氮添加對青藏高原高寒草甸叢枝菌根真菌群落的影響

摘要：叢枝菌根真菌（Arbuscular mycorrhizal fungi，AMF）能與大部分高等植物的根系形成共生關系，進行重要的物質和能量交換，而氮添加會對AMF產生一系列影響。本試驗以高寒草甸為研究對象，探究4個不同氮添加水平下土壤AMF群落的變化特征及土壤驅動因子。研究表明：（1）N5和N10處理下，土壤pH值顯著降低，N10處理下，土壤硝態氮含量顯著上升。（2）在N5和N15處理下，多樣孢囊霉科（Diversisporaceae）群落相對豐度顯著降低，（3）在N5和N10處理下，Chao1指數顯著降低，在N10和N15處理下，β多樣性有顯著變化。（4）土壤銨態氮，硝態氮和有機碳含量是影響AMF群落結構的關鍵因子。因此，氮添加會影響青藏高原高寒草甸土壤AMF群落，且群落結構和豐度與土壤特性顯著相關，研究結果對于預測全球大氣氮沉降背景下青藏高原高寒草甸土壤AMF多樣性的未來變化具有重要意義。

關鍵詞：氮添加；AMF；土壤化學成分；群落組成；多樣性

中圖分類號：S153.6""" 文獻標識碼：A""""" 文章編號：1007-0435（2024）07-2054-08

doi：10.11733/j.issn.1007-0435.2024.07.006

引用格式：

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GUO Xian-bao， HAN Bing， HE Yi-cheng，et al.The Effects of Nitrogen Addition on Arbuscular Mycorrhizal Fungal Communities in Alpine Meadow of The Qinghai-Tibetan Plateau［J］.Acta Agrestia Sinica，2024，32（7）：2054-2061

收稿日期：2024-03-15；修回日期：2024-04-23

基金項目：國家自然科學基金面上項目（32171685）資助

作者簡介：

國顯寶（2003-），男，漢族，遼寧朝陽人，本科生，主要從事草地生態學研究，E-mail：15114204093@163.com;*通信作者Author for correspondence，E-mail：shaoxinqing@163.com

The Effects of Nitrogen Addition on Arbuscular Mycorrhizal Fungal

Communities in Alpine Meadow of The Qinghai-Tibetan Plateau

GUO Xian-bao1， HAN Bing1， LU Xin-min2， HE Yi-cheng1， YU Lu1， ZHANG Wan-tong1，

DUAN Li-hui1， GENG Yi-yi1， SHAO Xin-qing1*， YU Dian1， HAN Jia-yi1

（1. College of Grassland Science and Technology， China Agricultural University， Beijing 100193， China;

2. Tianshui Fruit Research Institute， Tianshui， Gansu Province 741000， China）

Abstract：Arbuscular mycorrhizal fungi （AMF） can form symbiotic relationship with the roots of most higher plants，and exchange important materials and energy. Nitrogen addition has a series of effects on AMF. Taking alpine meadow as the research object，change characteristics of AMF community and soil driving factors under four different nitrogen addition levels were studied. The results showed that：（1） Under the treatments of N5 and N10，soil pH decreased significantly，while under the treatment of N10，soil nitrate content increased significantly. （2） Under N5 and N15 treatments，the relative abundance of Diversisporaceae community decreased significantly;（3） Under N5 and N10 treatments，chao1 index decreased significantly;under N10 and N15 treatments，β diversity changed significantly;（4） The contents of soil ammonium nitrogen，nitrate nitrogen and organic carbon were the key factors affecting the community structure of AMF. Therefore，nitrogen addition affected the AMF community of alpine meadow soil in Qinghai-Tibet Plateau，and the community structure and abundance were significantly related to soil characteristics. The research results are of great significance for predicting the future changes of AMF diversity in alpine meadow of Qinghai-Tibet Plateau under the background of global atmospheric nitrogen deposition.

Key words：Nitrogen addition;Arbuscular mycorrhizal fungi;Soil chemical composition;Community composition;Diversity

叢枝菌根真菌（Arbuscular mycorrhizal fungi，AMF）是土壤共生真菌中分布最廣的一類真菌［1］，在長期的進化過程中，與宿主植物形成了依賴于碳水化合物與礦質養分交換的專性共生體［2］。具體表現為，AMF的根外菌絲可以作為根系的延長部分，幫助宿主植物吸收氮、磷、鉀等必需營養成分［3］，作為交換，宿主植物為AMF提供碳水化合物和脂類，用以擴大菌絲網絡［4］。此外，AMF還可以提高宿主植物對外界脅迫（如干旱、鹽堿等）的抗性［5］。AMF具有豐富的物種多樣性，Morton等［6］根據AM真菌孢子的形態特征將所有AMF分類為新建立的球囊霉目（Glomerales），之后Schüβler等［7］以SSU rRNA基因序列研究為基礎，將球囊霉目提升到球囊菌門（Glomeromycota），其中包含1個綱、4個目、7個科、9個屬，建立起了AMF的最初分類系統（CABI Bioscience，UK，2004；INVAM，USA，2004）。我國迄今已發現146種AMF （約占全球已報道總數的60%），其中包括13個新種［8］。

青藏高原60%以上面積為草地所覆蓋，其主要植被類型是以冷中生多年生草本植物群落為主構成的高寒草甸［9］，氮素是限制其生態系統初級生產力的關鍵營養元素［10］，因此，施加氮肥是高寒草甸中常見的養分管理措施之一［11］，能夠及時補充土壤營養元素，有助于恢復和提高退化草地生產力等服務功能［12］。一項在川西北高寒草甸的研究發現［13］，氮添加顯著增加了禾本科功能群的蓋度和重要值，提高了各功能群的植物高度，顯著降低了雜類草植物的物種數、蓋度和重要值。楊曉霞等［14］在對青藏高原高寒草甸的研究發現雖然氮添加能顯著增加植物地上生物量，但對地下生物量和總生物量無顯著影響。此外，有研究表明［15］，在青藏高原，氮添加不增加土壤總有機碳，但增加土壤礦質化碳。

關于氮添加對AMF的影響，研究發現高寒草甸生態系統中AMF孢子密度和根系定殖率在適量的氮添加下達到峰值［16］，表明一定的氮添加有利于AMF的定殖。對AMF多樣性的影響上，目前尚無一致的結論，大部分研究發現氮沉降對AMF豐富度和多樣性有顯著負面影響［17-19］，但也有研究發現氮添加對AMF群落多樣性沒有影響［20］或增加AMF多樣性［21］。研究結果不同可能與多種因素如土壤狀況、海拔、氣候等有關。一般來說，當土壤養分限制減輕，植物會把更多的碳資源分配給地上部分［22］，導致地下菌根生物量減少［23］。當前，有關養分添加（主要是氮和磷） 能否及如何影響高寒草甸AMF群落組成及多樣性的研究較少，因此本研究以青藏高原高寒草甸為研究對象，通過在野外定位試驗平臺上實施氮添加的試驗處理，采用高通量測序技術，探究不同氮添加水平下土壤AMF多樣性和群落組成，以及土壤化學成分的改變與AMF群落之間的關系，了解調控高寒草甸AMF變化的機制，為預測全球大氣氮沉降背景下青藏高原高寒草甸土壤AMF多樣性的未來變化提供理論依據。

1" 材料與方法

1.1" 研究區概況

養分添加試驗地位于青海省海晏縣西海鎮（36°92′N，100°93′E），建立于2019年6月，依托青海省海北州高原現代生態畜牧業科技試驗示范園。海拔高度為3 000～3 100 m，高原大陸性氣候，雨熱同期，夏季涼爽濕潤，冬季寒冷干旱，全年日照總長大約有2 580 h。年平均降水有400 mm，主要集中在6—8月。年均溫為1.5℃，試驗地的草地類型屬于高寒草甸草原，土壤為粘壤土，樣地中的主要植物種類有針茅（Stipa aliena）、賴草（Leymus secalinus）、洽草（Koeleria macrantha）、冰草（Agropyron cristatum）、扁蓿豆（Melissitus ruthenica）等。

1.2" 試驗設計

于2019年6月，在養分添加試驗地設置三個氮添加水平，分別為5，10和15 g·m-2·a-1，記為N5，N10和N15，加上對照（CK：0 g·m-2·a-1），共4個處理，每個處理設置4個重復，總計16個小區，每個小區的大小為3 m×4 m各小區之間設置1 m的間隔。養分添加的處理安排在每年草地的返青期（6月初），氮添加以尿素（N含量46%，購自瀘天化股份有限公司）的形式每年施入一次。在試驗期間，樣地周圍有圍欄圍護，采用封閉管理。

1.3" 取樣方法

在連續施肥兩年后的生長高峰期（2020年8月初），使用土鉆（直徑5 cm）在各小區內取0～10 cm的土樣，各小區重復取樣5次。土壤樣品分兩份，1份充分混合后過粗篩（2 mm），篩去根系和大塊土粒，風干后常溫保存，用于測定土壤化學成分：土壤全磷（Total Phosphorus，TP）、全碳（Total carbon，TC）、全氮（Total nitrogen，TN）、PH值、硝態氮（NO-3-N）、銨態氮（NH+4-N）和土壤有機碳（Soil organic carbon，SOC）；1份液氮冷凍，24 h內運至實驗室，保存至-80℃冰箱進行后續AMF群落分析。

1.4" 土壤化學成分的測定

土壤全磷測定采用鉬銻抗比色法測定，土壤全碳和全氮通過碳氮元素分析儀（Elementar，Hanau，Germany）測定。用 1 mol KCl（土水比為1∶5）的土壤提取液，使用pH計（Orion Star A215 PH Meter，US）測定土壤pH值。土壤硝態氮和銨態氮的濃度由流動分析儀（Flowsys，Ecotech，Germany）測定。土壤有機碳用濃鹽酸熏蒸8 h后，用有機碳分析儀（Vario Macro，elementar，Germany）測定。

1.5" DNA提取和PCR擴增測序

使用E. Z. N. A. soil DNA kit（Omega Biotek，Norcross，GA，USA）從土壤樣品中提取微生物DNA。采用PCR（BioRad S1000，Bio-Rad Laboratory，CA）擴增真菌18S rRNA基因，引物為AMV4.5 NF/AMDGR（5′-AAGCTCGTAGTTGAATTTCG-3′/5′-CCCAACTATCCCTATTAATCA T-3′）。PCR反應混合物使用TruSeq Nano DNA Gel Extraction Kit（Illumina，美國）純化，使用Agilent Bioanalyzer 2100系統（Agilent，美國）定量。測序工作委托派森諾生物科技有限公司完成。按照NEB（New England Biolabs，USA）的標準程序生成測序文庫，最終在Illumina Hiseq 2500平臺上進行配對測序。

1.6" 數據分析

對土壤化學成分各個數據進行Z-score轉化，并使用R包ggplot繪制熱圖，使用最小顯著性差異法比較不同處理間的差異顯著性（α=0.05），以評估氮添加對土壤化學成分的影響。利用QIIME2 （version 2019.4）對Illumina MiSeq測序數據生成α-多樣性指數（Chao1、Faith_pd、Simpson和Shannon）。利用R （4.1.3）對不同處理下AMF相對豐度和群落α-多樣性指數進行單因素方差分析和作圖表，以比較不同氮添加水平對AMF群落多樣性的影響。對于β-多樣性分析，計算了Bray-Curtis距離，并使用R（4.1.3）中的“vegan”軟件包進行主坐標分析（PCoA）。土壤化學成分和AMF群落的冗余分析（RDA）使用免費的在線數據分析平臺genescloud工具（https：//www.genescloud.cn）進行。person相關分析用于比較土壤化學成分和AMF各科的相關性，通過R（4.1.3）中的ggplot2包繪制相關分析熱圖。

2" 結果與分析

2.1" 不同氮添加水平對土壤化學成分的影響

不同氮添加水平對土壤化學成分的影響不同（圖1），相較于CK，N15添加下土壤全磷含量顯著降低（Plt;0.05）。土壤pH值在N5和N10處理下顯著降低（Plt;0.05）。隨著氮添加水平的提升，土壤SOC含量增加但不顯著；相較于CK，N10添加下土壤硝態氮含量顯著增加（Plt;0.05）。土壤銨態氮含量隨著氮添加量的添加先上升后下降，但變化不顯著。

2.2" 不同氮添加水平對叢枝菌根真菌群落組成和豐度的影響

對AMF群落結構組成分析結果表明（表1），土壤在科水平上的優勢科為類球囊霉科（Paraglomeraceae）和球囊霉科（Glomeraceae），其次是巨孢囊霉科（Gigasporaceae）、近明球囊霉科（Claroideoglomeraceae）、多樣孢囊霉科（Diversisporaceae）、原囊霉科（Archaeosporaceae）、雙型囊霉科（Ambisporaceae）。

不同氮添加水平對不同AMF種類相對豐度影響不同（表1），與CK相比，在N5和N15處理下，多樣孢囊霉科（Diversisporaceae）群落相對豐度顯著降低（Plt;0.05）。隨著氮添加水平的增加，類球囊霉科（Paraglomeraceae），近明球囊霉科（Claroideoglomeraceae）相對豐度變化不顯著，球囊霉科（Glomeraceae），巨孢囊霉科（Gigasporaceae），原囊霉科（Archaeosporaceae），雙型囊霉科（Ambisporaceae）相對豐度呈現先上升后下降的趨勢，但變化不顯著。

2.3" 不同氮添加水平對叢枝菌根真菌群落多樣性的影響

對α多樣性進行分析，以Chao1和Pielou_e指數表征群落物種豐富度，Shannon和Simpson指數表征群落物種多樣性。由圖2（a）～2（d）可知，隨著氮添加水平的增加，不同處理之間，Shannon，Pielou_e，Simpson指數變化不顯著;在N5和N10處理下，Chao1指數顯著降低（Plt;0.05）。對β多樣性進行分析，由圖3所示，相較于對照，N5處理下，AMF群落多樣性差異不顯著，而在N10和N15處理下，AMF群落多樣性差異顯著（Plt;0.05）。

2.4" 不同氮添加水平叢枝菌根真菌與土壤化學成分的相關分析

在科分類水平上，將不同氮添加處理下土壤AMF群落結構組成與8個環境因子（全氮、全碳、全磷、pH值、碳氮比、硝態氮、銨態氮、有機碳）進行RDA分析。結果如圖4所示，土壤銨態氮，硝態氮，有機碳含量是影響AMF群落結構的關鍵因素（Plt;0.05）。

將不同氮添加處理下土壤AMF群落各科相對豐度與土壤化學成分（銨態氮、硝態氮、pH值、有機碳、全碳、全氮、全磷）進行相關分析，結果如圖5，球囊霉科（Glomeraceae）豐度與土壤全氮含量呈顯著正相關關系；巨孢囊霉科（Gigasporaceae）豐度與土壤銨態氮呈顯著正相關，與硝態氮和全磷含量呈顯著負相關；原囊霉科（Archaeosporaceae）豐度與土壤硝態氮含量呈顯著負相關；雙型囊霉科（Ambisporaceae）豐度與土壤全碳，全氮含量呈顯著正相關關系（Plt;0.05）。

3" 討論

前人的研究已證實高寒草甸生態系統中氮是主要限制因素［24］，而氮添加引起土壤氮可利用性上升，將對AMF共產生一系列顯著影響。本研究通過探究不同氮添加水平下土壤化學成分和AMF的變化規律及其關系，為預測全球大氣氮沉降背景下青藏高原土壤AMF多樣性的未來變化提供理論依據。

3.1" 不同氮添加水平對土壤化學成分的影響

本研究中，不同氮添加改變了土壤的性質。首先，在N15處理下，氮添加會顯著降低土壤全磷的含量，這與草地生態系統原位氮添加試驗的結果一致［25］。在氮添加的條件下，土壤pH值降低促進無機磷溶解為植物可利用的有效磷，但植物的生物量增加，對土壤中磷的吸收增加，因此，土壤中全磷的含量降低［26］。本研究中，在N5和N10處理下，pH值均顯著降低，表明氮添加會使土壤酸化，這與多數氮添加試驗結果一致［27-29］。隨著氮的添加，硝化反應等作用下產生的氫離子與土壤膠體表面吸附的鹽基離子發生交換，導致氫離子吸附聚集在土壤膠體表面［30］，改變植物對離子的吸收以及改變土壤中鹽基離子濃度從而導致土壤的酸化［31］。土壤SOC是土壤極其重要的組成部分，對地球的碳循環有重大的影響［32］。本研究的氮添加下，土壤SOC的含量呈現增加趨勢。關于氮添加對土壤SOC的影響的研究，目前結論不一致，有研究表明，當微生物長期處于酸性環境中會調節自身代謝過程，改變對土壤養分的吸收，維持生物量的碳氮比，進一步影響土壤的碳氮平衡［33］。也有研究表明，氮添加雖然使土壤SOC含量無明顯差異，但土壤有機碳各組分的相對含量發生改變［34］，氮添加對碳組分含量的不同影響可能與養分添加量、試驗地原有的養分有效性以及植被類型有關。

3.2" 不同氮添加水平對叢枝菌根真菌群落的影響

相對豐度反映了一定環境條件下物種的組成。本研究中，多樣孢囊霉科（Diversisporaceae）相對豐度在N5和N15處理下顯著降低，這可能與多樣孢囊霉科對氮添加表現出明顯的厭氮性有關，由于多樣孢囊霉科可以促進細胞壁的溶解，因此施加氮肥降低了該科對土壤有機質的降解，導致其相對豐度降低［35］。此外，研究還發現，不同氮添加水平對AMF群落中不同科相對豐度的影響不相同，其中類球囊霉科（Paraglomeraceae）和球囊霉科（Glomeraceae）相對豐度變化不顯著，前人研究表明類球囊霉科（Paraglomeraceae）是青藏高原高寒草甸地區AMF群落的組成核心，該科具有穩定的種群結構，說明AMF群落在不同環境條件都有一個保守的核心物種［36］；同時還有研究表明球囊霉科（Glomeraceae）是我國北方的常見真菌，且它的分布范圍廣泛，能夠耐受較大幅度的生境變化，其生態幅寬，侵染能力強［37］，因此這兩科相對豐度變化不明顯。球囊霉科（Glomeraceae）、巨孢囊霉科（Gigasporaceae）、原囊霉科（Archaeosporaceae）、雙型囊霉科（Ambisporaceae）相對豐度呈現先上升后下降的趨勢，這可能是因為青藏高原高寒草甸土壤中植物和AMF生長均受氮限制，因此適量氮添加可以提高植物的生產力，從而將更多的光合產物分配給AMF，促進了AMF的增長。但是，當氮繼續增加時，植物生長不再受氮限制，降低了對AMF的依賴性［38］，AMF得到的光合產物減少，導致豐度降低。再者，隨著氮添加水平的提高，對光合產物需求上的較大差異導致不同的AMF類群對氮添加產生不同響應［39］，所以各科相對豐度產生了不同變化。

關于氮添加對AMF群落多樣性的影響，在亞高山草地的一項研究發現氮添加并不改變AMF的多樣性，但會顯著改變AMF的群落結構［40］。本研究中，在N5和N10處理下，Chao1指數顯著降低，說明AMF群落豐富度降低。Shannon，Pieloue，Simpson指數變化不顯著，說明AMF群落多樣性穩定，這可能與氮添加的年限有關，有研究認為，短期氮沉降試驗對土壤AMF多樣性沒有顯著性影響［41］。氮對AMF群落多樣性的影響可能有以下幾種機制，首先，低的土壤pH值利于菌絲密度較低的AMF生長繁殖［42］。其次，由于不同的AMF對于對土壤環境有偏好性，對養分添加的響應不同，也會導致物種之間優勢種的更替，導致豐富度降低。PCoA分析表明，在N10和N15處理下，AMF的β多樣性發生顯著改變，說明群落結構發生了一定的變化，這與一項在荒漠草原的研究結果相近［43］。

3.3" 不同氮添加水平下叢枝菌根真菌的影響因素

AMF群落組成與結構與土壤化學成分密切相關。AMF群落結構與環境因子的RDA分析得出，土壤銨態氮，硝態氮，有機碳顯著影響AMF群落組成，這與之前的研究基本相似［44］。這是因為在青藏高原高寒地區，植物養分受氮限制，氮肥的施入，使得土壤中硝態氮和銨態氮含量上升，這兩種無機氮更容易被植物吸收，減少植物對AMF的依賴，造成AMF群落結構發生變化。AMF和土壤SOC相互影響，一方面AMF可以維持土壤團聚體的形成與穩定性，增加碳的固存；另一方面，SOC的增加可以提供AMF生存所需要的資源，促進AMF分枝，提高對植物的侵染能力［45］。此外，有研究認為磷含量與AMF有著密切的聯系，一定范圍內的有效磷會促進AMF的生長，而過高的有效磷含量會抑制其生長和發育，不利于菌根效應的發揮［46］，本研究中，雖然磷含量對于AMF群落整體沒有顯著相關性，但是明顯影響了巨孢囊霉科（Gigasporaceae）的相對豐度。總的來說，僅關注某種養分元素對AMF群落的影響是片面的，應結合地上、地下生態系統及其養分循環和植物、土壤等多方面因素，綜合評價AMF生長及其群落組成和多樣性對不同氮添加的響應。

4" 結論

綜上，隨著氮添加水平增加，土壤全磷含量和pH值顯著降低，土壤硝態氮含量顯著上升。青藏高原高寒草甸土壤中的優勢AMF科是類球囊霉科（Paraglomeraceae）。氮添加顯著降低多樣孢囊霉科（Diversisporaceae）的相對豐度，并顯著改變了AMF群落的豐富度。冗余分析表明，土壤銨態氮，硝態氮和有機碳含量是影響AMF群落的關鍵因素。本試驗探究了不同氮添加水平下AMF群落變化及驅動因子，以期預測全球大氣氮沉降背景下青藏高原高寒草甸土壤AMF多樣性的未來變化提供理論依據。

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（責任編輯" 劉婷婷）