譜的幾個區域發生變化，蛋白質的酰胺I～Ⅲ帶的特征吸收峰皆有變化，Maillard反應使SPI二級結構改變。

2.7 不同納米顆粒的熒光光譜分析

熒光光譜是一種針對分子微環境進行分析的技術，針對蛋白質的熒光光譜主要集中于對其內源性色氨酸熒光的研究，可以根據其內源性熒光強度判斷多酚類化合物與蛋白質相互作用[30]。色氨酸（Try）、酪氨酸（Tyr）和苯丙氨酸（Phe）被認為是熒光蛋白的發色團。當激發波長為280 nm時，SPI的固有熒光主要來源于Try，蛋白與TP發生相互作用的情況可以根據熒光強度值的變化判斷。

如圖4所示，單獨的SPI、GSPI和TP在280 nm激發時，分別在312.2、335.2、320.4 nm處顯示出強烈的熒光發射峰。與SPI相比，S-T的最大吸收波長由312.2 nm紅移至329 nm；與GSPI相比，GS-T的最大吸收波長由335.2 nm紅移至346.4 nm。此外，負載TP后SPI和GSPI都發生了不同程度的熒光猝滅。

對糖基化反應前后的SPI熒光強度的測定可推測，SPI經過糖基化反應后，大量親水性羥基引入體系中，蛋白結構部分伸展，使更多的Try基團暴露出來，從而增強了蛋白的熒光強度。包載TP后SPI和GSPI都發生了熒光猝滅，則表示TP影響了蛋白中Try的微環境。

3 結論

在這項研究中，通過Maillard反應對SPI表面進行糖基化修飾，制備了GSPI，可作為TP的一種新型載體。結果顯示，糖基化改善了SPI的穩定性，蛋白與TP之間通過疏水相互作用形成納米復合物，且糖基化后的蛋白對TP具有更好的包載效果。與SPI本身負載TP得到的S-T相比，GS-T表現出較優的DPPH自由基清除活性。因此，GSPI是較好的TP類物質的載體，有望成為開發功能食品、飲料甚至醫藥產品中難溶性活性化合物的新型有效的納米載體。

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