不同添加劑對辣椒秸稈青貯品質及細菌多樣性的影響

摘要：為探究不同添加劑對辣椒（Capsicum annuum L.）秸稈青貯品質和細菌群落結構的影響，試驗以新鮮辣椒秸稈為原料，設置對照組（W0，添加等量無菌去離子水）、植物乳桿菌（Lactiplantibacillus plantarum）組（W1）、植物乳桿菌+纖維素酶（Lactiplantibacillus plantarum+cellulase）組（W2）、植物乳桿菌+枯草芽孢桿菌（Lactiplantibacillus plantarum+Bacillus subtilis）組（W3）、植物乳桿菌+糖蜜（Lactiplantibacillus plantarum+molasses）組（W4）和纖維素酶（cellulase）組（W5），室溫條件青貯60 d后測定其營養成分、發酵品質和細菌群落結構。結果表明：與W0組相比，添加劑處理組pH值、中性洗滌纖維（Neutral detergent fiber，NDF）和酸性洗滌纖維（Acid detergent lignin，ADF）均降低，乳酸（Lactic acid，LA）顯著增加（Plt;0.05）；各添加劑處理組之間相比，W3組粗蛋白（Crude protein，CP）和LA高于其他組，pH值、NDF、ADF和氨態氮/總氮（NH3-N/TN）低于其他組。辣椒秸稈原料（WY）和W0組優勢菌為藍藻門（Cyanobacteriota）顫藻屬（Oscillatoria），其他處理組優勢菌為芽孢桿菌門（Bacillota）乳植物桿菌屬（Lactiplantibacillus）。綜上，添加劑能改善辣椒秸稈青貯品質，添加植物乳桿菌+枯草芽孢桿菌的辣椒秸稈青貯品質最好。

關鍵詞：辣椒秸稈；發酵品質；細菌群落結構；藍藻門；芽孢桿菌門

中圖分類號：S816.6""" 文獻標識碼：A""""" 文章編號：1007-0435（2024）07-2330-07

doi：10.11733/j.issn.1007-0435.2024.07.035

引用格式：

程志澤， 伊斯拉依·達吾提， 萬江春，等.不同添加劑對辣椒秸稈青貯品質及細菌多樣性的影響［J］.草地學報，2024，32（7）：2230-2336

CHENG Zhi-ze， YISILAYI-Dawuti， WAN Jiang-chun，et al.Effects of Different Additives on the Quality and Bacterial Diversity of Pepper Straw Silage［J］.Acta Agrestia Sinica，2024，32（7）：2230-2336

Effects of Different Additives on the Quality and Bacterial

Diversity of Pepper Straw Silage

CHENG Zhi-ze， YISILAYI-Dawuti， WAN Jiang-chun， NAIBI-Abulaiti， AIBIBULA-Yimamu*

（College of Prataculture， Xinjiang Agricultural University， Urumqi， Xinjiang 830000， China）

Abstract：In order to explore the effects of different additives on the quality and bacterial community structure of pepper （Capsicum annuum L.） straw silage，fresh pepper straw was used as raw material. The control group （W0，adding the same amount of sterile deionized water），Lactobacillus plantarum group （W1），Lactobacillus plantarum+cellulase group （W2），Lactobacillus plantarum+Bacillus subtilis group （W3），Lactobacillus plantarum+molasses group （W4） and cellulase group （W5） were set up. The nutritional composition，fermentation quality and bacterial community structure were determined after 60 days of silage at room temperature. The results showed that compared with the W0 group，the pH value，neutral detergent fiber （NDF） and acid detergent fiber （ADF） of the additive treatment group decreased，and lactic acid （LA） increased significantly （Plt;0.05）. Compared with other groups，crude protein （CP） and LA in W3 group were higher，and pH，NDF，ADF and NH3-N/TN were lower. The dominant bacteria in the pepper straw raw material （WY） and W0 group were Cyanobacteriota and Oscillatoria，and the dominant bacteria in other treatment groups were Bacillota and Lactiplantibacillus. In summary，additives could improve the quality of pepper straw silage，and the quality of pepper straw silage treated with Lactobacillus plantarum+Bacillus subtilis was the best.

Key words：Pepper straw;Fermentation quality;Bacterial community structure;Cyanobacteriota;Bacillota

收稿日期：2024-02-19；修回日期：2024-03-24

基金項目：新疆重點研發計劃項目“新疆地源性生物發酵飼料調配關鍵技術研究”（2022B02042-2）資助

作者簡介：

程志澤（1984-），男，漢族，甘肅莊浪人，博士研究生，主要從事飼草料加工與反芻動物營養研究，E-mail：627840293@qq.com；*通信作者Author for correspondence，E-mail：aibibula@hotmail.com

近年來，由于我國畜牧業規模化、集約化發展，以及人們對畜產品質量需求不斷增加，優質飼草料不足缺口越顯凸出，已成為制約畜牧業發展的瓶頸因素［1］。而我國非常規飼料資源豐富，具有很高的潛在飼用價值［2］。辣椒秸稈是非常規飼料資源，粗蛋白含量14.79%～16.72%，營養成分優于羊草（Leymus chinensis（Trin.）Tzvel.）和玉米（Zea mays L.）秸稈，與苜蓿（Medicago sativa L.）接近［3］，同時我國每年辣椒種植面積超過2.1×106hm2，秸稈年產量達6.9×107 t［4］，資源極豐富。嘗試將辣椒秸稈青貯處理，開發為反芻動物飼料，可同時緩解飼草料不足和季節供應不平衡問題。

在制作青貯飼料時，使用添加劑能改善原料自身的不足，提升青貯品質。如植物乳桿菌可補充原料同型發酵乳酸菌數量不足［5］；枯草芽孢桿菌能分泌纖維素酶［6］、淀粉酶等系列酶［7-8］；糖蜜富含碳水化合物，可為乳酸菌的生長和繁殖提供額外的單糖來源［9］；纖維素酶可降解植物細胞壁的結構性糖類，為乳酸菌快速繁殖提供更多的可溶性碳水化合物（Water soluble carbohydrates，WSC）［10］。另外對一些本身符合青貯條件的原料，使用添加劑仍可提高青貯品質，如WSC含量較高的鮮食玉米秸稈或中性洗滌纖維（Neutral detergent fiber，NDF）和酸性洗滌纖維（Acid detergent lignin，ADF）較低的構樹，在青貯時使用糖蜜或纖維素酶處理后，其青貯品質優于未加添加劑處理組［11-12］。同時，青貯的過程也是微生物演替主導發酵的過程［13］，微生物群落結構與青貯的品質密切相關［14］。因此，研究青貯前后微生物群落結構對了解其品質極其重要。

近年來，辣椒秸稈在飼料開發利用方面逐漸被重視。已有研究證明，飼料中加入10%辣椒秸稈粉飼喂獺兔，能提升其日增重、主要營養物質表觀消化率和健康水平［15］。在青貯辣椒秸稈試驗中，發現添加阿魏酸酯酶與復合菌液青貯處理后能提高辣椒秸稈的體外產氣量、可消化有機物和代謝能，也能提升瘤胃對于氮的利用效率［16］。另外用辣椒秸稈青貯完全代替日糧中的玉米青貯飼喂肉羊，可提高肉羊對飼料營養物質的消化利用率［17］。但目前，辣椒秸稈的飼料開發研究仍處于初期階段，系統、深入的研究報道較少。因此，本試驗以含水量為65%的辣椒秸稈為原料，研究不同添加劑對其青貯營養成分、發酵品質和微生物群落結構的影響，為調制品質優良辣椒秸稈青貯提供理論依據和技術參考。

1" 材料與方法

1.1" 試驗材料

參試辣椒秸稈取自新疆昌吉州瑪納斯縣境內辣椒種植大田，品種為改良‘陜早紅’，末次辣椒采摘后收割秸稈，刈割時留茬2～3 cm，秸稈清潔、無泥土夾雜。經測定其干物質（Dry matter，DM）、NDF、粗蛋白質（Crude Protein，CP）、ADF、粗脂肪（Ether extraction，EE）和WSC含量分別為26.32%FM、15.90%DM、34.97%DM、29.30%DM、2.90%DM和9.57%DM，辣椒素（Capsaicin）含量為82.29±0.14 μg·g-1。植物乳桿菌（1×1011cfu·g-1）、枯草芽孢桿菌（1×1011cfu·g-1）購于濰坊某生物科技有限公司，纖維素酶（2×104 U·g-1）購于上海某生物科技有限公司，糖蜜購于柳州某糖蜜有限公司。

1.2" 試驗設計

試驗采用單因素完全隨機設計。辣椒秸稈收割后在干凈的水泥地晾曬并適時翻曬，期間多點取樣，采用感官評定和微波爐法［18］相結合的方式測定含水量，待含水量65%時，用粉碎機粉碎至1～3 cm長度，分別將植物乳桿菌（W1）、植物乳桿菌+纖維素酶（W2）、植物乳桿菌+枯草芽孢桿菌（W3）、植物乳桿菌+糖蜜（W4）和纖維素酶（W5）溶于無菌去離子水中，均勻噴灑在粉碎的辣椒秸稈上，對照組（W0）噴灑等量無菌去離子水，共6個處理，每個處理3個重復，攪拌均勻后裝入聚乙烯袋中真空包裝并置于室內環境下自然發酵，60 d后取樣測定相關指標。各處理添加劑及添加量如表1所列。

1.3" 測定指標與方法

1.3.1" 辣椒秸稈青貯營養成分測定" DM，CP，EE，NDF，ADF含量的測定參照朱進忠［19］的方法；WSC采用硫酸－蒽酮比色法測定［20］；辣椒素含量測定采用高效液相色譜（HPLC）法測量［21］。

1.3.2" 辣椒秸稈青貯發酵品質測定" 取青貯辣椒秸稈鮮樣20 g放入250 mL錐形瓶中，加入180 mL滅菌蒸餾水浸泡30 min，用攪拌機充分攪拌30 s，再用4層紗布和定量濾紙先后過濾，得浸提液。用25型酸度計（上海雷磁分析儀器廠，玻璃電極電極）測量浸提液的pH值。取部分浸提液經高速冷凍離心機離心5 min，再經0.22 μm濾膜過濾。參照Cao等［22］的方法，采用高效液相色譜儀測定乳酸（Lactic acid，LA）、乙酸（Acetic acid，AA）、丙酸（Propionic acid，PA）及丁酸（Butyric acid，BA）含量。NH3-N測量采用苯酚-次氯酸鈉比色法［23］。總氮（TN）含量計算公式為TN＝CP÷6.25。

1.3.3" 辣椒秸稈原料及其青貯細菌群落結構分析" 將辣椒秸稈原料及不同添加劑處理的青貯辣椒秸稈送至派森諾生物科技公司（南京），用于細菌多樣性測序分析。采用PowerSoilDNA Isolation Kit試劑盒提取樣品總DNA。選擇帶有Barcode的338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）為引物，對獲取細菌的16s rRNA的V3～V4可變區進行PCR擴增，并且每個樣本做3個重復。使用Illumina TruSeq DNA構建測序文庫。最后采用Pacbio Sequel三代測序平臺對群落DNA片段進行SMRT（Single Molecule Real-Time）測序。

1.4" 數據統計與分析

數據經Excel 2010進行匯總和整理后，使用SPSS 20.0一般線性模型（General Linear Model，GLM）對數據進行方差分析，采用Duncan法進行多重比較檢驗。優勢菌群相對豐度柱狀圖通過QIIME2軟件進行計算。

2" 結果與分析

2.1" 不同添加劑對辣椒秸稈青貯營養成分的影響

由表2可知，W1組DM含量最高，顯著高于W0，W2，W4和W5組（Plt;0.05），與W3組之間差異不顯著；W3組CP含量顯著高于W0，W1，W2和W5組（Plt;0.05），與W4組之間差異不顯著，W0與W5組之間CP含量差異不顯著，卻顯著低于其余各組（Plt;0.05）；W1，W2，W3和W5組EE含量顯著高于W0組（Plt;0.05），W4與W0組之間EE含量差異不顯著；6組辣椒秸稈青貯之間WSC含量差異不顯著；W3與W4組之間NDF和ADF含量顯著低于其余各組（Plt;0.05），且W3組NDF含量顯著低于W4組（Plt;0.05）；W3組辣椒素含量最高，顯著高于其余各組（Plt;0.05），W4和W5組辣椒素含量最低，且他們之間差異不顯著。

2.2" 不同添加劑對辣椒秸稈發酵品質的影響

由表3可知，W3組LA含量最高，顯著高于其他各組（Plt;0.05），W4與W2組LA含量差異不顯著，卻顯著高于W1，W5和W0組（Plt;0.05）；W0組pH值和PA含量顯著高于其他各組（Plt;0.05），W3組pH值和PA含量最低，與W1，W2和W4組之間的pH和PA含量差異不顯著，但顯著低于W5組（Plt;0.05）；W3和W4組的NH3-N/TN顯著低于其他4組（Plt;0.05），且W3組的NH3-N/TN顯著低于W4組（Plt;0.05），W0與W5之間NH3-N/TN差異不顯著，顯著高于W1和W2組（Plt;0.05）；6組青貯均未檢測到BA。

2.3" 不同添加劑對辣椒秸稈青貯細菌群落結構的影響

2.3.1" 辣椒秸稈原料及不同添加劑處理青貯的稀釋曲線" 由圖1可知樣本測序數據量為5 600個，隨著測序數據量的增加，稀釋曲線趨于平緩，說明本次測序結果合理，繼續增加測序深度無法發現新的擴增子序列變異（Amplicon Sequence Variant，ASV）。WY為辣椒秸稈原料，W0，W1，W2，W3，W4和W5分別是不同添加劑處理的辣椒秸稈青貯。從圖可知隨著稀釋曲線趨于平坦時，W1組曲線最高，其次是W5組，WY組最低，說明添加劑處理組辣椒秸稈青貯細菌豐度均高于辣椒秸稈原料，且W1組細菌豐度最高，其次是W5組。

2.3.2" 辣椒秸稈原料及不同添加劑處理青貯細菌群落結構分析

（1）門水平的細菌群落結構分析

由圖2可知WY和W0組優勢菌為藍藻門（Cyanobacteriota），占比分別為96.00%和88.78%，另外WY組還有3.83%的假單胞菌門（Pseudomonadota），W0組有10.08%的芽孢桿菌門（Bacillota）；W1，W2，W3，W4和W5組的優勢菌為芽孢桿菌門（Bacillota），占比分別為86.36%，88.51%，99.74%，98.15%和93.48%，同時部分組還含有少量的藍藻門（Cyanobacteriota）、假單胞菌門（Pseudomonadota）、放線菌門（Actinomytota）、擬桿菌門（Bacteroidota）、支原體門（Mycoplasmatota）和彎曲菌門（Campylobacterota）等。

（2） 屬水平細菌群落結構分析

由圖3可知WY和W0優勢菌為顫藻屬（Oscillatoria），分別占95.88%和88.42%，另外WY組還有3.74%鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas），W0組有9.27%的乳植物桿菌屬（Lactiplantibacillus）；W1、W2、W3、W4和W5組優勢菌為乳植物桿菌屬（Lactiplantibacillus），占比分別為65.50%，82.33%，70.40%，77.48%和90.48%，同時部分處理組還含有少量的芽孢桿菌屬（Bacillus）、顫藻屬（Oscillatoria）、促生乳桿菌屬（Levilactobacillus）、遲緩乳桿菌屬（Lentilactobacillus）和乳桿菌屬（Lactobacillus）等，另外W3和W4組含芽孢桿菌屬（Bacillus）較高，分別為29.32%和20.59%。

3" 討論

3.1" 不同添加劑對辣椒秸稈青貯養分含量的影響

青貯的作用是原料在密閉缺氧條件下，通過厭氧乳酸菌發酵作用抑制各種雜菌繁殖，減少養分損失，從而改善原料品質。但有些原料因自身條件不足或為盡可能的改善原料質量，會選擇合適的添加劑為乳酸菌創造理想的發酵環境。本研究結果表明，添加劑對辣椒秸稈青貯營養成分有一定影響作用。各添加劑組與W0組相比，除W5組CP，NDF和ADF與W0組差異不顯著外，其余各添加劑組CP均高于W0組，NDF和ADF顯著低于W0組，說明使用W1，W2，W3和W4添加劑能改善辣椒秸稈青貯營養成分，這與包健［24］、詹佳琦［25］和王鳳林［26］等人在不同原料中使用相同添加劑青貯結果相似。而W5相關指標與W0差異不顯著，說明纖維素酶單獨添加對辣椒秸稈青貯養分改善效果不明顯，這與萬榮［27］等人研究結果相反，可能主要原因是原料及其處理條件不同所造成；各添加劑組之間相比較，W3組CP，EE，WSC和辣椒素最高，NDF和ADF最低，說明植物乳桿菌和枯草芽孢桿菌一起添加效果最好，這與穆勝龍等［28］研究結果相同，原因是W3組中植物乳桿菌增加了辣椒秸稈青貯初期乳酸菌的數量，快速產生大量乳酸抑制梭菌等不良微生物增殖，從而減少CP等營養成分和辣椒素的分解，同時大量乳酸等有機酸會酸解辣椒秸稈細胞壁，使NDF含量降低［29］；另外，枯草芽孢桿菌能夠分泌纖維素酶、淀粉酶等多種酶系［28］，可分解辣椒秸稈中纖維素和淀粉等成分為可溶性糖，既達到分解細胞壁NDF和ADF作用，還為乳酸菌發酵補充了底物。相比W1組，W4組青貯的CP，WSC和LA含量較高，而NDF，ADF含量和NH3-N/TN降低，青貯效果更好，說明同時添加植物乳桿菌和糖蜜效果優于單獨添加植物乳桿菌，可能是在辣椒秸稈原料中同時使用植物乳桿菌和糖蜜，既迅速增加了乳酸菌數量，又為其快速增殖和發酵提供充足的底物，這與劉輝等的研究結果一致［30］。本研究中，W2組青貯的LA含量顯著高于W1和W5組，NH3-N/TN低于W1和W5組，因此W2處理組的發酵品質優于W1和W5組，說明在辣椒秸稈青貯時，植物乳桿菌和纖維素酶協同作用效果優于兩者單獨使用，原因可能是通過協同作用，纖維素酶能進一步將辣椒秸稈細胞壁結構性多糖降解為單糖，為乳酸發酵提供更多的可溶性糖，通過乳酸菌發酵改善了青貯品質，同時還可能因添加的纖維素酶抑制了腐敗菌的增殖所致［31］。另外，W3處理辣椒秸稈青貯含有79.23 μg·g-1辣椒素，顯著高于其他各添加劑處理組，但該辣椒素含量在辣度評價分級中與其他處理辣椒秸稈青貯組結果相同，均屬3級［32］。

3.2" 不同添加劑對辣椒秸稈青貯發酵品質的影響

在青貯飼料中，pH、LA和NH3-N/TN是衡量發酵品質的主要指標，優質青貯飼料pH標準為3.80～4.20。NH3-N/TN低于10%［33］，LA含量越高，則發酵效果越好［34］。本研究中，各添加劑組與W0組相比較，pH和NH3-N/TN低于W0組，且各添加劑處理組均pH低于4.20，NH3-N/TN低于10%，達到優質青貯飼料的標準，同時各添加劑組LA含量均顯著高于W0組，所有處理組均未檢測到BA，說明辣椒秸稈經添加劑處理后青貯能改善其發酵品質，這與覃娟清［35］等在青貯筍殼上研究結果相一致；各添加劑組之間相比較，W3組pH和NH3-N/TN最低，LA最高，說明在辣椒秸稈青貯中添加劑使用植物乳桿菌+枯草芽孢桿菌時發酵品質最好，這與王鳳林［26］等在玉米秸稈青貯中人研究結果相同，原因可能是添加劑中的植物乳桿菌能迅速增加乳酸菌數量，加快乳酸發酵速度，同時枯草芽孢桿菌通過產生抗菌肽類物質等途徑，抑制不良菌生長［36］，為乳酸菌增殖、發酵創造有利條件，從而減少辣椒秸稈粗蛋白等營養成分的分解，使NH3-N/TN降低。

3.3" 不同添加劑對辣椒秸稈青貯細菌群落結構的影響

青貯是一個復雜的微生物相互作用過程，在諸多復雜微生物體系中，細菌占據了主要位置，因此，通過分析青貯飼料中細菌群落結構，可在一定程度上能對青貯飼料營養價值和發酵品質作進一步的了解。

由稀釋性曲線可知，隨著樣品測序深度增加，稀釋曲線均逐漸趨于平緩，說明樣品測序結果合理，能全部反映出其細菌的多樣性［37］，繼續增加測序深度無法發現新的ASV。在門水平上，辣椒秸稈原料及其不同處理的青貯優勢菌為芽孢桿菌門（Bacillota）和藍藻門（Cyanobacteriota），芽孢桿菌門即厚壁菌門（Firmicutes），研究證明其多數革蘭氏染色呈陽性，而且在缺水等極端環境之下，能產生芽孢保持生存，同時研究發現，許多芽孢桿菌門中細菌通過對淀粉、纖維素和蛋白質等大分子化合物進行降解［38］，為微生物活動提供更多底物［39］。乳桿菌屬是芽孢桿菌門一主要的菌屬，對青貯品質有顯著影響［40］。通過比較發現，WY和W0中優勢菌為藍藻門，這與張娟等［41］在圓葉決明子中添加蘋果酸和嗜酸桿菌后青貯結果相似，說明辣椒秸稈本身附著益生菌較少，直接青貯效果不佳。而其余各添加劑處理組的辣椒秸稈青貯優勢菌為芽孢桿菌門，與劉蓓一［42］和陶蓮等［43］研究結果一致，說明在辣椒秸稈青貯時，使用添加劑能增加有益菌的豐度，從而抑制有害菌增殖。

在屬水平上，辣椒秸稈原料及不同處理青貯主要優勢菌為乳植物桿菌屬（Lactiplantibacillus）和顫藻屬（Oscillatoria）。WY和W0的優勢菌為顫藻屬（Oscillatoria），乳桿菌屬等有益菌較低，而顫藻屬屬藍藻門，能釋放藻毒素和異臭物質［44］，不利于青貯，從而從微結構層面說明辣椒秸稈原料不宜直接青貯。而W1，W2，W3，W4和W5組青貯的優勢菌為乳植物桿菌屬（Lactiplantibacillus），另外還有少量遲緩乳桿菌屬（Lentilactobacillus）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、促生乳桿菌屬（Levilactobacillus）和芽孢桿菌屬（Bacillus）等乳酸菌［45］，在青貯飼料中，乳酸菌能抑制其他有害菌增殖，對青貯飼料起防腐作用，是制作優良青貯飼料的主要微生物［46］，這說明辣椒秸稈經不同添加劑處理后青貯，可改變微生物群落結構，增加乳酸菌的豐度，提升品質，這與孫文濤等［47］在構樹青貯中研究結果相似。另外W3和W4組除了乳植物桿菌屬為優勢菌外，還含有較高比例（分別為29.32%和20.59%）的芽孢桿菌屬，加之W3和W4組營養成分和發酵品質較高，說明在青貯辣椒秸稈中，適宜的芽孢桿菌屬有利于提升青貯質量。這與李鈺等［48］和孫宇等［49］在發酵飼料中添加枯草芽孢桿菌的研究結果相似。另外，W0處理的辣椒秸稈青貯pH值為4.23，雖然顯著高于其他添加劑處理組，但與優質青貯pH值范圍接近，主要原因可能與其含有10.08%的芽孢桿菌門、9.27%的乳植物桿菌屬有關。

4" 結論

辣椒秸稈經添加劑處理后能改善青貯品質，使用植物乳桿菌+枯草芽孢桿菌作添加劑青貯效果最佳。另外，辣椒秸稈經青貯處理后辣椒素含量降低。

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（責任編輯" 付" 宸）