葡萄無核性狀分子標記通用性驗證

摘要：【目的】利用葡萄自然群體對已有9個無核分子標記進行評價，驗證其無核檢測通用性效果，為加快無核葡萄新品種選育進程提供技術支持。【方法】以88個無核種質和120個有核種質組成的自然群體為試材，對國內外已發表的9個常用葡萄無核分子標記進行通用性驗證。【結果】SCAR類型標記GSLP1-569、SCC8-1080和SCF27-2000的鑒定準確率分別為57.12%、72.20%和75.38%，無核檢測率分別為90.51%、79.18%和67.82%。SSR類型標記p1-VvAGL11、p2-VvAGL11、p3-VvAGL11、5U_VviAGL11、VMC7F2和VVSD10的鑒定準確率分別是88.47%、67.43%、71.94%、68.47%、67.99%和61.60%，無核檢測率分別是87.74%、77.22%、90.72%、90.80%、79.10%和63.03%；卡方分析表明與無核表型極顯著相關的等位點分別是250 bp、171 bp、195 bp、315 bp、197 bp和105 bp。【結論】SCAR標記SCF27-2000和SSR標記p1-VvAGL11準確率高，綜合表現最優，適用于無核葡萄新品種的分子輔助選擇。

關鍵詞：葡萄；無核；分子標記；準確率；驗證

中圖分類號：S663.1文獻標志碼：A文章編號：1009-9980（2024）07-1438-

Validation of the generality of molecular markers for seedless fruit ingrape

ZHANG Quan1，2，LIU Chonghuai2，FAN Xiucai2，ZHANG Ying2，SUN Lei2，JIANG Jianfu2*，GUO Dalong1*

（1College of Horticulture and Plant Protection，Henan University of Science and Technology，Luoyang 471000，Henan，China;2Zheng- zhou Fruit Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Zhengzhou 450000，Henan，China）

Abstract：【Objective】The natural population of grape（Vitis vinifera L.）was used to evaluate the uni-versality of 9 molecular markers for seedless fruit in order to provide technical support for the breeding of new seedless grape varieties.【Methods】DNA was extracted from healthy and young samples of a natural population consisting of 88 seedless germplasmes and 120 nucleatedgermplasmes.PCR amplifi-cation was performed using 9 reported molecular markers for seedless fruit of grape.Then，the PCR products were detected by 1.5%agarose gel electrophoresis and capillary electrophoresis，and the spe-cific bands were analyzed.The accuracy rate and seedless detection rate were calculated respectively to verify the versatility of 9 molecular markers for seedless fruit of grape.【Results】Among 208 grape germplasmes，16 germplasmes were detected by SCAR marker GSLP1-569，including 14 seedless germplasmes and 2 seeded germplasmes.The 14 seedless varieties were Summer Black，Changwuhebai Etc.among others.And，among them，12 germplasmes were Thompson Seedless and its derivatives.The identification accuracy and nuclear-free detection rate were 57.12%and 90.51%，respectively.Addi-tionally，the 1080 bp specific band was amplified by SCC8-1080 in 53 seedless germplasmes and 19 seeded germplasmes，and the statistical identification accuracy and seedless detection rate were 72.20%and 79.18%，respectively.Moreover，the 2000 bp specific band was amplified by SCF27-2000 in 87seedless germplasmes and 55 seeded germplasmes.The statistical identification accuracy and seedless detection rate were 75.38%and 67.82%，respectively.Furthermore，a total of 6 isotopic point and 8 gen-otypes were detected by the SSR marker p1-VvAGL11.The chi-square test showed that the allele 250 bp was significantly correlated with the nuclear-free phenotype and 257 bp was significantly correlated with nucleated phenotype.The genotype 250/250 was significantly correlated with the nuclear-free phe-notype，and the genotype 257/257 was significantly correlated with the nuclear phenotype.The statisti-cal identification accuracy and nuclear-free detection rate of the marker were 88.47%and 87.74%，re-spectively.A total of 3 isotopic point and 5 genotypes were detected by the marker p2-VvAGL11.The chi-square test showed that the allele 171 bp was significantly correlated with the nuclear-free pheno-type.The 158 bp was significantly correlated with the nuclear phenotype.The genotype 158/171 was significantly correlated with the seedless phenotype，and the genotype 158/158 was significantly corre-lated with the nuclear phenotype.The accuracy of marker identification and seedless detection rate were 67.43%and 77.22%，respectively.A total of 14 isotopic point and 30 genotypes were detected by the marker p3-VvAGL11.The chi-square test showed that the allele 195 bp was significantly correlated with the nuclear-free phenotype and 185 bp was significantly correlated with the nucleated phenotype.The genotype 185/195 was significantly associated with the nuclear-free phenotype.The genotype 185/185 was significantly correlated with the nuclear phenotype，and the accuracy and nuclear-free detection rate of the marker were 71.94%and 90.72%，respectively.A total of 24 isotopic point and 75 genotypes were detected by the marker 5U_VviAGL11.The chi-square test indicated that the allele 315 bp was significantly correlated with the nuclear-free phenotype and 305 bp was significantly associated with nu-cleated phenotype.The genotype 307/315 was significantly correlated with the nuclear-free phenotype.The accuracy and nuclear-free detection rate of the marker were 68.47%and 90.80%，respectively.A to-tal of 8 isotopic point were detected in the marker VMC7F2，and the allele 197 bp was significantly cor-related with the seedless phenotype by chi-square test.199 bp was significantly correlated with one phe-notype.The genotype 197/199 was significantly associated with the nuclear-free phenotype.The geno-type 199/199 was significantly correlated with the nuclear phenotype，and the accuracy and non-nuclear detection rate of the marker were 67.99%and 79.10%，respectively.A total of 9 isotopic point and 21 genotypes were detected by the marker VVSD10.The chi-square test showed that the allele 105 bp was significantly correlated with the nuclear-free phenotype，and the genotype 105/105 was significantly correlated with the nuclear-free phenotype.The identification accuracy and nuclear-free detection rate of the marker were 61.60%and 63.03%，respectively.【Conclusion】Among the SCAR type markers，SCF27-2000 had the highest accuracy and true positive rate，and the performance was the best.And，GSLP1-569 was more suitable for the hybrid offspring of Thompson seedless series.Among the SSR markers，p 1-VvAGL11 had good accuracy and seedless detection rate，and the 1 negative and 1 positive were low，showing the best performance，while p3-VvAGL11 and 5U_VviAGL11 had higher seedless detection rate，and 5U_VviAGL11 contained more genetic information.

Keywords：Grape;Seedless;Molecular marker;Accuracy;Verify

葡萄（Vitis vinifera L.）是葡萄科葡萄屬植物，被廣泛應用于鮮食、釀酒、制汁、制干等[1]。無核葡萄因其食用方便，口感佳，而深受消費者喜愛，因此無核已成為國內外葡萄育種工作的重要目標之一[2-3]。

葡萄童期較長，無核表型僅能在成年結果植株中進行篩選，造成無核葡萄新品種選育進程緩慢[4]。DNA標記技術的發展，為植物育種提供了新的方向，通過標記輔助選擇（Marker assisted-selec-tion，MAS）可以實現對目標性狀在幼苗期的鑒定，縮短育種周期[5]。因此，篩選準確高效的葡萄無核分子標記對育種工作有重要意義。目前國內外基于葡萄無核主要位點SDI（Seed Development Inhibi-tor，種子發育抑制）開發了一系列無核分子標記[6-7]，主要包括序列特征擴增區（Sequence Characterized Amplified Region，SCAR）和簡單重復序列（Simple Sequence Repeats，SSR）兩種標記[8-10]。MEJíA等[11]通過集群分離分析法（Bulk Segregant Analysis，BSA），利用紅寶石無核×蘇丹娜的雜交群體開發了SCAR標記SCF27-2000，該標記可以結合無核相關基因擴增出2.0 kb的特異性片段。GSLP1-569是王躍進等[12]采用自動熒光DNA序列分析儀對葡萄無核基因的RAPD標記UBC-269450進行測序后，按照該序列人工合成的寡聚核苷酸，利用該標記可以對攜帶無核基因或表達無核性狀的葡萄DNA擴增出約590bp的特殊片段。馬亞茹等[13]通過紅地球×森田尼無核及F1雜交群體開發了SSR標記VvSD10，可以在111bp等位點對葡萄無核性狀進行鑒定。現有的葡萄無核分子標記準確率多在特定雜交群體中進行驗證，驗證效率與親本關聯度較高，但在自然群體中的鑒定效率尚不明確，不能滿足葡萄無核育種需求[14]。

筆者在本試驗中在國內外研究的基礎上，對已報道的3個SCAR標記和6個SSR標記進行通用性驗證，以期從中篩選出適用于自然群體的葡萄無核分子標記，為加快無核葡萄新品種選育進程提供技術參考。

1材料和方法

1.1材料

試驗于2022—2023年在中國農業科學院鄭州果樹研究所進行。試驗共208份種質，包含無核種質88份和有核種質120份（表1），試驗所用材料均保存于國家葡萄種質資源圃（鄭州）。

1.2 DNA提取

取葡萄健康幼嫩葉片，液氮研磨，采用CTAB植物基因組DNA快速提取試劑盒（北京艾德萊生物科技有限公司）提取葉片基因組DNA。利用Nano-Drop 1000 spectrophotometer（Themo Scientific）紫外分光光度計檢測DNA濃度和純度，然后將DNA濃度稀釋到工作液質量濃度（約20 ng·μL-1），保存于-20℃，用于后續試驗。

1.3無核分子標記選擇及PCR擴增條件

選用9個已報道的與葡萄無核表型相關的分子標記（表2），引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，含FAM熒光探針的SSR引物由北京擎科生物科技股份有限公司合成。

PCR反應體系如下：SCAR標記PCR反應體系25μL：2×Taq Master Mix 15μL，正、反向引物各1μL（20μmol·L-1），DNA模板（20 ng·μL-1）2μL，ddH2O 6μL。反應程序為：95℃預變性3 min；95℃變性10 s，適宜Tm值退火10 s，72℃延伸1 min，35個循環；72℃延伸5 min，擴增產物4℃保存。SSR標記PCR反應體系30μL：1×TSE101金牌Mix 27μL，正、反向引物各1μL，DNA模板1μL。反應程序為：98℃預變性3 min；98℃變性10 s，適宜Tm值退火10 s，72℃延伸5min，37個循環，擴增產物4℃保存。

1.4 PCR產物檢測

SCAR標記的PCR擴增產物采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳25～30 min（恒壓150 V），使用UV凝膠成像儀拍照記錄。SSR標記的PCR擴增產物通過瓊脂糖凝膠電泳（2μL樣品+6μL溴酚藍），300 V電壓下12 min，獲取鑒定膠圖，通過膠圖確定模板濃度，加無菌水稀釋后采用熒光毛細管電泳（ABI 3730 XL遺傳分析儀）進行驗證。

1.5數據處理

參考馬亞茹等[13]、Baldi等[18]和Vihinen[19]的方法分別計算真陽性（True Positive，TP）、真陰性（True Negative，TN）、假陽性（False Positive，FP）、假陰性（False Negative，FN）、準確率（Accuracy）和無核檢測率（Nuclear-free Detection Rate，NDR）。

準確率=（TP+TN）/（TP+FP+TN+FN）×100%，無核檢測率=TP/（TP+FP）×100%。并利用SPSS軟件對樣本表型與不同的SSR標記的等位點及基因型之間進行卡方（χ2）獨立性檢驗（p＜0.05），用于評估表型和試驗數據之間的關聯程度。

2結果與分析

2.1 SCAR標記驗證及不同標記間準確率比較

在208個葡萄種質中驗證SCAR類型無核標記的通用性。結果如表3所示，標記GSLP1-569在葡萄種質間的鑒定準確率和無核檢測率分別是57.12%和90.51%。檢測到的16個種質包含14個無核種質和2個有核種質，其中11個無核種質是無核白及其衍生后代，可見GSLP1-569適合針對無核白及其后代的檢測。標記SCC8-1080分別在53個無核種質和19個有核種質中擴增出1080bp的特異性條帶，經統計在208個葡萄種質間的鑒定準確率和無核檢測率分別是72.20%和79.18%；標記SCF27-2000分別在87個無核種質和55個有核種質中擴增出2000bp的特異性條帶，在208個種質間的鑒定準確率和無核檢測率分別是75.38%和67.82%。3個SCAR類型標記中SCF27-2000的準確率和真陽性最高；標記GSLP1-569有較高的無核檢測率、假陰性和真陰性。鑒定結果表明，在針對自然群體的檢測中SCF27-2000綜合表現最優，適用于無核葡萄新品種的SCAR分子輔助選擇。

2.2 SSR標記檢測標記位點及基因型分析

對6個SSR無核標記的通用性進行了驗證，結果表明：6個標記分別檢測到3～24個不等的標記位點，這些位點大小為101～321 bp，標記p2-VvAGL11檢測到的位點最少，5U_VviAGL11檢測到的位點最多。每個標記表現最好的標記位點如表4所示，經卡方檢驗與種子有無均呈極顯著相關，檢測出這些位點的種質中無核種質占41.4%～89.4%，p1-VvAGL11的250 bp占比最高，同時在41.7%的三倍體種質中檢測到該位點。這些位點在56.1%～88.1%的無核葡萄種質中檢測到，5U_VviAGL11的315 bp占比最高，在三倍體種質中未檢測到該位點。

6個標記分別檢測到5～75種數量不等的基因型，標記p2-VvAGL11檢測到的基因型數量最少，5U_VviAGL11檢測到的數量最多。每個標記表現最好的基因型如表5所示，經卡方檢驗與葡萄種子有無極顯著相關。檢測到這6種基因型的種質中，71%～93.3%的種質為無核表型，標記5U_VviA-GL11檢測到的種質中無核種質占比最高；無核種質中24.4%～86.7%的種質檢測出這6種基因型，其中p1-VvAGL11檢測到的250/250在無核種質中占比最高；有核種質中僅有1.7%～24.2%檢測到這6種基因型；5U_VviAGL11檢測到的307/315在有核種質中占比最低。

2.3 SSR標記驗證及不同標記間準確率比較

對6個SSR類型無核標記進行驗證，結果（表6）顯示p1-VvAGL11準確率最高，達到88.47%，無核檢測率為87.74%。p3-VvAGL11和5U_VviAGL11的無核檢測率較高，分別為90.72%和90.80%，同時二者的真陰性也最高，分別為95.00%和95.83%。p1-VvAGL11真陽性最高，為89.44%；6個標記假陽性均表現良好，最高是VVSD10，為32.92%，最低是p3-VvAGL11，僅為5.00%。整體上p1-VvAGL11綜合表現最優，適用于無核葡萄新品種的SSR分子輔助選擇。

3討論

葡萄基因型高度雜合，童期長，導致育種進程相對緩慢[20]。通常對果實無核表型的篩選，只能等植株成年之后才能進行。而利用準確率高的分子標記進行輔助選擇育種，可以有效縮短育種年限，提高育種效率，推動無核葡萄育種的進程[21]。

國內外對開發葡萄無核分子標記進行了系統研究，屈田田等[22]通過不同葡萄雜交組合實生后代對GSLP1-569進行驗證，結果表明其在檢測無核白的后代時有著更高的準確性。在本研究中，GSLP1-569檢測出的14個無核品種中有11個品種與無核白有遺傳關聯，證實GSLP1-569較為適合檢測無核白及其衍生后代。朱瑜等[23]利用該標記對木納格的胚挽救后代進行鑒定，成功獲得了21個無核株系。SCC8-1080是Lahogue等[15]運用BSA技術開發出的離無核位點更近的SCAR標記，也是目前應用較多的標記之一[22]。Ryan等[24]通過對火焰無核及其F1組成的雜交群體進行檢測，證實SCC8-1080能準確鑒定F1中無核表型的植株，宣旭嫻[25]研究表明該標記在無核群體中對殘核和三倍體中的無核分型正確率分別是52.94%和50.00%，在自然群體中其無核分型正確率和無核檢測率分別是73.08%和43.18%。在本研究中，該標記的準確率和無核檢測率分別是72.20%和79.18%，這種差異可能是試驗材料選擇差異造成的。SCF27-2000是Mejía等[11]利用RAPD標記技術通過對隨機引物篩選之后進行測序分析轉化而成的SCAR標記，宣旭嫻[25]的研究結果表明，該標記在無核群體中對殘核、軟核和三倍體品種無核分型正確率分別是94.12%、100%和66.67%，在自然群體中的無核分型正確率是92.31%，無核檢測率為42.11%。Akkurt等[26]利用Alphonse Lavallee與無核白的372株F1雜交后代對SCF27-2000進行驗證，結果表明該標記更適用對親本均為無核的雜交后代進行鑒定。王勇等[27]利用SCF27-2000在14份葡萄種質資源和火州黑玉3個雜交組合共116株胚挽救后代中檢測到84株攜帶目的基因片段，其中81株與田間鑒定結果吻合，正確率96.4%，并認為該標記是一個顯性或主效基因標記，可以用來進行葡萄雜交后代無核單株的早期篩選。

p1-VvAGL11、p2-VvAGL11和p3-VvAGL11是Mejía等[8]將遺傳圖譜和物理圖譜與歐亞種葡萄的公共基因組序列進行整合，對無核葡萄雜交后代進行QTL分析之后篩選出的三個SSR類型標記，并證實離轉錄起始點越近的標記越適合用于基因的輔助選擇。安棟梁[28]在自然群體中的驗證表明，p3-VvA-GL11驗證結果最優，無核品種擴增結果中雜合基因型ab的解釋率為58.86%，在有核品種擴增結果中純合基因型BB解釋率達到66.67%，可以有效區分種子狀況。在針對p3-VvAGL11的研究中Ocarez等[17和陳豆豆等[20]分別認為與194bp和187bp標記位點極顯著相關，而筆者在本研究結果中表明，195 bp位點與無核表型相關性最顯著。在進行相關驗證試驗時，儀器或試驗操作會造成擴增片段長度出現偏差[29]，因此使用該類型標記時，應加入標準樣品進行校對，從而減小試驗誤差。在本研究中，p1-VvA-GL11、p2-VvAGL11和p3-VvAGL11在自然群體中鑒定準確率分別是88.47%、67.43%和71.94%，無核檢測率分別是87.74%、77.22%和90.72%，相比之下p1-VvAGL11表現出更高的準確性，而p3-VvAGL11則表現出更高的無核檢測率。5U_VviAGL11是Ocarez等[17]根據p3-VvAGL11等位點的分子多樣性重新設計的位于VvAGL11啟動子區域的SSR標記，含有更豐富的遺傳信息。前人驗證表明其等位點306 bp與無核表型極顯著相關，270 bp和298 bp與無核相關[20]，在本研究中，5U_VviAGL11在自然群體中鑒定準確率和無核檢測率分別是68.47%和90.8%。VMC7F2是Cabezas等[16]利用QTL定位到與葡萄無核性狀有關基因后經篩選設計的SSR標記，其198bp等位點與無核表型顯著相關。Akkurt等[26]使用SCC8-1080、SCF27-2000和VMC7f2在Al-phonse Lavallee與無核白的372株F1雜交后代中進行檢測，分別檢測到40、80和174個無核株系，并選用了在3個標記中均表現無核特征的20個子代進行研究，結果顯示VMC7f2與無核性狀關聯最緊密。

除筆者在本研究中所用的SCAR和SSR類型標記外，單核苷酸多態性（Simple Nucleotide Polymor-phisms，SNP）技術逐漸成為研究熱點[30]，Ocarez等[17]用20K SNP芯片對573個無核單株進行基因分型和精細化QTL定位分析，并根據p3_VvAGL11等位基因的分子多樣性重新設計了該標記，得到了SNP標記E7_VviAGL11。隨著高通量自動化檢測方法的更新換代，基因芯片、高通量檢測技術等SNP檢測技術也逐漸普及，能夠更快速、成本更低且更準確地檢測出已知的SNP位點，為無核葡萄育種提供參考。對于育種工作者而言，高效、準確的無核鑒定標記可加快田間育種進度，降低育種成本，促進產業的健康持續發展。本研究試驗材料中，出現個別名稱中有“無核”的品種，在田間調查時出現種子充分發育情況，這可能是命名問題或者引種記錄錯誤所致，種子狀況以田間調查結果為準。

4結論

通過由88份無核種質和120份有核種質組成的葡萄自然群體對3個SCAR無核標記和6個SSR無核標記進行驗證，結果表明SCAR類型標記中SCF27-2000準確率和真陽性最高，表現最優，GSLP1-569更適用于無核白系列的雜交后代；SSR標記中p1-VvAGL11有著較高的準確率和無核檢測率，且假陰性和假陽性較低，表現最優。

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