沃柑混倍體新種質的鑒定及評價

摘要：【目的】鑒定和評價沃柑變異材料，為利用提供依據。【方法】采用流式細胞儀、石蠟切片和掃描電鏡方法進行倍性和葉片顯微結構鑒定，比較形態特征和果實品質。【結果】變異材料為二、四混倍體（2x+4x），倍性細胞比例為2x∶4x=39.1∶60.9；混倍體的葉片長、寬、周長和面積比二倍體顯著增加14.75%、31.01%、19.38%和46.09%，葉形指數顯著減小12.61%；兩者均為兩性花，花瓣數、花瓣顏色、花絲離合狀態和花柱狀態相同，花瓣長度和寬度均顯著大于二倍體；種子均為單胚類型，單粒質量、橫徑和縱徑較二倍體分別顯著增加30.77%、8.12%和26.64%；單果質量、縱徑、橫徑、果形指數、果皮厚度和果實硬度比二倍體分別顯著增加29.67%、13.38%、8.57%、3.85%、38.31%和16.37%，單果種子數顯著減少61.68%；可溶性固形物和可滴定酸含量無顯著差異，可食率顯著降低，出汁率高，維生素C含量顯著增加39.70%；葉片、下表皮、柵欄組織和海綿組織厚度較二倍體分別顯著增加19.75%、10.10%、9.38%和43.92%，氣孔長度和密度分別顯著減小7.36%和15.76%，氣孔寬度顯著增加5.09%。【結論】鑒定獲得了沃柑二、四混倍體新種質，與二倍體在形態特征、果實品質及葉片顯微結構等方面存在較大差異。

關鍵詞：沃柑；二倍體；混倍體；形態特征；果實品質；顯微結構

中圖分類號：S666.1文獻標志碼：A文章編號：1009-9980（2024）07-1265-10

Identification and evaluation of new mixoploid variants in Citrus reticula-ta‘Orah’

ZHAO Hongtao1，LU Zhen1#，LI Guoguo1，XIE Kaidong2，ZHENG Jixiang3，LIANG Zeng4，LIU Yaoxin1，OU Zhitao1，LIANG Chun4，WANG Jubing3，ZHOU Shuangyun1，CHEN Dongkui1*，CHEN Xiangling1*

（1Horticultural Research Institute，Guangxi Academy of Agricultural Sciences，Nanning 530007，Guangxi，China;2College of Horticul-ture and Forestry Science，Huazhong Agruicultural University，Wuhan 430070，Hubei，China;3Fruit Technology Guidance Station of Guangxi Zhuang Autonomous Region，Nanning 530022，Guangxi，China;4Guangxi Gui Jie Agricultural Development Co.，Ltd.Nanning530041，Guangxi，China）

Abstract：【Objective】Orah（Citrus reticulata）is an important late-maturing citrus variety.Previously，putative polyploid bud mutation materials were discovered in Orah.In this study，the material was iden-tified and evaluated in terms of ploidy，morphological characteristics，fruit quality and leaf microstruc-ture to provide a theoretical basis for its utilization.【Methods】Flow cytometry was used for ploidy identification，the paraffin sections were used for leaf microstructure identification，scanning electron microscopy was used for stomatal morphology，size and density identification，the morphological char-acteristics of leaves，flowers，seeds and fruits were compared，and the conventional methods were used to determine fruit quality parameters such as soluble solids content，titratable acid content，vitamin C content，edible rate and juice yield.【Results】Orah was diploid，while the variant material was a mixo-ploid of diploid and tetraploid（2x+4x），with a cell ratio of 2x∶4x=39.1∶60.9.There were differences in leaf morphology between the mixoploid and diploid.The mixoploid leaves were ovate with short acumi-nate tips and dark green color，while the diploid leaves were broad-lanceolate with gradually acuminate tips.The length，width，perimeter and area of the mixoploid leaves were 101.68 mm，54.29 mm，266.02 mm and 3 598.92 mm2，respectively，which were 14.75%，31.01%，19.38%and 46.09%higher than those of the diploid，respectively.The leaf shape index was 1.87，which was 12.61%lower.Both had bisexual flowers with similar petal numbers，petal colors，filament cohesion states and style states.The petal length and width of the mixoploid were 14.48 mm and 8.22 mm，respectively，which were signifi-cantly larger than those of the diploid，increasing by 34.32%and 49.18%，respectively.The seeds were both monoembryonic，and the mixoploid had higher seed weight，transverse diameter and longitudinal di-ameter than the diploid，increasing by 30.77%，8.12%and 26.64%，respectively.The single fruit weight of the mixoploid was 206.16 g，the longitudinal diameter of fruit was 63.37 mm，the transverse diameter was 77.90 mm，the fruit shape index was 0.81，the peel thickness was 4.26 mm，and the fruit firmness was 6.47 kg·cm-2，which were 29.67%，13.38%，8.57%，3.85%，38.31%and 16.37%higher than those of the diploid，respectively.However，the number of seeds per fruit was 8.2，which was 61.68%lower than that of the diploid.There were no significant differences in soluble solids content（15.10%）and ti-tratable acid content（0.58%）between the mixoploid and diploid.The edible rate decreased by 8.09%，the juice yield increased by 4.34%，and the vitamin C content increased by 39.70%.The cellular ar-rangement of the transverse section tissue structure of the mixoploid leaves was basically the same as that of the diploid.The thicknesses of the leaf，upper epidermis，lower epidermis，palisade tissue and spongy tissue were 310.96μm，12.26μm，72.89μm and 227.94μm，respectively，which were 19.75%，4.15%，10.10%，9.38%and 43.92%higher than those of the diploid，respectively.The stomatal length and density were 7.35μm and 520.40 per mm2，respectively，which were 7.36%and 15.76%lower，re-spectively.The stomatal width was 3.33μm，which was 5.09%higher.【Conclusion】In this study，a new mixoploid germplasm of Orah with diploid and tetraploid was identified.There were significant differences between the mixoploid and diploid in leaf，flower，seed，fruit morphology，fruit quality and leaf microstructure.Overall，the mixoploid showed larger and thicker leaves，increased petal length and width，increased seed weight，transverse and longitudinal diameters，but reduced number of seeds per fruit.The thicknesses of the leaf，upper and lower epidermis，palisade tissue and spongy tissue in-creased，while the stomatal length and density decreased and the stomatal width increased.Additionally，there were increases in single fruit weight，fruit transverse and longitudinal diameters and vitamin C content.This mixoploid can be used as a new type of single-embryo type of small-nucleus and large-fruit Orah，and can also be further used as a new germplasm resource for breeding program.

Key words：Orah（Citrus reticulata）;Diploid;Mixed ploidy;Morphological characteristics;Fruit quali-ty;Microstructure

沃柑（Citrus reticulata‘Orah’）為單胚性的二倍體品種[1]，具有樹勢強、早結豐產、晚熟、品質優良、外觀漂亮等優點。該品種于2012年首次引種到廣西南寧種植，因其優異的表現而成為當前我國發展速度最快、種植面積最廣、影響力最大的晚熟柑橘品種，截至2022年，全國沃柑種植面積已超過20萬hm2。但沃柑在生產上的主要問題是果實種子較多，平均單果種子數約18.9粒[2]，嚴重影響其食用性和商品性，且沃柑對潰瘍病敏感，已成為沃柑種植中最嚴重的病害[3]。

混倍體（mixed ploidy）是在同一生物組織中有二倍性與非二倍性組織混存的現象[4]。在果樹中，混倍體可自然發生，也可以通過嫁接、基因突變、轉座子作用、原生質體培養、轉基因等獲得[5]。混倍體植株由于具有更多的染色體組，相關基因表達量得到提高，其性狀也會因此發生變化，往往表現為根、莖、葉、花、果的巨型性，具有果實增大、種子數減少、品質改良、抗逆性增強等優勢。劉穎等[6]從冬棗中發現3個二、四混倍體（2x+4x）大果型變異材料，表現出葉片變寬、葉形指數變小，果實變大，果實維生素C含量增加等特性；人工誘導的混倍體桑樹魯誘1號細胞染色體以四倍體為主，混有少量的二倍體，表現出嵌合體效應，既有四倍體葉質優、葉片大、葉肉厚的特點，又有二倍體母本生長旺盛的優點[7]；陳立松等[8]首次報道了一個穩定遺傳的椪柑突變體桂林良豐，是四倍體與二倍體兩種倍性的混倍體，表現出果皮增厚、果實增大、葉片變厚、氣孔密度減少等性狀[9]；二倍體和四倍體的嵌合體品種脆蜜金柑表現出大果、高糖、無核、品質極優等特點[10]，已經成為廣西金橘的主栽品種。

近年來，柑橘倍性育種及研究取得了較大進展，尤其是大量同源、異源多倍體的篩選和創制，為柑橘新品種選育和基礎研究提供了豐富的材料，然而，單胚類型的柑橘多倍體仍然較少[11]。筆者團隊前期從沃柑中挖掘到一株沃柑芽變材料，為進一步確定和利用該種質，筆者對其倍性進一步進行鑒定，并系統比較其與沃柑在葉片、花、種子、果等器官的表型、果實品質及葉片顯微結構的差異，為未來更好地開發利用該多倍體新種質提供數據基礎。

1材料和方法

1.1試驗材料

2017年在廣西百色市平果縣沃柑果園中發現1株沃柑芽變材料，該材料樹勢強健，葉片卵圓形、大、厚而濃綠，果實大，種子較少。當天剪取芽變接穗進行嫁接擴繁，同時嫁接對照品種沃柑，砧木均為香橙，成活后種植在廣西南寧市武鳴區廣西農業科學院里建科學研究基地內，2020年開花結果，于2022年選擇該材料及對照品種沃柑開展評價。

1.2測定方法

1.2.1倍性鑒定參照解凱東等[12]的方法進行。

1.2.2形態特征比較參照《柑橘種質資源描述規范和數據標準》[13]，比較葉片、花、種子、果實主要形態特征，利用萬深全功能植物圖像分析儀LA-S掃描測量葉片的長度、寬度、周長、面積等指標，計算葉形指數，葉形指數=葉片長度/葉片寬度；用托普云農GY-4硬度計測定果實硬度。葉片、花、種子、果實每10個為1個生物學重復，每個測定指標3次重復。

1.2.3果實品質測定果實成熟期，取樹冠外圍中部生長的大小、均勻一致、有代表性的成熟果實，采用日本ATAGO公司的PAL-1便攜式數顯折光儀測定可溶性固形物含量，采用酸堿滴定法測定果汁可滴定酸含量[14]，采用2，6-二氯靛酚法測定果汁維生素C含量[15]，計算可食率、出汁率，每10個果實為1個生物學重復，每個測定指標3次重復。

1.2.4葉片解剖結構觀測采用石蠟切片觀察葉片解剖結構[16]。摘取待測葉片，將葉片避開葉脈切成0.5 cm2小塊狀，用FAA固定液（福爾馬林5 mL+乙酸5 mL+70%乙醇90 mL）固定樣品1周，脫水，透明后用石蠟包埋，切片，脫蠟，復水。顯微鏡鏡檢合格后使用Eclipse Ci-L拍照顯微鏡（Nikon，日本）選取組織的目的區域進行200倍成像。成像完成后使用Image-Pro Plus 6.0分析軟件，以μm作為標準單位，測量葉片厚度、上表皮厚度、下表皮厚度、柵欄組織厚度、海綿組織厚度。

葉片氣孔特征和密度觀測[17]：利用掃描電鏡進行葉片表皮氣孔特征觀察。選取同一節位處的葉片，將其切成0.5 cm2小塊狀，用2.5%戊二醇固定，后經脫水、干燥，再進行導電處理，最后用SU8100掃描電子顯微鏡（Hitachi，日本）觀察葉片下表皮的氣孔形態特征，應用Image-Pro Plus 6.0軟件測量計算氣孔長度、寬度以及氣孔密度（個·mm-2）。

1.3數據統計分析

采用Excel 2016處理試驗數據，使用DPS 20.0版本以Duncan新復極差法進行指標間的差異顯著性分析。

2結果與分析

2.1倍性分析

以二倍體沃柑為對照，在熒光強度100處只有1個二倍體主峰（圖1-A），而沃柑少核大果型芽變材料有2個主峰，峰位置分別在熒光強度100和200處，且第2個峰強度為第1個峰強度的2倍，為四倍體峰，說明其為二、四混倍體，而且以4x細胞占優勢（圖1-B），其中2x細胞數1199個，占比39.1%，4x細胞數量1867個，4x細胞占60.9%。

2.2形態特征比較

2.2.1葉片形態特征比較葉片形狀如圖2所示，混倍體沃柑葉片為卵圓形，葉尖短尖，葉片顏色也更加濃綠；二倍體沃柑葉片為闊披針形，葉尖漸尖。混倍體沃柑的葉片長度為101.68 mm、寬度54.29 mm、周長266.02 mm及葉片面積為3 598.92 mm2，與二倍體沃柑相比分別顯著增加14.75%、31.01%、19.38%和46.09%，而葉形指數為1.87，與二倍體沃柑相比顯著減少12.61%（表1）。可見隨著倍性的增加，葉片變長、變寬，葉形指數變小。

2.2.2花性狀分析混倍體和二倍體沃柑的花均為兩性花，二者的花瓣數、花瓣顏色、雄蕊數、花絲離合狀態以及花柱狀態均相同（圖3），混倍體沃柑花瓣長度為14.48 mm，寬度為8.22 mm，與二倍體沃柑相比，分別顯著增加34.32%和49.18%（表2），混倍體沃柑表現出花朵較大的特性。

2.2.3種子性狀混倍體和二倍體沃柑的種子呈棒

形或卵圓形，均為單胚（圖4），混倍體的種子單粒質量0.17 g、橫徑6.39 mm、縱徑14.64 mm，均顯著大于二倍體，分別比二倍體增加30.77%、8.12%和26.64%（表3）。

2.2.4果實形態比較如圖5所示，混體倍沃柑及二倍體沃柑均表現為果皮橙紅色，果肉橙黃色，混體倍果實表面光滑度較二倍體稍差，混倍體單果質量206.16 g，果實縱徑63.37 mm，橫徑77.90 mm，果形指數0.81，果皮厚度4.26 mm，果實硬度6.47 kg·cm-2，單果種子數8.2粒。混倍體的單果質量、果實縱徑、果實橫徑、果形指數、果皮厚度、果實硬度指標均顯著大于二倍體，分別增加29.67%、13.38%、8.57%、3.85%、38.31%和16.37%，而單果種子數顯著減少61.68%（表4），可以看出混倍體果實較二倍體顯著增大，形狀變圓，果皮變厚，果實變硬，種子數變少。

2.3果實品質分析

由表5可知，混倍體沃柑可溶性固形物含量（w，后同）為15.10%，可滴定酸含量為0.58%，與二倍體沃柑相比無顯著差異，可食率為69.84%，與二倍體相比顯著降低，減少6.15個百分點，這可能與有較厚的果皮有關；混倍體沃柑出汁率高，表現出水分更足，但與二倍體沃柑差異不顯著；維生素C含量（ρ）為23.12 mg·100 mL-1，顯著高于二倍體沃柑的16.55 mg·100 mL-1，增加率高達39.70%，部分營養更加豐富。

2.4葉片顯微解剖結構觀測

如圖6所示，混倍體與二倍體沃柑葉片橫切面組織結構的細胞排列順序基本相同，上、下表皮組織由1層圓形或近圓形的細胞組成，排列整齊，柵欄組織和海綿組織分化明顯，柵欄組織靠近上表皮，由2～3層緊密排布的長條形細胞組成，海綿組織靠近下表皮，形狀短圓形，排列不整齊且較為松散。由表6可知，混倍體的葉片厚度310.96μm、下表皮厚度12.26μm、柵欄組織厚度72.89μm和海綿組織厚度227.94μm，均顯著高于二倍體，分別增加19.75%、10.10%、9.38%和43.92%，上表皮厚度也增厚，但未達到顯著差異。

掃描電鏡觀察氣孔特征顯示（圖7，表7），混倍體的葉片氣孔長度為7.35μm，寬度為3.33μm，氣孔密度為520.40個·mm-2，與二倍體相比，氣孔長度和氣孔密度分別減少7.36%和15.76%，差異顯著，而氣孔寬度較二倍體顯著增加5.09%。

3討論

倍性鑒定是果樹倍性育種的重要環節，目前，倍性鑒定的方法有很多，一般可以通過形態特征、細胞學、染色體計數法、分子標記法、流式細胞儀法等其中一種或多種方法進行鑒定[18]。Galbraith等[19]首次報道了利用流式細胞儀快速、準確地測定植物倍性水平，經過多年的不斷發展，現如今已被廣泛應用并已逐步替代了傳統的染色體計數法[20]。研究人員利用該方法對蘋果、柑橘[21]、棗、柿、葡萄、獼猴桃、梨[22]等果樹資源鑒定出不同的倍性材料。對于混倍體植株，流式細胞儀可以快速檢測出不同倍體細胞類型和各種細胞類型所占的比例。在本研究中，筆者從二倍體沃柑中發現葉片增大、果實變大、種子數減少等性狀的變異材料，初步認為具有多倍性性狀，再通過流式細胞儀對其倍性進行確認，結果變異材料為二、四混體倍，且二倍體與四倍體細胞比例約為4∶6，與親本沃柑的倍性存在差異。因此，通過形態學鑒定方法初選出多倍體變異植株后，再進一步利用流式細胞儀進行倍性檢測是一種快速且有效的方法。

混倍體植物常表現出異于正常倍性植株的特性，出現一些器官“巨大化”，主要表現在葉片、花朵、果實、種子以及氣孔等特征上。吳改娥[23]分析了二倍體與四倍體棗樹葉片形態，發現四倍體棗樹的葉片比二倍體棗樹的葉片更大更寬。汪衛星等[24]研究發現三倍體枇杷的樹體干周、枝條、葉片和花器官性狀均顯著大于二倍體。四倍體雜交鵝掌楸與二倍體相比形態上發生明顯變化，包括葉片變大變厚、葉色加深、氣孔變大等[25]。在本研究中，隨著沃柑倍性增加，出現植株葉片顯著變大增厚、葉形指數減小、葉色加深、花朵增大、果實增大、種子減少等變化特點，與上述研究有類似結果，可作為前期倍性鑒定的重要篩選依據，在大規模倍性鑒定中能較大程度減少育種人員的工作量。

多倍體植物的表型變異在一定程度上反映了植物對環境的生理適應性，通過改變組織結構來提高植株的抗病抗逆性，其中，植物葉片組織結構是種質資源評價的重要依據之一[26]。多倍體顯微結構發生改變，巨大化特征表現突出[27]，二、四混倍體芽變品種金冠酥的葉片、莖細胞比二倍體母本酥梨大[28]。潰瘍病作為沃柑最主要的病害，氣孔作為病原菌侵入的重要途徑，其密度、面積與柑橘對潰瘍病的抗性呈顯著負相關，葉片厚度及葉片柵欄組織、海綿組織、上下表皮厚度等在內的多項形態學指標均與柑橘抗潰瘍病能力呈極顯著正相關[29]。本研究結果表明，沃柑混倍體的葉片厚度、葉片上下表皮、柵欄組織和海綿組織的厚度均大于二倍體，氣孔密度顯著減小，意味著有較強的抗逆性，且在實際生產中，筆者也觀察到田間混倍體植株對潰瘍病的抗性明顯強于二倍體，這可能與混倍體葉片結構的改變有關，混倍體的抗病性將作為下一步的研究目標。

植株果實營養品質的優劣是衡量其價值的重要指標，植物多倍體不僅改變了植株的形態，而且改變了果實的營養品質。黃金艷等[30]對不同倍性甜瓜果實品質進行比較研究，發現四倍體維生素C含量高于三倍體和二倍體，可溶性蛋白和可溶性糖含量具有相同的趨勢，依次為三倍體＞四倍體＞二倍體。亦有研究學者發現四倍體茄子的果實維生素C、蛋白質、脂肪含量較二倍體品種分別增加了74.38%、34.22%和31.30%[31]；維生素C是一種具有多功能的代謝物質，人體不能自身合成，必須從食物中獲取，因此維生素C含量已成為衡量果實品質和影響人們選購果品的重要指標。人類日常膳食攝入的維生素C也主要來源柑橘類水果[32]，在本研究中，混倍體沃柑的維生素C含量達到23.12 mg·100 mL-1，顯著高于二倍體沃柑的16.55 mg·100 mL-1，增加率高達39.70%，表現出營養物質更加豐富的特征。

4 結論

混倍體與二倍體沃柑在葉、花、種子、果實形態、果實品質以及葉片顯微結構等方面存在較大差異，具體表現在混倍體沃柑葉片變大變厚，花瓣長度和寬度增大，種子單粒質量、橫徑和縱徑增加而單果種子數減少，葉片、上表皮、下表皮、柵欄組織、海綿組織厚度增厚，氣孔長度和密度減小，氣孔寬度增加，單果質量、果實橫縱徑、維生素C含量增加。該混倍體既可作為單胚型少核大果沃柑的新類型加以利用，也可作為新的種質資源進一步用于育種工作。

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