基于祖先性狀演化和葉綠體基因組的馬先蒿形態特征分析

摘要：為了探究馬先蒿屬（Pedicularis）植物的關鍵形態特征，為其辨別與鑒定提供參考。本研究采用祖先性狀演化推測Pedicularis最保守的形態特征，并基于10種馬先蒿屬植物完整葉綠體基因組，探討馬先蒿屬植物形態的變異原因。結果表明基于花序類型性狀演化分析和系統發育分析支持馬先蒿屬隸屬于列當科（Orobanchaceae）的分類地位。葉綠體基因組變異分析找到Pi值較高的7個變異基因和6個變異區域，且多分布在大單拷貝區（LSC）和小單拷貝區（SSC）區。反向重復區（IRs）的rps19和ycf1基因跨越了區域邊界造成IRs基因丟失。因此，總狀花序是馬先蒿屬最為保守的形態特征，可作為其分類依據。而IRs的擴張導致IRs基因丟失的同時提高LSC和SSC的多樣性，導致二者為高變異區，可能是馬先蒿屬植物形態變異的原因之一。這些結果將促進馬先蒿屬植物系統分類和種間進化的研究。

關鍵詞：馬先蒿屬；葉綠體基因組；系統發育；祖先形態

中圖分類號：Q732""" 文獻標識碼：A""""" 文章編號：1007-0435（2024）07-2039-15

doi：10.11733/j.issn.1007-0435.2024.07.005

引用格式：

王" 濤， 徐成體， 唐楚煜，等.基于祖先性狀演化和葉綠體基因組的馬先蒿形態特征分析［J］.草地學報，2024，32（7）：2039-2053

WANG Tao， XU Cheng-ti， TANG Chu-yu，et al.Morphological Analysis of Pedicularis Based on Ancestral Character Evolution and Chloroplast Genome［J］.Acta Agrestia Sinica，2024，32（7）：2039-2053

收稿日期：2023-12-12；修回日期：2024-03-01

基金項目：國家自然科學基金（32360349）資助

作者簡介：

王濤（1995-），男，漢族，安徽淮北人，博士研究生，主要從事草學研究，E-mail：13085500761@163.com；*通信作者Author for correspondence，E-mail：yulingli2000@163.com

Morphological Analysis of Pedicularis Based on Ancestral Character

Evolution and Chloroplast Genome

WANG Tao， XU Cheng-ti， TANG Chu-yu， CAO Zheng-fei， XIAO Meng-jun，

HE Min， LI Xiu-zhang， LI Yu-ling*

（Key Laboratory of the Alpine Grassland Ecology in the Three Rivers Region， Ministry of Education，

Qinghai University， Xining， Qinghai Province 810016， China）

Abstract：To explore the key morphological characteristics of Pedicularis plants and to provide reference for their identification，the most conserved morphological characteristics of Pedicularis were speculated by the evolution of ancestral traits，and the reasons for the morphological variation of Pedicularis were discussed based on the complete chloroplast genomes of 10 species of Pedicularis in this study. The results showed that the evolution analysis and phylogenetic analysis based on inflorescence type traits supported the taxonomic status of Pedicularis belonging to Orobanchaceae. The chloroplast genome variation analysis found 7 variable genes and 6 variable regions with high Pi values，and most of them were distributed in the LSC and SSC. The rps19 and ycf1 genes in the IRs crossed the region boundary and caused the loss of IRs genes. Therefore，raceme is the most conserved morphological feature of Pedicularis，which can be used as the basis for its classification. The expansion of IRs leads to the loss of IRs genes and the diversity of LSC and SSC，which leads to the high variation area of LSC and SSC，which may be one of the reasons for the morphological variation of Pedicularis. These results will promote the study of systematic classification and interspecific evolution of Pedicularis.

Key words：Pedicularis;Chloroplast genome;Phylogeny；Ancestral morphology

馬先蒿屬植物由于其自然生殖隔離和自身快速輻射分化繁衍方式的雙重影響，該屬植物分化強烈、形態變異復雜，且棲息地和物種起源中心較多且差異較大［1］，導致該屬植物資源豐富，種類繁多，雖然為其遺傳育種提供了極豐富的種質資源，但也限制了其的分類和系統學研究。全球約有568個已確認的種，335個同義種和450個未被確定的種，亞洲具有最高的生物多樣性，約有350種，大部分分布在中國及其周邊國家，其中271種為特有種，83種分布于印度，歐洲國家僅約有70種［3］。

基于葉綠體基因組證據闡明物種的系統發育地位，重建物種類群的系統發育是分類學和系統學研究的永恒主題之一，葉綠體全基因組數據在此過程中發揮重要作用［4］。大多數高等植物葉綠體基因組呈四聚體結構，由一個大單拷貝區域（Large single copy region，LSC）、一個小單拷貝區域（Small single copy region，SSC）和一對反向重復區域（Inverted repeat，IRs）組成［5］。植物葉綠體內擁有獨立的基因組合遺傳系統即單系遺傳，且具有序列短?。?20～160 kb）、基因結構相對穩定、含有保守序列區域（matK、rbcL、trnH-psbA和trnL-F）的優點［6-7］，在植物系統學研究中得到廣泛應用。因此，一般認為葉綠體基因組結構和含量相對穩定和保守［8］，但研究發現馬先蒿屬葉綠體基因組發生了強烈的IR擴增導致序列區域性的丟失和轉移［9］。在輪葉馬先蒿和碎米蕨葉馬先蒿的葉綠體基因組中，除了ndhB基因之外，幾乎所有的ndh基因都丟失了，rps16基因也發生了丟失現象但僅在輪葉馬先蒿中丟失［10-11］。在過去的5年中，在阿拉善馬先蒿中觀察到由于ndh基因缺失導致葉綠體基因組長度減少的現象［12］。相似的報道均指出馬先蒿屬植物的葉綠體基因組異于傳統被子植物的葉綠體基因組表現出高度的變異性［13］。這意味著馬先蒿屬植物形態特征的變異可能與葉綠體基因組存在某種關聯。

馬先蒿屬植物在漫長的進化過程中，形態特征受棲息地氣候特征的影響發生了劇烈改變，相對的其分類地位也經歷了多次改變。傳統分類學依據該屬植物模式種馬先蒿在形態學上的特點（葉呈互生、對生或輪生，全緣或羽狀分裂頂生的穗狀花序或總狀花序；花萼管狀，花藥包藏在盔瓣中，兩兩相對，基部有時具刺尖［14］將其與毛麝香屬、黑草屬和火焰草屬等隸屬于玄參科［15］，并在該屬下劃分無枝群、輪枝群和馬先蒿群等13個群［16］。而，隨著該屬更多新種和亞種葉綠體基因組證據的相繼報道，借助于單核苷酸多肽、短串聯重復序列和遺傳多態性分析進行個體識別鑒定，學者們認為馬先蒿屬應隸屬于列當科［17］，也是目前學者們廣泛采用的分類地位。但可以預見的是已有的形態學分類法和分子生物學分類法對于馬先蒿屬的分類出現分歧，并且學者們并未對其形態做出關鍵描述，這導致馬先蒿屬植物的形態鑒定成為野外工作的難點。

因此，已有的形態學特征已經不能準確的鑒定馬先蒿屬植物的分類，篩選該屬新的形態學特征篩選迫在眉睫，也是該屬植物的分類和鑒定的急切需要。本研究采用祖先性狀演替分析了該屬保守的形態學特征，并與已報道的馬先蒿屬植物葉綠體全基因組進行對比分析，探究該屬植物形態特征改變的原因。

1" 材料與方法

1.1" 葉綠體基因組獲取

基于青海大學青海省畜牧獸醫科學院冬蟲夏草研究室已經組裝完成的中國馬先蒿和甘肅馬先蒿序列（已投稿），并從NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）上下載相關物種序列得到全部的葉綠體基因組數據用于后續分析（表1）。

1.2" 祖先性狀演化和系統發育分析

根據中國植物志Flora of China （FOC）（http：//www.iplant.cn/info/Oryza%20 glaberrima？t=foc）的物種描述，對表1中68種植物形態性狀進行分類。選取具有特殊分類意義的4種形態學性狀，包括花序類型、花序著生位置和花葉類型進行統計與分析。利用性狀演化工具Mesquite v3.61中貝葉斯法快速構建祖先性狀演化樹，從而推斷馬先蒿屬祖先性狀及演化式樣［18］。從NCBI上收集馬先蒿屬、玄參科和列當科物種，以稻屬為外群，共68個物種進行系統進化分析。將以上68個物種葉綠體基因組數據導入Mega軟件進行序列對比［19］，完成后計算最佳擬合核苷酸模型并采用最大似然法構建系統發育樹，參數設置為Models = GTR+GAMMA，Bootstrap=1 000獲得系統發育樹各分支的靴帶支持率（Bootstrap values，BS）和種間支持率。

1.3" 葉綠體基因組變異性分析

使用MAFFT軟件［20］對相應的基因組序列進行對齊。利用DnaSP v6.0［6］軟件進行窗口長500 bp、步長 120 bp的滑動窗口分析，計算10個馬先蒿屬植物葉綠體基因組的核苷酸多態性（Pi）。使用mVISTA程序［21］，在ShuffleLAGAN模式下對10個馬先蒿屬植物的葉綠體基因組進行序列相似性分析并可視化。中國馬先蒿被選為參考基因組。使用Mauve軟件［22］對馬先蒿屬植物序列和基因進行共線性分析，并進行可視化。使用MISA軟件，分別檢測所有物種葉綠體基因組中的簡單重復序列參數設置均為單核苷酸單元、二核核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重復分別設置為10，5，4，3，3和3，并分析SSRs的類型、數量和分布模式。

1.4" 葉綠體全基因組比較和IR/SSC邊界收縮和擴張分析

葉綠體基因組變化重要來源之一就是IR/SC邊界變化［24］，利用mVISTA軟件在LAGAN模型下對馬先蒿屬植物葉綠體全基因組進行比較分析［25］。利用IRscope在線軟件（https：//irscope.shinyapps.io/irapp/） 繪制10個植物種間葉綠體基因組的IR/SC邊界對比圖，分析馬先蒿屬植物IR/SC，IRs區收縮與擴張特征［26］。

2" 結果與分析

2.1" 形態學祖先性狀演化分析

2.1.1" 花序類型" 花序類型的形態學祖先性狀演化分析指示（圖1），馬先蒿屬植物祖先狀態的花序類型最可能為總狀花序（55.58%）?？偁罨ㄐ驗榱挟斂浦参锏闹饕ㄐ蝾愋?，聚傘花序則為玄參科植物的主要花序類型。在選擇的68種植物中，研究發現從它們共同的祖先開始，花序分化為聚傘花序的玄參科分支1和總狀花序的列當科分支2。在分支2內花序類型至少經過節點1、節點2和節點3，3次分化過程。節點1和節點2穩定遺傳了祖先的總狀花序并未產生分化。然而節點3的馬先蒿屬植物在遺傳祖先總狀花序的同時也分化出穗狀、亞頭狀、簇生狀、穗狀或亞頭狀和穗狀或總狀5種花序類型，其中仍以總狀花序（58.83%）最多為該屬穩定遺傳的性狀。這表明馬先蒿屬植物的花序類型在種間差異顯著分化強烈但總體上仍為總狀花序。對比發現，列當科分支的祖先花序類型為總狀花序與馬先蒿屬植物的花序類型更為相似。因此，總狀花序類型的形態學祖先性狀演化分析結果符合馬先蒿屬植物隸屬于列當科的現代分子生物學觀點，可以作為馬先蒿屬植物形態分類的形態特征之一。

2.1.2" 花序位置" 從花序位置看（圖2），馬先蒿屬植物祖先狀態的花序位置最可能為腋生（62.40%）。其祖先的進化過程指示，花序位置主要分化為分支1的玄參科和分支2的列當科，且玄參科和玄參科均以腋生為主。在列當科分支中，至少有節點1和節點2，2次明顯的分化過程。在節點1分化出花序位置頂生或腋生，在節點2分化出花序位置頂生。這表明馬先蒿屬植物花序位置為腋生與列當科或玄參科植物均較為相似。因此本研究認為隨著馬先蒿屬植物不斷的變異與進化，花序位置的形態學特征已不能將馬先蒿屬植物有效的分類。

2.1.3" 花葉類型" 分析花葉類型（圖3），顯而易見的是馬先蒿屬植物祖先狀態的花葉類型最可能為互生（65.28%）。其祖先的進化過程指示，花葉類型主要分化為分支1的玄參科和分支2的列當科，且均以互生為主。在列當科分支中，至少有節點1、節點2和節點3，3次明顯的分化過程。在節點1分化出對生的花葉類型，且這種花葉類型被馬先蒿屬植物遺傳得到。在節點3的進化過程中，輪葉馬先蒿又分化出輪生的花葉類型，這也是馬先蒿屬植物分化強烈的形態學特征之一。因此，馬先蒿屬植物最可能互生花葉類型，與列當科或玄參科植物無顯著差異?；诖?，研究認為花葉類型已不能將馬先蒿屬植物從玄參科和列當科中完成鑒定，不適用于馬先蒿屬的形態學特征分類。

2.1.4" 苞片形態" 苞片形態演化歷史的追溯顯示（圖4），該特征的祖先狀態并不明顯，支持率最高的為卵形至披針形（34.30%），其次為卵形至長圓形（28.92%）和披針形（20.53%），剩余 2種均小于10%。在選擇的17種馬先蒿屬植物中，29.4%的植物苞片呈線形，35.30%的植物苞片呈卵形至披針形，35.30%的植物苞片呈卵形至長圓形。而處于分支1的玄參科植物卵形至披針形苞片，分支2的列當科更多的傾向于披針形苞片。此時，馬先蒿屬植物與玄參科的相似度較列當科更高。因此，苞片形態的祖先演化分析，其結果更支持馬先蒿屬隸屬于玄參科的分類結果。總體分析，苞片類型在種間分化變異顯著，其祖先特征難以追溯，不是馬先蒿屬有效的形態學分類依據。

2.2" 系統基因組學分析

基于最大似然法的系統發育分析作者發現（圖5），17個馬先蒿屬物種分為 8支。從上往下，第一支、第五支和第六支僅由一種物種組成，分別為：蘚生馬先蒿和甘肅馬先蒿；第二支由東俄洛馬先蒿、粗野馬先蒿和山西馬先蒿組成；第三支由歐亞馬先蒿、中國馬先蒿、黑馬先蒿和頭花馬先蒿組成；第四支由全裂馬先蒿和返顧馬先蒿組成；第六支由阿拉善馬先蒿和長花馬先蒿組成；第八支由輪葉馬先蒿組成。第七支的碎米蕨葉馬先蒿最為特殊，它已脫離馬先蒿屬，可能是更為古老的物種。因此，本研究認為甘肅馬先蒿和中國馬先蒿隸屬于馬先蒿屬并分別與P. hallaisanensis、黑馬先蒿親緣關系最近呈姊妹關系。其次，系統基因組學分析支持總狀花序類型為馬先蒿屬植物祖先性狀的結論。

2.3" 馬先蒿屬植物葉綠體基因組變異分析

2.3.1" 馬先蒿屬植物葉綠體基因組結構特征" 中國馬先蒿葉綠體全基因序列擁有120個基因，包括75個蛋白編碼基因（Protein-coding genes，PCGs）、37個轉運RNA（Transfer RNA，tRNA）基因和8個核糖體RNA（Ribosomal RNA，rRNA）基因（表2）。LSC區包含60個PCGs，22個tRNA，SSC區包含5個PCGs和1個tRNA，IRs區包含10個PCGs，14個tRNA和所有的rRNA基因。甘肅馬先蒿葉綠體全基因組編碼116個基因，包括72 個蛋白編碼基因、36個tRNA基因和8個rRNA基因（表2）。LSC區包含58個PCGs，21個tRNA，SSC區包含4個PCGs和1個tRNA，IRs區包含10個PCGs，14個tRNA和所有的rRNA基因。目前已發表的馬先蒿屬植物葉綠體基因組編碼的基因數量范圍為102～109個，PCGs約為69～74個，tRNA基因約為30個，rRNA基因均為8個。不難發現，甘肅馬先蒿和中國馬先蒿葉綠體基因組在結構組織、基因含量和基因排序上與其它馬先蒿屬植物基本相似，并未發現明顯的基因重排或倒置現象。

甘肅馬先蒿和中國馬先蒿葉綠體全基因組中GC含量分別為38.46%，38.51%。LSC區域中GC含量分別為36.43%和36.49%，SSC區域中GC含量分別為32.25%和32.60%，IRs區域中GC含量分別為43.53%和43.33%（表2）。然而，甘肅馬先蒿和中國馬先蒿葉綠體全基因和SSC區的GC偏倚普遍低于同屬其它物種，SSC區bp長度也更短。這表明在自然進化過程中二者葉綠體全基因組在堿基替換上具有GC偏倚性即AT堿基傾向于被GC堿基替換，且這種GC偏倚可能與SSC區域的GC偏倚有關。對17種馬先蒿屬的對比分析，研究發現甘肅馬先蒿和中國馬先蒿丟失ccsA，ycf2兩個PCGs基因（圖6A），同時編碼更多的tRNA基因（trnE-UUC，trnM-CAU和trnS-CGA）（圖6B），而ndhD，ndhJ，ndhH，trnM-CAU和trnI-CAU等基因在物種間表現出不同程度的缺失，這暗示基因丟失在馬先蒿屬植物葉綠體基因組進化過程中似乎是一種普遍現象。

2.3.2" 重復結構和簡單重復序列分析（Simple repeat sequence，SSR）" 在馬先蒿屬植物葉綠體基因組中，單核苷酸以A（Adenosine）和T（Thymine）含量最豐富；同時也導致其具有最豐富的AT和TA雙核苷酸重復（圖7A）。在甘肅馬先蒿和中國馬先蒿的葉綠體基因組中，分別找到40和36個SSRs，略低于馬先蒿屬其它植物（37～55個SSRs），且大部分馬先蒿屬植物都不具備CTAGAA、TAAGTA和TACTTA六核苷酸重復（圖7A），只有黑馬先蒿葉綠體基因組具有這一重復類型。這表明在馬先蒿屬植物的進化過程中，丟失長核苷酸重復序列是一種普遍現象。

此外，研究發現馬先蒿屬植物的SSRs在葉綠體基因組不同區域的分布喜好差異較大，多分布在SSC和LSC區（圖7B）。比較馬先蒿屬17種植物SSRs類型和數量，發現均具有以下4種（單、雙、三和四核苷酸）重復類型，但多核苷酸重復單元類型和含量在不同物種間差異較大（圖7A和7C）。如：碎米蕨葉馬先蒿具有最豐富的四核苷酸含量（11個）和多樣性（9種：TTCT，TTTA，TTTC，TAAA，TAAT，ATAG，AAAC，AGAA和GAAA），但它的三核苷酸重復數量較少。這表明在馬先蒿屬植物進化過程中，個體SSRs豐富度和種類的改變較大，且LSC和SSC區為高突變區。

2.3.3" IR收縮和膨脹" 通過對馬先蒿屬10種植物葉綠體基因組的比較分析，其中P. ishidoyana的IR區最長為35 263 bp，黑馬先蒿最短為24 302 bp，長度最大差異達到10 961 bp，較黑馬先蒿增加了45.1%（表2），很顯然馬先蒿屬植物葉綠體基因組IR存在顯著擴張現象。其次，rps19基因穿過LSC/IRb邊界，ycf1基因由于其在IR區的反向重復重復跨越了IRb/SSC和SSC/IRa邊界，trnH則跨越了IRa/LSC邊界。

在馬先蒿屬植物中，rps19基因序列大部分位于LSC區內，7～15 bp延伸至IRb區內，但碎米蕨葉馬先蒿僅34 bp（12.18%）的rps19基因仍留在LSC區內，245 bp（87.82%）的基因延伸至IRb區內，這表明碎米蕨葉馬先蒿IR區的擴張更加劇烈，近乎將整個rps19基因吞并。這一結論在IRa/LSC邊界得到了驗證，僅碎米蕨葉馬先蒿的IRa區包含rps19基因，且大部分基因分布在IRa中，僅有3 bp仍留在LSC區中（圖8）。trnH基因受IR區擴張的影響，也有不同長度（0～20 bp）的基因序列跨越了IRa/LSC邊界。一個有趣的現象是ycf1基因在跨越SSC/IRb邊界時，僅有3～106 bp仍留在SSC區內，大部分基因在IRb區內；相反的是在跨越SSC/IRa邊界時大部分基因處于SSC區內，458～1 149 bp的ycfl基因序列延伸到IRa區。這說明受IR區擴張的影響ycf1基因對SSC/IRb和SSC/IRa邊界的跨越程度不同，導致其分裂成兩段基因分屬于不同的區域。因此，馬先蒿屬植物葉綠體基因組中IR區的擴張對rps19和ycf1基因在不同植物上表現不同，促使馬先蒿屬植物葉綠體基因組表現出多樣性和高變異性。

2.3.4" 葉綠體基因組核苷酸多樣性和序列相似性分析" 為了衡量馬先蒿屬種群的多態性，分析物種和相關物種的遺傳變異，以確定進化關系。本文對包含甘肅馬先蒿和中國馬先蒿等10個馬先蒿屬植物的葉綠體基因組序列多樣性進行分析和比對，并以核苷酸變異性值（Pi）進行表示。結果發現：10個馬先蒿屬植物的Pi從0增加到0.156 7（圖9），這表明馬先蒿屬植物核苷酸替換程度較大。而作者檢測到的4個高變異區域（Pigt;0.1）分別為：ndhJ-trnV，ycf4-cemA，ndhE-nhdG和rpl32-trnL和1個高變異基因（ndhH）均分布在LSC和SSC區，IR區Pi值最低，LSC較高，SSC區最高。為了比較核苷酸序列的變異情況，本研究以中國馬先蒿為參考，分析了葉綠體基因組序列的變異程度。其中，rpl22，rps19，rpl12，ycf1，trnH，psbA和ndhH等基因編碼區和trnS-GGA，trnV-UAC，ndhJ-trnV，ycf4-cemA，ndhE-nhdG，rpl32-trnL等基因間區的非編碼區都發生了不同程度的變異（圖10）。綜合核苷酸多樣性和序列相似性發現，與IR區相比，LSC和SSC是高突變區，并且SSC區為變異程度更高。

3" 討論

馬先蒿屬植物形態多樣，生境復雜，且種類眾多，為列當科最難分類的屬之一［27］。自馬先蒿屬被創立，對于該屬的分類范疇便一直存在爭議，大量分類研究認為馬先蒿屬較重要的形態學特征之一就是花序類型，花序著生位置、花粉結構和葉序結構也被作為重要的形態學鑒定依據。在這種分類背景下，馬先蒿屬屬于玄參科范疇的證據更充分。隨著馬先蒿屬更多植物的發現，學者［29］在馬先蒿屬植物的形態上找到更多差異性，這雖然促使馬先蒿屬植物多樣性的增加，但也使學者逐漸對Maximowicz對馬先蒿屬的分類地位產生懷疑。中國學者在其中做出重大貢獻，首先是Li等［30］將花和葉作為營養性狀將馬先蒿屬劃分到葉根科。他給出的理由如下：花序頂生或穗狀；花葉輪生或對生；葉分螺旋狀，花腋生。Li等［31］對這種分類的理論依據是主要為受傳粉媒介誘導的自然選擇壓力獨立作用于植物上，在花性狀上產生更大的同質性。這也成為當時馬先蒿屬主流的分類方法。但這不能很好的解釋馬先蒿屬內植物間花和葉的巨大變異性。由此，鄒同進化的觀點提出［32］，花性狀如管長是不可靠的分類標記，更影響注重花形態的是異質性，這極大的擴展了馬先蒿屬的分類區域?；诖?，本文在進行馬先蒿屬植物花序類型的形態學祖先性狀演化發現，馬先蒿屬植物至少有6種花序類型，其中占據主導是穗狀花序和總裝花序，與列當科眾多物種相似度顯著高于玄參科。YU［33］等人提出依據馬先蒿屬的總裝花序類型應將其作為列當科的亞科之一。最后，本文的研究結果也認為總狀花序類型應該作為馬先蒿屬的分類特征。

葉綠體基因組為環形結構，一般由LSC，IRb，SSC和IRa區構成［34］，因此形成LSC/IRb，IRb/SSC，SSC/IRa和IRa/LSC 4個邊界。在IR區進行擴張和收縮時，處于邊界位置的基因有可能進入臨近的LSC和SSC區中，而IR區的這種變化在被子植物是一種普遍現象［35］。其次，葉綠體基因組核苷酸多樣性形成最根本的原因在于核苷酸序列的變異，這可能是由不同植物葉綠體基因組的長度和編碼基因數量差異導致的［36］。甘肅馬先蒿和中國馬先蒿編碼的基因數量和順序與其它馬先蒿屬植物并無顯著差異，而在進化過程中丟失的基因種類和數量有所差異。綜合比較發現葉綠體基因組中的LSC區域變異程度更大，進化行為更加活躍，這可能是因為它含有更少的保守基因和保守區域［37］。研究指出在葉綠體基因組中matK，rbcL，trnH-psbA和trnL-F被認為是保守序列，包含兩個保守基因和兩個內含子區域，能有效的反應物種的進化和變異程度［38］。而在本研究中作者發現，兩個保守基因均分布在SSC和IR區，保守序列全分布在IR區中，這是導致IR區最為保守，LSC區成為葉綠體基因組結構變異熱點區的原因之一。

對丟失的基因已有研究認為可能是假基因化，當它被認為是假基因時則表示它失去了完全自我復制的能力，不再能編碼完整的蛋白質導致生物功能的缺失［39-40］。也有研究報道成為假基因時只是原本的功能基因受核苷酸缺失、突變和倒位影響失去活性，導致功能基因的缺失［41-42］。但它仍具有編碼蛋白質的能力并在轉錄過程中通過與功能基因競爭性的結合miRNA從而調控功能基因的表達［43］，另外，它也可以產生內源性小干擾RNA抑制功能基因的表達［44］。這些分子水平的改變可能與馬先蒿屬植物的形態變化存在某種關聯。在本研究中，研究發現馬先蒿屬植物碎米蕨葉馬先蒿核苷酸序列較短但編碼更多的PCGs，這可能與rps19基因的假基因化有關，這也解釋了碎米蕨葉馬先蒿葉綠體基因組的高度變異性（Pi=0.156 71）。弄清楚這一問題有助于幫助了解馬先蒿屬植物葉綠體基因組的進化過程。

17種馬先蒿屬植物核苷酸變異值變化較大（0＜Pi＜0.156 71），意味著在進化過程中馬先蒿屬植物核苷酸替換較為強烈［45］。本研究發現馬先蒿屬植物葉綠體基因組IR區Pi值遠低于LSC和SSC區，SSRs也更多的分布在LSC和SSC區，多種證據表明IR區為保守區域，因為它的核苷酸序列具有反向重復的特性。而LSC和SSC為變異活躍區，豐富了馬先蒿屬植物葉綠體基因組的多樣性。在本文中，從甘肅馬先蒿和中國馬先蒿中識別到多個高變異基因（rpl22，rps19，rpl12，ycf1，trnH，psbA和ndhH）和多個高變異區域（trnS-GGA，trnV-UAC，ndhJ-trnV，ycf4-cemA，ndhE-nhdG ，rpl32-trnL）。從邊界基因來看，ycf1基因受IR區擴張的影響，只有一小部分序列（3～106 bp）跨越SSC/IRb邊界，而大部分核苷酸序列跨越SSC/IRa邊界進入SSC區，458～1 149 bp的核苷酸序列保留在IRa區。本文發現碎米蕨葉馬先蒿的rps19基因的分布位置由LSC轉移到IRb區，其花序類型也由總狀花序變異為亞頭狀［46］。同時，受IR區擴張的影響trnH基因靠近并部分進入LSC區。這種結果說明，馬先蒿屬植物葉綠體基因數量、位置和種類發生不同程度的變異，間接引起植物形態的改變。近幾年關于植物葉綠體基因組和線粒體基因組的研究中指出，植物在進化過程中葉綠體基因組和線粒體基因組發生了不同程度的堿基交換，trnH基因被認為可能參與了這一過程［47］。因此，trnH基因遠離IRa區靠近LSC區可能是為了更加方便與線粒體基因組發生基因交流［48］。馬先蒿屬植物具有極高的變異性，對其葉綠體和線粒體間基因交流的研究將促進研究人員解開馬先蒿屬植物的進化之謎。馬先蒿屬種間葉綠體基因組差異非常明顯，基于Pi的變異程度排序為SSC＞LSC＞IR，編碼區也遠比非編碼區更為保守。因此，SSC區中的ycf1，trnV-UAC，ndhJ-trnV和ycf4-cemA共4個非編碼區對于開發DNA條形碼具有普遍的參考價值或者在馬先蒿屬植物未來的鑒定工作中發揮作用。其中ycf4-cemA的高突變性已經被證明并廣泛的應用于地理譜系研究［49］，在杜鵑花屬和風毛菊屬系統進化分析中取得成功［［50-51］。

4" 結論

馬先蒿屬植物形態特征種間差異較大，總狀花序的花序類型是馬先蒿屬植物更加保守的形態學特征，能有效的鑒別馬先蒿屬植物。IR區在馬先蒿屬不同物種間的差異性擴張導致rps19和ycf1基因跨越了區域邊界造成IR區基因數量的丟失，同時促使LSC和SSC區出現4個高變異區（ndhJ-trnV、ycf4-cemA、ndhE-nhdG和rpl32-trnL）和1個高變異基因（ndhH），提高了馬先蒿屬植物葉綠體基因組的多樣性，間接導致二者成為馬先蒿屬植物葉綠體基因組的高變異區。馬先蒿屬植物高變異性的葉綠體基因組可能是誘使馬先蒿屬植物形態發生劇烈改變的原因之一，但仍需要進一步的研究。

參考文獻

［1］" LIU M L，YUM W B，WANG H. Rapid identification of plant species and iflora：application of DNA barcoding in a large temperate genus Pedicularis（Orobanchaceae）［J］. Plant Diversity and Resources，2013（35）：707-714

［2］" YATOO M I，DIMRI U，GOPALAKRISHAN A，et al. Antidiabetic and oxidative stress ameliorative potential of ethanolic extract of Pedicularis longiflora Rudolph［J］. International Journal of Pharmacology，2016（12）：177-187

［3］" PETRU M. Year-to-year oscillations in demography of the strictly biennial Pedicularis sylvatica and effects of experimental disturbances［J］. Plant Ecology and Diversity，2005（181）：289-298

［4］" JIN W T，SCHUITEMAN A，CHASE M W，et al. Phylogenetics of subtribe Orchidinae S.L.（Orchidaceae;Orchidoideae）based on seven markers（plastid matK，psaB，rbcL，trnL-F，trnH-psba，and nuclear nrITS，Xdh）：implications for generic delimitation［J］. BMC Plant Biology，2017（17）：e222

［5］" 郝新艷，趙淑文，劉嘉偉，等. 雜花苜蓿葉綠體基因組特征及系統發育分析［J］. 草地學報，2023，31（6）：1665-1672

［6］" YANG F S，WANG X Q. Extensive length variation in the cpDNA trnT-trnF region of hemiparasitic Pedicularis and its phylogenetic implications［J］. Plant Systematics and Evolution，2007（264）：251-264

［7］" YU W B，LIU M L，WANG H，et al. Towards a comprehensive phylogeny of the large temperate genus Pedicularis（Orobanchaceae），with an emphasis on species from the Himalaya-Hengduan Mountains［J］. BMC Plant Biology，2015，（15）：176-199

［8］" 盧政陽，于鳳揚，肖月娥，等. 北陵鳶尾葉綠體基因組及其特征分析［J］. 草地學報，2023，31（6）：1656-1664

［9］" ZHU A，GUO W，GUPTA S，et al. Evolutionary dynamics of the plastid inverted repeat：the effects of expan-sion，contraction，and loss on substitution rates［J］. New Phytologist，2016（209）：1747-1756

［10］MOWER J P，VICKREY T L. Structural diversity among plastid genomes of land plants. In Advances in Botanical Research［M］. London：Longman Group Ltd，2018：263-292

［11］ZHANG R，XU B，LI J，et al. Transit from autotrophism to heterotrophism：sequence variation and evolution of chloroplast genomes in Orobanchaceae species［J］. Front in Genetics，2020（11）：e542017

［12］WICKE S，NAUMANN J. Molecular evolution of plastid genomes in parasitic flowering plants［J］. Genome Biology and Evolution，2018（85）：315-347

［13］SHIN H W，LEE N S. Understanding plastome evolution in hemiparasitic Santalales：complete chloroplast genomes of three species，Dendrotrophe varians，Helixanthera parasitica，and Macrosolen cochinchinensis［J］. Plos One，2018（13）：e0200293

［14］LI M X，HE X R，TAO R，et al. Phytochemistry and pharmacology of the genus Pedicularis used in traditional chinese medicine［J］. American Journal of Chinese Medicine，2014（42）：1071-1098

［15］馬妍. 兩種同域馬先蒿近緣種的花冠表型對比及選擇作用研究［D］. 蘭州：西北師范大學，2019：44-47

［16］UCUNCU O，BALTACI C，ILTER S M. Chemical composition，antimicrobial and antioxidant aactivities of essential oil from Pedicularis condensata BIEB［J］. Journal of Information Science and Engineering，2016（3）：105-109

［17］LI X，FENG T，RANDLE C，et al. Phylogenetic relationships in Orobanchaceae inferred from low-copy nuclear genes：consolidation of major clades and identification of a novel position of the non-photosynthetic Orobanche clade sister to all other parasitic Orobanchaceae［J］. Frontiers in Plant Science，2019（902）：1-14

［18］劉蕊. 榆屬系統發育基因組學及形態演化研究［D］. 鄭州：河南農業大學，2023：53-55

［19］黃祥，何夢瑤，王子煊，等. 紫葉風箱果葉綠體基因組特征及繡線菊亞科系統發育分析［J］. 草業學報，2024，33（3）：161-173

［20］KATOH K，STANDLEY D M. MAFFT multiple sequence alignment software version 7：improvements in performance and usability［J］. Molecular Biology and Evolution，2013，30（4）：772-780

［21］FRAZER K A，PACHTER L，POLIAKOV A，et al. VISTA：computational tools for comparative genomics［J］. Nucleic Acids Research，2004，32（2）：273-279

［22］DARLING A C，MAU B，BLATTNER F R，et al. Mauve：multiple alignment of conserved genomic sequence with rearrangements［J］. Genome Research，2004，14（7）：1394-1403

［23］MANUEL M. Computational Tools for Genomic Studies in Plants［J］. Current Genomics，2016，11（6）：509-514

［24］LOBRY J R. Asymmetric substitution patterns in the two DNA strands of bacteria［J］. Molecular Biology and Evolution，1996（13）：660-665

［25］WASSIM A，THEIN M，LARUE R W，et al. Diagnosis of histoplasmosis using the mvista histoplasma galactomannan antigen qualitative lateral flow-based immunoassay;a multicenter study［J］. Open Forum Infectious Diseases，2021（8）：e454

［26］AMIRYOUSEFI A，HYVONEN P P. IRscope：an online program to visualize the junction sites of chloroplast genomes［J］. Bioinformatics，2018（34）：3033-3031

［27］YU W B，HUANG P H，REE R H，et al. DNA barcoding of Pedicularis L.（Orobanchaceae）：Evaluating four universal barcode loci in a large and hemiparasitic genus［J］. Journal of Systematics and Evolution，2011（49）：425-437

［28］RICHARD H R. Phylogeny and the evolution of floral diversity in Pedicularis（Orobanchaceae）［J］. International Journal of Plant Sciences，2005（166）：595-613

29］MA X F，SZMIDT A E，WANG X R. Genetic structure and evolutionary history of a diploid hybrid pine Pinus densata inferred from the nucleotide variation at seven gene loci［J］. Molecular Biology and Evolution，2006，（28）：807-816

［30］LI X，FENG T，RANDLE C，et al. Phylogenetic relationships in Orobanchaceae inferred from low-copy nuclear genes： consolidation of major clades and identification of a novel position of the non-photosynthetic Orobanche clade sister to all other parasitic Orobanchaceae［J］. Frontiers in Plant Science，2019（902）：1-14

［31］L I X，YANG J B，WANG H，et al. Plastid NDH pseudogenization and gene loss in a recently derived lineage from the largest hemiparasitic plant genus Pedicularis （Orobanchaceae）［J］. Plant and Cell Physiology，2021（62）：971-984

［32］WANG P，HUANG Q. Interspecific and intraspecific variation in corolla tube length in Pedicularis species achieved by both cell anisotropy and division［J］. Journal of Systematics and Evolution，2017（55）：208-214

［33］YU W B，WANG H，LIU M L，et al. Phylogenetic approaches resolve taxonomical confusion in Pedicularis （Orobanchaceae）： reinstatement of Pedicularis delavayi and discovering a new species Pedicularis milliana［J］. Plos One，2018（13）：e0200372

［34］SAIKIA M，WANG X，MAO Y，et al. Codon optimality controls differential mRNA translation during amino acid starvation［J］. RNA，2016（11）：1719-1727

［35］PAUL P，MALAKAR A K，CHAKRABORTY S. Compositional bias coupled with selection and mutation pressure drives codon usage in Brassica campestris genes［J］. Food Science and Biotechnology，2018（27）：725-733

［36］JIA D. Survey and analysis of simple sequence repeats（SSRs）in three genomes of Candida species［J］. Gene，2016（584）：129-135

［37］QI W，LIN F，LIU Y，et al. High-throughput development of simple sequence repeat markers for genetic diversity research in Crambe abyssinica［J］. BMC Plant Biology，2016（16）：139-150

［38］PENNISI E. DNA barcodes jump-start search for new species［J］. Science，2019（364）：920-921

［39］ZHANG R，WANG J，HAN K，et al. Complete chloroplast genome sequence of Pedicularis cheilanthifolia，an alpine plant in China［J］. Conservation Genetics Resources，2017（9）：619-621

［40］CHASE M W，CHRISTENHUSZ M J，FAY M F，et al. An update of the angiosperm phylogeny group classification for the orders and families of flowering plants：APG IV［J］. Botanical Journal of the Linnean Society，2016（181）：1-20

［41］ZENG S，ZHOU T，HAN K，et al. The complete chloroplast genome sequences of six Rehmannia species［J］. Genes， 2017（8）：103-118

［42］TKACH N，REE R H，KUSS P，et al. High mountain origin，phylogenetics，evolution，and niche conservatism of arctic lineages in the hemiparasitic genus Pedicularis（Orobanchaceae）［J］. Molecular Phylogenetics and Evolution，2014（76）：75-92

［43］XU X D，GUAN J Y，ZHANG Z Y，et al. Novel tRNA gene rearrangements in the mitochondrial genomes of praying mantises （Mantodea：Mantidae）：translocation，duplication and pseudogenization［J］. International Journal of Biological Macromolecules，2021（185）：403-411

［44］ZHOU L，CHEN T，QIU X，et al. Evolutionary differences in gene loss and pseudogenization among mycoheterotrophic orchids in the tribe Vanilleae（subfamily Vanilloideae）［J］. Frontiers in Plant Science，2023（14）：1160446-1160460

［45］SCOBEYEVA V A，ARTYUSHIN I V，KRINITSINA A A，et al. Gene loss，pseudogenization in plastomes of genus Allium （Amaryllidaceae），and putative selection for adaptation to environmental conditions［J］. Frontiers in Genetics，2021（12）：674783-674799

［46］TOMOTAKA M，ANOOP J，PABLO B C，et al. Pseudogenization of the chloroplast threonine（TRNT-GGU）gene in the sunflower family（Asteraceae）［J］. Scientific Reports，2021（11）：21122-21140

［47］LI X，YANG J B，WANG H，et al. Plastid NDH pseudogenization and gene loss in a recently derived lineage from the largest hemiparasitic plant genus Pedicularis（Orobanchaceae）［J］. Plant and Cell Physiology，2021（62）：971-984

［48］SWETA T，MIGUEL A N，ENRIQUE M. A methodology to study pseudogenized lincRNAs［J］. Methods in Molecular Biology，2021，23（24）：49-63

［49］CAMPBEL W H，GOWRI G. Codon usage in higher plants，green algae，and cyanobacteria［J］. Plant Physiology，1990（92）：1-11

［50］SHEN J，LI X，LI M，et al. Characterization，comparative phylogenetic，and gene transfer analyses of organelle genomes of Rhododendron × pulchrum［J］. Frontiers in Plant Science，2022（13）：e969765

［51］ZHANG X，DENG T，MOORE M J，et al. Plastome phylogenomics of Saussurea（Asteraceae：Cardueae）［J］. BMC Plant Biology，2019，1（19）：e290

（責任編輯" 劉婷婷）