桃（Prunus persica）砧木抗南方根結線蟲分子標記開發與利用

摘要：【目的】南方根結線蟲是威脅桃產業綠色發展的地下主要害蟲，開發抗性分子標記，對抗性砧木分子育種具有重要意義。【方法】根據前人對桃砧木抗根結線蟲的定位結果，在GDR網站peach genome V2.0查詢定位區間的候選基因。在5個抗病、5個感病種質中擴增候選基因，并通過DNAMAN、IGV等軟件對候選基因進行序列差異分析，開發抗南方根結線蟲KASP分子標記，在抗性種質筑波3號與感性種質哈露紅的雜交F2群體中對該分子標記進行驗證，并與前人開發的SCAR和35bp indel抗南方根結線蟲分子標記的準確性進行比較。【結果】KASP標記結果將基因型劃分為3種，分別為抗性純合型（A），抗性雜合型（B），感性純合型（C），A∶B∶C=42∶94∶64，與表型符合率為88.5%；SCAR標記檢測結果劃分為2種，分別為抗病型（A1）和感病型（C1），A1∶C1=135∶65，與表型符合率為87.0%；35bp indel分子標記分為3種類型，分別為抗性純合型（A2），抗性雜合型（B2），感性純合型（C2），A2∶B2∶C2=1∶154∶45，與表型符合率為52.0%。【結論】本研究中開發的KASP標記提高了分子標記選擇準確率，對抗南方根結線蟲分子育種具有重要意義。

關鍵詞：桃；KASP標記；南方根結線蟲；抗性

中圖分類號：S662.1文獻標志碼：A文章編號：1009-9980（2024）07-1429-

Development and utilization of molecular markers for resistance of peach（Prunus persica）rootstocks to southern root-knot nematodes

WANG Huimin1，LI Yong2，3，WU Jinlong2，LI Wenqing2，CAO Ke2，WANG Xinwei2，3，WANG Lirong2，3*

（1School of Horticulture and Forestry，Tarim University，Alar 843300，Xinjiang，China;2Zhengzhou Fruit Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Zhengzhou 450009，Henan，China;3Institute of Western Agricultural，Chinese Academy of Agricultur-al Sciences，Changji 831100，Xinjiang，China）

Abstract：【Objective】Meloidogyne incognita is an underground pest threatening the development of peach industry.It is of great significance to develop molecular markers for the resistance to the pest for breeding new rootstocks.【Methods】According to the mapping results of peach rootstocks published by the predecessors，the candidate genes in the mapping interval were queried in GDR website Peach Ge-nome V2.0.The candidate genes were amplified by PCR in five resistant germplasm Nemaguard，Oki-nawa，Tsukuba 2，Tsukuba 3 and Shouxingtao 1，and five susceptible germplasm Bailey，Kashi 1，Kashi 2，Harrow Blood and Siberian C.The target fragments of PCR products were purified，ligated and se-quenced by agarose gel electrophoresis.The hybrid F2 population of disease-resistant germplasm Tsuku-ba 3 and susceptible germplasm Harrow Blood was inoculated with M.incognita，and the phenotypes of the population were investigated three months later to verify the accuracy of the KASP marker，and compared with the accuracy of molecular markers developed by the predecessors for the resistance to Meloidogyne incognita in SCAR and 35 bp indel.【Results】Six candidate genes were found through previous studies，namely Prupe.2G055500，Prupe.2G055600，Prupe.2G055700，Prupe.2G055800，Prupe.2G055900 and Prupe.2G056000.Through sequence comparison，it was found that there were regular variations in the resistant and susceptible varieties of the gene Prupe.2G055500，and there was a 2 bp indel variation（Pp02：6 601 310 bp，G→GAT）in its intron，and at insertion existed in the resistant varieties，but not in the susceptible varieties.In addition，using IGV software，with v2.0.a1 version as the reference genome，the same results were found in 10 resequencing data of peach germplasm materi-als.A molecular marker for genotyping was developed by using the above mutation sites.Five resistant germplasm and five susceptible germplasm were detected by this marker.The results showed that FAM and HEX fluorescence signals were simultaneously detected in the resistant germplasm Nemaguard，and the signal point was red，and the genotype was AT/--;The signal points of resistant germplasm Oki-nawa Tsukuba2 Tsukuba3 Shouxingtao 1 are green，aggregated near the Y axis，and the genotype is AT/AT;The signals of sensitive germplasm Bailey Kashi 1 Kashi2 Harrow Blood Siberian C are blue，ag-gregated near the X axis，and the genotype is--/--.The detection results of KASP marker in F2 popula-tion divided the genotypes into three types，green fluorescence was homozygous for resistance（A），red fluorescence was heterozygous for resistance（B），blue fluorescence was homozygous for sensibility（C），and A∶B∶C=42∶94∶64 was close to 1∶2∶1，which was consistent with separation of mendelian law.The detection results of SCAR markers in F2 population were also divided into two types.The ma-terials with target bands were resistant（A1），and the materials without target bands were sensitive（C1），and A1∶C1=135∶65，which did not conform to separation phenomenon.Three bands can be amplified by 35 bp indel marker in F2 population.Taking Hong Gen Gan Su Tao 1 as control，one band in the same position is classified as A2，two corresponding bands in the same position are classified as B2，and no band in the same position is classified as C2，and A2∶B2∶C2=1∶154∶45，which is not in confor-mity with separation phenomenon.The phenotypic survey ofF2 population showed that the ratio of root-less nodules to rootless nodules was 147：53.Based on the phenotypic investigation results ofF2 popula-tion resistance to Meloidogyne incognita，the selection efficiency of three markers was evaluated.The results showed that the selection coincidence rate of KASP for resistant materials was 95.6%，that of susceptible materials was 73.4%，and the total coincidence rate was 88.5%.The selection coincidence rate of SCAR marked as resistant material is 94.8%，that of scar marked as sensitive material is 70.8%，and the total coincidence rate is 87.0%.The selection coincidence rate of 35 bp indel marked as resis-tant materials was 66.5%，and the total coincidence rate was 52.0%.Among the three molecular mark-ers for resistance to Meloidogyne incognita，the correct rate of KASP molecular marker was the highest，followed by SCAR marker，and the correct rate of 35 bp indel marker was the lowest.【Conclusion】Based on the mapping results of resistance genes of cultivated peaches to Meloidogyne incognita，this study developed a KASP molecular marker，which was verified in the F2 population.It was found that the KASP molecular marker developed in this study had the highest accuracy compared with the molec-ular marker developed by predecessors.The development of this marker improves the selection efficien-cy of resistant varieties and provides resources for accelerating molecular breeding.

Keywords：Peach;KASP marker;Meloidogyne incognita;Resistance

根結線蟲是一種重要的植物寄生性線蟲，主要危害作物根系[1-2]，嚴重影響農業生產。在桃產業中，根結線蟲感染會導致樹勢衰弱、果實產量和品質降低，甚至死樹。南方根結線蟲是危害我國桃樹的主要線蟲種類[3]。對比傳統化學防治方法，選用抗性砧木是解決根結線蟲危害問題的根本途徑。前人研究發現野生種質紅根甘肅桃1號（P.kansuensis）對南方根結線蟲完全免疫，山桃（P.davidiana）以及壽星桃1號（P.persica）對南方根結線蟲高抗[4]。

近年來，分子標記輔助育種在植物中得到廣泛應用，顯著提高了選擇的準確性，縮短了育種周期。李肯等[5]利用indel分子標記檢測32份甜瓜基因型，檢測結果與表型符合率極高；吳翼等[6]利用分子標記對100株香水椰子的純度進行檢驗，發現分子標記結果與表型鑒定完全吻合，可用于鑒定苗期香水椰子的純度；劉廣等[7]利用篩選到的3個分子標記檢測20份西瓜材料抗枯萎病情況，檢測結果與表型基本一致。由于不同研究者利用的遺傳群體不同，因此得到的標記與性狀連鎖距離的遠近不同，甚至位于不同的染色體上[8]。在桃上，為獲得與桃抗南方根結線蟲緊密連鎖的標記，劉偉[9]利用分子標記將紅根甘肅桃抗南方根結線蟲基因定位在LG5（linkage group，LG），緊密連鎖M3E15-300標記；Cao等[10]、張倩[11]利用多種分子標記如SSR、RGA等將野生種質紅根甘肅桃1號的抗南方根結線蟲基因PkMi定位到2號染色體頂端，位于兩個標記NBS29與NBS3之間，連鎖SSR的標記UDP98-025，隨后通過標記加密鑒定到了紅根甘肅桃抗南方根結線蟲關鍵基因并加以驗證。Duval等[12]利用[（Pamirskij×Rubira）×（Mont-clar×Nemared）]的雜交群體，將栽培桃（P.persica）抗性基因定位在2號染色體，但與野生種質紅根甘肅桃1號抗性基因位置不同，位于A20 SNP和SNP_APP91標記之間，約92kb，關鍵基因尚不明確。

栽培桃是桃砧木的最重要類型。筆者在本研究中基于Duval等[12]對栽培桃抗南方根結線蟲的定位結果，擬通過定位區間內序列差異比較，鎖定候選關鍵基因，開發抗南方根結線蟲的相關分子標記，以期在抗南方根結線蟲砧木育種中應用。

1材料和方法

1.1試驗材料

5個表型為抗南方根結線蟲的品種：列瑪格、阿克拉娃、筑波2號、筑波3號、壽星桃1號；5個表型感性品種：貝蕾、喀什1號、喀什2號、哈露紅、西伯利亞C[13]。雜交F2代群體為筑波3號（抗）×哈露紅（感）。

線蟲材料取自中國農業科學院鄭州果樹研究所桃園，鑒定為南方根結線蟲后接種至番茄苗中進行繁殖備用。

1.2候選基因的確認

通過Duval等[12]對栽培桃的定位結果，桃抗根結線蟲基因在標記A20SNP與SNP_APP91的92kb區間內，通過GDR網站在peach genome V2.0中對該候選序列進行BLAST找到對應區域包含的所有候選基因共6個。利用IGV可視化和Excel表查看10份種質的基因組重測序結果，挑選具有規律性序列差異的基因進行下一步驗證[14]。

1.3葉片DNA的提取、PCR擴增及測序

采集筑波3號（抗）×哈露紅（感）F2群體（共200株）及10份種質的葉片，用CTAB法提取DNA。DNA的質量與濃度用紫外分光光度儀NanoDrop 1000 spectrophotometer（Themo Scientific）測定，利用無菌水將其稀釋至100～200 ng·μL-1后保存至-20℃。在10份種質中對候選基因進行基因組序列擴增（擴增引物見表1），擴增模板為H2O 7μL，上、下游引物各1μL，1μL DNA以及10μL Mix（南京諾唯贊生物科技股份有限公司，南京）。擴增條件按照Mix說明書進行。PCR產物通過凝膠電泳后，參考韋瑩華等[15]的方法稍作修改，將產物進行回收、連接載體、挑取單克隆并通過陽性鑒定后將菌液交由生工生物工程（上海）股份有限公司測序、拼接，查看序列差異的軟件為DNAMAN。

1.4 KASP標記基因分型

競爭性等位基因特異性PCR（KASP）擴增參考吉爽秋等[16]的方法，所用熒光為六氯熒光素（hexachlo-rouorescein，HEX）和羧基熒光素（carboxy fluorescein，FAM），引物序列見表2。

1.5 2個分子標記的檢測

采用前人開發的SCAR分子標記和35bp indel分子標記檢測200株實生苗抗南方根結線蟲情況[17-18]。利用2個標記分別對200株實生苗進行PCR序列擴增（引物見表3），SCAR標記檢測結果通過凝膠電泳查看，35 bp indel分子標記檢測結果通過聚丙烯酰胺凝膠電泳查看。

1.6 F2群體表型的調查

參考吳波鴻[19]的方法稍作修改，收集番茄根上繁殖的南方根結線蟲蟲卵，在28℃培養箱孵化5d后收集南方根結線蟲二齡幼蟲（J2）制成線蟲懸浮液于50 mL離心管中，隨后在顯微鏡下確認該懸浮液濃度為50頭J2·100μL-1。對20株桃苗進行南方根結線蟲的接種，每盆接種3 mL。接種后定期對溫室的桃苗進行管理，3個月后調查表型，觀察桃苗有無根結。

1.7 3個單一標記在雜交群體中的選擇符合率

抗性符合率=標記為抗性的F2群體中表型為無根結的個數/標記檢測為無根結的群體總數；感性符合率=標記為感性的F2群體中表型為有根結的個數/標記檢測為有根結的群體總數。

2結果與分析

2.1候選基因的確認及序列差異分析

根據Duval等[12]對栽培桃抗南方根結線蟲的定位結果，找到了6個候選基因即Prupe.2G055500、Prupe.2G055600、Prupe.2G055700、Prupe.2G055800、Prupe.2G055900和Prupe.2G056000。利用重測序數據查看候選基因的序列差異情況，發現基因Prupe.2G055500在抗感品種中存在規律性變異位點。為進一步驗證，筆者在5個抗性和5個感性品種中對該基因進行擴增、測序，經軟件DNAMAN比對后發現基因Prupe.2G055500在抗、感品種中確實存在規律性變異，其內含子上存在一個2bp的ins變異（Pp02：6 601 310 bp，G→GAT），抗性品種存在AT插入，感性品種無（圖1）；另外，以v2.0.a1版本為參考基因組，通過IGV軟件查看10份桃種質材料的重測序數據，并進行序列的比對、分析，發現了同樣的結果（圖2），表明該插入具有高度準確性。

2.2 KASP分子標記的開發與檢測

結合上述對候選基因序列的比對結果，筆者在該位點開發了一個用于基因分型的KASP分子標記。利用該標記對5份抗性種質和5份感性種質進行目標位點基因型檢測，發現抗性種質列瑪格同時檢測到FAM和HEX熒光信號，信號點為紅色，基因型為AT/--；抗性種質阿克拉娃、筑波2號、筑波3號和紅壽星信號點為綠色，聚合在y軸附近，基因型為AT/AT；感性種質喀什1號、貝蕾、喀什2號、哈露紅和西伯利亞C的信號為藍色，聚合在x軸附近，基因型為--/--。

為檢驗KASP分子標記的適用性和有效性，利用抗性材料筑波3號和感性材料哈露紅的F2代200株個體進行驗證。利用KASP標記對每份單株進行目標位點基因型檢測，結果顯示該群體有3種基因型，把熒光信號為綠色的顯性純合類基因型記為A，熒光信號為紅色的顯性雜合類基因型記為B；熒光信號為藍色的隱性純合類基因型記為C（圖3）。200株實生苗的基因分型結果如下：A類的材料有42份，占總群體的21.0%；B類的材料有94份，占總群體的47.0%；C類的材料有64份，占總群體的32.0%。抗性純合（A）∶抗性雜合（B）∶感性（C）=42∶94∶64，接近1∶2∶1。經卡方檢驗可知χ2=5.56，p值＞0.05，結果表明內含子的插入與根結線蟲抗性顯著相關，說明該分子標記符合孟德爾分離定律，且抗南方根結線蟲基因為顯性遺傳，與前人研究結果較一致[20]。

2.3 SCAR、35 bp indel分子標記檢測結果

利用前人已開發的SCAR標記[17]、紅根甘肅桃35 bp indel[18]分子標記對F2群體200株實生苗進行基因分型。通過瓊脂糖凝膠電泳查看SCAR標記結果，將結果劃分為A1、C1兩類。其中A1為抗南方根結線蟲，C1為感南方根結線蟲。部分SCAR標記結果如圖4所示，擴增出A1類條帶的材料有135份，占總群體的67.5%；擴增出C1類條帶的材料有65份，占總群體的32.5%。即SCAR分子標記檢測結果為抗南方根結線蟲的植株有135株，對南方根結線蟲感性的植株有65株，經卡方檢驗可知χ2=6.00，p值＜0.05，不符合分離定律。

通過聚丙烯酰胺凝膠電泳35bp indel分子標記擴增出了3種類型的條帶，分別記為A2、B2、C2。部分標記檢測結果如圖5所示，以抗性材料紅根甘肅桃1號為對照，在該位點有1條帶記為A2類，在該位點有對應2條帶記為B2類，在該位點無條帶則記為C2類。結果顯示，擴增出A2類型條帶的材料有1份，占總群體的0.5%；擴增出B2類型條帶的材料有154份，占總群體的77.0%；擴增出C2類型條帶的材料有45份，占總群體的22.5%，A2∶B2∶C2=1∶154∶45。標記結果表明200株實生苗中抗根結線蟲的有155株，感性的有45株，抗∶感≈3∶1，卡方檢驗顯示χ2=0.67，p值＞0.05，該位點的缺失與根結線蟲的抗性有顯著相關性。在聚丙烯酰胺凝膠電泳結果中顯示超過2/3的植株在該處均有2條帶，說明該群體在此處的基因型大多為雜合。

2.4 3個分子標記的選擇效率分析

對F2群體接種南方根結線蟲，3個月后調查該群體對南方根結線蟲的抗性情況。結果如表4所示，無根結與有根結之比為2.77∶1，經卡方檢驗可知χ2=0.24，p值＞0.05，該群體符合孟德爾遺傳定律。基于F2群體對南方根結線蟲抗性的表型調查結果，評價3個標記的選擇效率。從表5中可以看出，具有KASP標記的A類抗性基因型材料有42份，其中表型鑒定為抗性的材料有41份，抗性選擇符合率為97.6%；具有KASP標記的B類抗性基因型材料有94份，表型鑒定為抗性的材料有89份，抗性選擇符合率為94.7%；具有KASP標記的C類感性基因型材料有64份，表型鑒定為感性的材料有47份，感性選擇符合率為73.4%，總符合率達到88.5%。具有SCAR標記的A1類抗性帶型的材料有135份，其中表型鑒定結果為抗性的材料有128份，抗性選擇符合率為94.8%；具有SCAR標記的C1類感性帶型的材料有65份，表型鑒定為感性的材料有46份，感性選擇符合率為70.8%，總符合率也達到87.0%。具有35 bp in-del分子標記為A2類抗性帶型的材料有1份，無表型鑒定為抗性的材料，抗性表型選擇符合率為0；具有35 bp indel分子標記為B2類的抗性帶型材料有154份，表型鑒定為抗性的材料有103份，抗性選擇符合率為66.9%；具有35 bp indel分子標記為C2類的抗性帶型的材料有45份，表型鑒定為感性的材料只有1份，感性選擇符合率為2.2%，總符合率為52.0%。總之，3個抗南方根結線蟲分子標記中，KASP分子標記檢測的正確率最高；SCAR標記次之，但同樣正確率較高；35bp indel分子標記的正確率最低。

3討論

目前已報道的、能完全用于商業化生產的抗根結線蟲基因很有限，野生秘魯番茄中的Mi基因運用最廣泛[21]。在育種改良過程中，研究者利用不同分子標記檢測了供試番茄中的Mi基因，發現檢測結果差異明顯，有的檢測方法如CAPS檢測Mi基因的時候存在明顯假陽性，而另一種標記方法即SCAR標記檢測相比之下更穩定、便捷[22-25]。在李屬植物中，Ma、Rmia、Rmja為已知的抗線蟲基因。目前桃的抗性基因Rmia能完全抑制根結線蟲繁殖和根結線蟲蟲癭的形成，對南方根結線蟲、大豆根結線蟲都具有抗性[26-27]。Duval等[28]利用分子標記評估該基因對尚未檢測過的埃塞俄比亞根結線蟲（M.ethiopica）的抗性，發現基因分型結果與表型完全匹配，說明該基因能完全控制M.ethiopica，同時更新了基因Ma、Rmia、Rmja對線蟲的抗性譜系，發現Ma基因對線蟲具有廣譜抗性。筆者在本研究中所用SCAR標記位于LG2抗性基因座附近，35 bp indel分子標記位于紅根甘肅桃1號抗南方根結線蟲基因啟動子區，KASP標記位于2號染色體候選基因Pru-pr.2G055500的內含子上。利用不同分子標記檢測栽培桃F2群體對南方根結線蟲的抗性，發現35 bp indel分子標記檢測結果與另外兩個標記結果的準確率相比差異顯著，這說明野生種質紅根甘肅桃1號與栽培桃的抗性基因不同；SCAR標記與KASP標記準確率較接近，原因可能是所用的遺傳群體與樣本數量不同。為加快育種進程，利用抗性基因開發分子標記可提高材料中抗性基因篩選的效率，為選育具有綜合抗病的新品種奠定基礎。范惠冬等[29]利用抗性基因分子標記分析105份番茄種質資源中7個病害相關的8個抗性基因的分布情況，為抗性基因的聚合育種提供了參考。筆者通過分析定位區間內的變異，僅在候選基因上找到一處與抗感性顯著相關的2bp indel變異位點，隨后開發分子標記并在群體中進行驗證準確率為89.0%，較已報道的標記準確率高。但由于標記準確率未達到100%，推測該變異位點為連鎖標記，可能并非功能性變異，筆者下一步將對候選區間內結構變異、轉座子變異等不同變異類型進行檢測，并在群體中開展準確率和功能驗證，發掘南方根結線蟲抗性關鍵基因。

在本研究中，群體的表型調查結果符合分離定律，但一定程度上也受環境影響。一方面，南方根結線蟲的生長和侵染受土壤溫度和濕度影響，適合J2侵染的溫度為15℃～30℃[30-32]。研究發現，溫度超過35℃或低于5℃都會抑制南方根結線蟲的生長，最適宜根結線蟲生活的土壤濕度為6%，土壤過于干燥或濕潤均不利于南方根結線蟲的活動[32-33]。另一方面，植物對線蟲有一定的趨避性，感病植株在接觸線蟲時可能會躲避線蟲的進攻。Duval等[28]研究發現，易感苗在線蟲侵染時偶爾會躲避線蟲的進攻而產生假抗性個體，為保證評估表型的準確率，需對植株進行持續性接種根結線蟲以降低錯評植株的風險。因此，筆者在本試驗中改良了抗性鑒定指標，以根結有無替代根結率作為評價指標，顯著提高了表型鑒定的準確率。另外，也可通過延長線蟲侵染時間和多次接種根結線蟲提高表型數據的準確性和穩定性。

4結論

基于前人對栽培桃抗南方根結線蟲基因的定位結果，開發了一個KASP分子標記，并在雜交F2代群體中進行驗證，發現與前人開發的抗南方根結線蟲分子標記比較，筆者在本研究中開發的KASP標記準確率最高。該標記的開發提高了抗性品種的選擇效率，為加快分子育種進程提供了資源。

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