缺血性腦卒中的中西醫動物模型研究進展

摘要" 缺血性腦卒中是臨床常見的腦血管疾病，具有發病率高、致殘率高、死亡率高、復發率高的特點，嚴重威脅人類健康。為研究缺血性腦卒中發生發展的病理機制，尋找更加有效的治療手段，建立合適的動物模型必不可少。現代醫學多從病因角度進行造模，以各種方式阻斷大腦中動脈血流來造成腦缺血。中醫學注重辨證論治，建立病證結合動物模型以模擬不同證型腦卒中病人的臨床表現。現對缺血性腦卒中動物模型研究進展進行綜述，以期為缺血性腦卒中模型的制備與治療研究提供參考。

關鍵詞" 缺血性腦卒中；動物模型；病證結合；綜述

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2024.16.015

缺血性腦卒中是指血栓等造成腦血管狹窄或堵塞，腦血流灌注下降，引起腦組織缺血、缺氧，神經功能缺損，臨床表現為猝然昏倒、不省人事、肢體障礙、言語障礙等癥狀［1］。《中國卒中報告2020（中文版）》顯示，卒中居2019年我國城鄉居民死亡原因的第3位，給我國醫療衛生和社會經濟發展帶來了沉重的負擔，成為危害國民健康的重要因素。2019年我國有394萬例卒中新發病例，219萬例死于卒中，其中缺血性腦卒中占比高達82.6%［2］。缺血性腦卒中按病因分型主要有大動脈粥樣硬化型、心源性栓塞型、小動脈閉塞型等，西醫學造模時多采用線栓法、開顱法、光化學栓塞法、內皮素-1法、栓子栓塞法等。缺血性腦卒中在中醫學屬于中風病范疇，根據病人神志情況分為中臟腑與中經絡，證型可分為肝陽上亢證、風痰阻絡證、痰熱腑實證、血瘀毒損證、氣滯血瘀證、氣虛血瘀證、腎陽虛損證、陰虛風動證等。為研究針對缺血性腦卒中行之有效的治療方法，需要建立合適的動物模型，本研究將從西醫學目前常用的動物模型制備法及中醫病證結合動物模型的研究進展進行綜述。

1" 現代醫學

缺血性腦卒中根據缺血區域，可分為全腦缺血與局灶性腦缺血［3］，常用的制備方法有四血管閉塞法［4］、雙血管閉塞法［5］、三血管閉塞法［6］等。全腦缺血模型操作復雜，對全身血流影響較大，主要應用于全腦缺血的發病機制研究及相關藥物評價［7］。因其應用較少，本研究主要針對動物實驗中更常應用的局灶性腦缺血

基金項目" 國家重點研發計劃項目（No.2022YFC3501103）；河南省中醫藥拔尖人才培養項目，編號：豫中醫科教〔2018〕35號

作者單位" 1.河南中醫藥大學（鄭州 450046）；2.河南中醫藥大學第一附屬醫院（鄭州450000）

通訊作者" 趙敏，E-mail：byts1969@126.com

引用信息" 董紫琲，趙敏，劉飛祥，等.缺血性腦卒中的中西醫動物模型研究進展［J］.中西醫結合心腦血管病雜志，2024，22（16）：2968-2972.

模型展開論述。

1.1" 線栓法

線栓法制備大腦中動脈閉塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型是目前廣泛應用的局灶性腦缺血標準模型。Koizumi等［8］于1986年首次提出利用線栓法制備腦缺血動物模型，將連接手術線的栓子放置在大鼠右頸內動脈（internal carotid artery，ICA）分支，線栓逐漸閉塞血流，引起右大腦中動脈（middle cerebral artery，MCA）區域的大面積腦梗死。線栓移除后，缺血區域的血流可進行再循環，形成可以恢復血流的大鼠腦梗死模型。之后Longa等于1989年進行改良，將頂端燙成光滑圓球的4-0尼龍線插入頸內動脈，以阻斷大腦中動脈的血流供應，通過中斷頸外動脈（external carotid artery，ECA）的所有分支和頸內動脈的所有顱外分支來減少側支血流量，并創建神經功能缺損評分進行模型驗證［9］。李勇等［10］對比通過頸總動脈（common carotid artery，CCA）和頸外動脈線栓法制備的MCAO模型，發現在神經功能缺損、腦梗死率以及血腦屏障的通透性方面，兩種術式并無明顯差異，而頸總動脈線栓法相比之下操作方便、模型成功率更高，但再灌注后存在更明顯的微循環障礙。

線栓法具有不需開顱、對指標影響較小、缺血部位穩定、缺血及再灌注時間可控等優點，缺點為動物個體差異、線栓的類型及插線的深度不同都可能影響建模的成功率。

1.2" 開顱法

開顱法是指通過外科手術的方式，打開顱骨后切開硬腦膜，暴露大腦中動脈及附近相應區域，通過直接閉塞腦血管來建立局灶性缺血性腦卒中動物模型。通過閉塞血管的手法不同，常分為電凝法、夾閉法、結扎法等。Robinson等［11］首次提出利用開顱電凝法制備缺血性腦卒中模型；Tamura等［12］在顯微鏡下通過顳下頜關節進行開顱，閉塞大腦中動脈造成缺血性腦梗死，發現以大腦皮質、尾狀核缺血最明顯。電凝法不能實現缺血后再灌注，且對操作者技術要求較高，現已較少應用。

夾閉法主要為開顱后暴露出大腦中動脈，用動脈夾夾閉一定時長，建立MCAO模型［13］。有研究改良為將實驗動物麻醉后，切開頸前皮膚，分離出兩側頸總動脈，用無創動脈夾夾閉頸總動脈，制作出局灶性腦缺血模型［14］。夾閉法優點為操作簡單，可實現缺血后再灌注。結扎法為開顱后對大腦中動脈進行結扎處理，孫偉等［15］從胸骨上窩上緣做切口，分離出頸總動脈后進行結扎，發現相較Wistar大鼠，Sprague-Dawley大鼠存活率更高，可能與其有更豐富的側支循環網絡有關。結扎法對血管損傷較小，但對操作者技術要求較高。

1.3" 光化學栓塞法

Watson等［16］于1985年通過光化學栓塞法誘導可重復的血栓形成，導致大鼠腦梗死。具體操作方法：向實驗大鼠尾靜脈注射光敏染料孟加拉玫瑰后，通過用波長560 nm的綠光照射暴露顱骨的左頂骨20 min，誘導血管內皮細胞啟動凝血功能，導致被照射區血栓形成，建立大鼠腦梗死模型。李舒倫等［17］對光化學栓塞法進行改良，應用532 nm固定波長激光器定點照射骨窗10 min，利用胰島素針將玫瑰紅沿大鼠股靜脈注射，造模成功率達95%，并通過對比發現，玫瑰紅濃度為80 mg/kg時組織壞死持續時間較長，便于觀察腦缺血后病理變化。

光化學栓塞法具有操作相對簡單、梗死部位可控、可重復性高、死亡率較低等優勢，缺點在于不能實現缺血后再灌注。李鉆芳等［18］對比線栓法與光化學栓塞法兩種方法誘導大鼠腦缺血模型，并通過磁共振成像（MRI）檢測大鼠腦影像結構，發現線栓法模型適用于與功能恢復有關的預防、血管損傷保護或治療相關的長期觀察研究，而光化學栓塞法適用于疾病急性期或針對特定腦區的干預機制研究。

1.4" 內皮素-1（endothelin-1，ET-1）法

ET-1是一種由血管內皮細胞產生的內源性血管收縮活性物質，其通過強烈的血管收縮作用減少局部腦血流量，導致缺血性腦卒中。ET-1濃度與缺血區域的大小、嚴重程度、持續時間有直接關系，當ET-1濃度逐漸降低時，缺血區域可重新恢復血流灌注，形成腦缺血后再灌注動物模型［19］，適用于治療藥物的評估。張秀春等［20］向大鼠紋狀體、皮層注射ET-1制作腦缺血模型，判定標準為大鼠倒懸時右上肢向胸前屈曲，或行走時向右側傾倒、轉圈，且癥狀持續超過24 h。ET-1法優勢為操作簡便、損傷輕、死亡率較低，缺點為缺血后再灌注的時長難以人為控制，主要用于腦卒中后恢復機制及藥物治療作用的研究。

1.5" 栓子栓塞法

栓子栓塞法是指將血栓凝塊栓子或非血栓凝塊栓子注入血管模擬血管栓塞狀態，血栓凝塊栓子主要為自體或凝血酶誘導的體外血栓凝塊，非血栓凝塊栓子主要為硅膠、膠原蛋白、二氧化鈦等形成的微球或大球栓子，此外也有應用中藥提取物作為栓子。Zhang等［21］于1997年將自體血栓排在大腦中動脈起始部，栓子阻塞大腦中動脈而建立大鼠腦缺血模型。李楠等［22］將大鼠自體血凝結后研磨成60～100 μm血栓栓子，溶于制成混合液，沿頸外動脈注射進頸內動脈并計數，對比50個栓子組和100個栓子組發現，100個栓子組的大鼠梗死面積更大，程度更重。

Dong等［23］將膠原蛋白（7.5 mg/kg）和腎上腺素（300 μg/kg）的混合物注入小鼠的尾靜脈中，以制備腦缺血模型。Gao等［24］采用熒光微球注射到右側頸內動脈，同時移除阻塞頸總動脈的血管鉗，使273個微球移動到大腦動脈導致栓塞，評價標準為神經評分、前爪外伸和攀繩測試評分。郭云良等［25］以標準微球囊與自制微球囊盲插作為對照，并對比經頸總動脈或股動脈介入手術，利用標準微球囊導管阻斷大腦中動脈血流，建立獼猴大腦中動脈缺血模型，退出微球囊后大腦中動脈可再灌注；通過血管造影及MRI對比，發現經股動脈微球囊導管介入法成功率高，易標準化，且無需退出球囊即可通過微球囊導管向大腦中動脈注射微量藥物，便于開展藥物研究。

栓子栓塞法的優勢為栓子的類型及大小可選擇，血栓凝塊栓子引起腦缺血的機制與人類血栓栓塞相近，缺點為不同類型的栓子造模效果有差異，缺血程度難以控制。故此法更適用于評估溶栓、取栓相關治療。

2" 中醫病證結合模型

病證結合是陳可冀院士提出的辨病與辨證相結合的臨床研究模式，以實現中醫學與現代醫學的優勢結合［26］，臨床最常用的模式為現代醫學診斷疾病結合中醫辨證論治的現代病證結合模式。病證結合動物模型主要指西醫疾病與中醫證候結合的動物模型，這樣的模型既有西醫疾病的病理改變，又有中醫證候的特點［27］，更符合中醫學的整體觀念。

2.1" 肝陽上亢型

肝陽上亢證是常見的中風證型，葉天士提出“精血衰耗，水不涵木……肝陽偏亢，內風時起”，肝氣郁結，或肝腎虧虛，以致陰虧于下，肝陽亢盛，臨床常伴頭痛、面紅目赤、口苦咽干、心煩易怒等癥狀［28］。黃文權等［29］提出肝陽上亢型動物模型，應用多巴胺對大白兔進行靜脈注射，觀察性情變化及周圍血管充盈情況，造模后兔出現心率加快、皮膚潮紅等癥狀，可模擬肝陽上亢證的客觀表現。謝映［30］對實驗大鼠應用附子湯灌胃及高濃度鹽水飲水4周，在此基礎上應用線栓法阻塞大腦中動脈，形成缺血性中風肝陽上亢證大鼠模型。若出現捉持頸部時咬人、結膜充血、收縮壓≥200 mmHg、旋轉時間≤60 s可認為肝陽上亢證造模成功。

2.2" 風痰入絡型

若過食肥甘厚味，損傷脾胃，內生痰濕，加之臟腑陰陽失調，肝風夾痰，上擾腦絡而發為中風［31］。姚偉平［32］通過向模型組大鼠喂食高脂飼料復制痰證模型，灌服制附子湯劑以復制肝陽上亢證模型，腦梗死模型采用線栓法進行制備。大鼠模型疾病的評價為神經功能缺損評分，證候的評價標準為出現痰證、肝陽化風證相關的癥狀體征。真方白丸子改善模型大鼠的癥狀、體征及微觀指標，可反證該模型確為腦梗死風痰入絡證大鼠模型。

2.3" 痰熱腑實型

痰熱腑實是中風病急性期的關鍵病機，有眩暈、舌紅苔黃、脈滑等痰熱癥狀，及大便不通等腑實癥狀，其嚴重程度與中風的預后相關［33］。高強［34］參考Longa改良的線栓法構建小鼠局灶性腦缺血再灌注損傷模型，給予小鼠高脂低纖維飲食4周，構建痰熱腑實證候模型，小鼠出現局灶性神經功能缺損的體征，并伴隨糞便干燥、眼口鼻分泌物增多、喉中痰鳴等癥狀時可認為造模成功。甘佳樂等［35］給予實驗大鼠高脂飲食1周，及自體糞便混懸液灌胃3 d，復制痰熱腑實證模型，腦缺血模型亦采用改良線栓法制備，成功標準為大鼠出現糞便干結、煩躁、毛色暗淡無光澤、鼻分泌物多、喉中痰鳴、肢體癱瘓等癥狀。

2.4" 血瘀毒損型

王永炎院士在中風發病理論基礎上提出“毒損腦絡”的病機假說，認為中風后毒邪與火熱、痰濕、血瘀等病理產物交雜，損傷腦絡，導致絡脈破損或瘀閉，腦神失養，形成竅閉神昏、半身不遂的病理狀態［36］。馬瑞雪等［37］采用Longa改良法構建急性缺血性腦卒中后腦缺血再灌注損傷模型，血瘀毒損證模型通過腹腔注射角叉菜膠制備，構建成功的標志為出現爪甲腫脹紅紫、黑尾現象、體溫呈增高趨勢。通過苦碟子注射液預處理后，急性缺血性腦卒中后腦缺血再灌注損傷血瘀毒損證模型大鼠的神經功能缺損情況較模型組減輕，驗證了病證結合動物模型的成功構建。王鳳麗等［38］通過線栓法復合腹腔注射角叉菜膠建立缺血性腦卒中火毒證大鼠模型，證型建立的標準為出現黑尾、舌色紫暗、舌下絡脈增粗、耳郭發紅、爪甲腫脹等瘀熱表現，接近臨床癥狀，提示制備了缺血性卒中火毒證大鼠模型。

2.5" 氣滯血瘀型

若病人平素肝氣不舒，氣機郁滯，則易血瘀，復因情志變化或其他外因刺激時易發為中風，瘀血阻滯脈絡更不利血行，發為氣滯血瘀證。

吳萬豐等［39］采用腎上腺素皮下注射聯合多種刺激的方法制作氣滯血瘀證動物模型，向大鼠連續14 d皮下注射腎上腺素，4 h后接受隨機刺激，刺激方式包括晝夜顛倒、0～4 ℃冰水游泳4 min、夾尾、束縛、懸尾，每天隨機給予1種刺激，15 d內每種刺激各進行3次，刺激結束后亦采用改良Longa線栓法制備MCAO模型。發現在腸道菌群物種組成方面，Bacilli菌可能是本證型的生物標志物。

2.6" 氣虛血瘀型

氣為血之帥，氣虛日久易致血脈瘀滯，中風病常見氣虛血瘀證。一項針對2 558例缺血性腦卒中病人的中醫證候研究顯示，氣虛血瘀證病人占比高達58.87%［40］，故建立與人類疾病特點相似的動物模型至關重要。吳萬豐等［39］對大鼠進行力竭游泳法進行訓練，出現游泳動作失調、水淹沒鼻尖、身體下沉超過10 s不能浮出水面時視作大鼠力竭，連續游泳21 d后采用改良Longa線栓法阻塞大鼠右側大腦中動脈來制備MCAO模型，并通過對比發現，Sutterella菌是氣虛血瘀證缺血性腦卒中模型大鼠腸道菌群特異性的主要菌屬。薛貝珊［41］在“饑則氣損”“勞則氣耗”的理論基礎上，對實驗大鼠進行食量控制及強迫游泳以模擬疲勞因素，持續14 d后進行線栓法制備MCAO模型，并根據線粒體功能變化探討氣虛血瘀證缺血性腦卒中的生物學內涵，補陽還五湯可能通過改善磷酸腺苷活化蛋白激酶（AMPK）/過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子1α（PGC-1α）/核呼吸因子-1（NRF-1）通路蛋白的表達保護線粒體功能，也可證實氣虛血瘀證動物模型的建立。

譚輝等［42］采用線栓法結合老齡、饑餓、疲勞、高脂飲食、低氧等多因素復合模擬制備大腦中動脈閉塞缺血再灌注氣虛血瘀證模型，大鼠模型評價標準包括神經功能缺損評分、氣虛證及血瘀證評分：與正常組大鼠相比，模型大鼠在激光多普勒儀檢測下局部腦血流量降低，神經功能缺損、腦梗死體積增大、空間認知功能降低，且凝血功能亢進，纖溶功能降低，與缺血性梗死的病理表現相符，說明缺血性腦卒中的疾病模型復制成功；模型大鼠的氣虛證評分和血瘀證評分升高，有明顯氣虛、血瘀的癥狀表現，可證明在同時結合中醫多因素復合模擬干預下，模型大鼠出現了氣虛血瘀的“證模型”；同時，通過益氣活血方藥的干預，出現了相應指標的反應性改變，表明益氣活血方藥反證模型大鼠符合病證結合的表現。王磊沙等［43］根據“勞則氣耗”的理論基礎，注射海藻酸鈉微球建立多發性腦梗死大鼠模型，在此基礎上通過多因素復合建立氣虛血瘀證大鼠模型，3個病證結合組分別采用力竭游泳、睡眠剝奪、力竭游泳聯合睡眠剝奪，評價指標包括中醫證候指標（體質量、抓力、脈搏、舌象等）和西醫生化指標（血液流變學、凝血4項等），發現睡眠剝奪法更適合建立腦梗死氣虛血瘀證病證結合大鼠模型。

針對動物模型的評價，陳進成等［44］提出在中醫“四診合參”的指導下，綜合證候標準及實驗室指標，建立病證結合動物模型的評價標準。羅慧等［45］采用改良后的大腦中動脈線栓法對雄性大鼠進行造模，神經缺損嚴重程度根據評分進行，評分＞0分即為出現神經缺損，評分越高表明缺損程度越嚴重，即為完成缺血性腦卒中疾病模型的建立。氣虛證動物模型診斷標準依據《中醫內科學》中缺血性腦卒中氣虛證的診斷指標、文獻查閱、團隊前期研究基礎，形成針對缺血性腦卒中氣虛證動物模型的評價指標。具體診斷指標包括量化指標及宏觀指標，量化指標指體質量、抓力、曠場最大移動距離，宏觀指標包括精神狀態、膚色、飲食量等，手術組大鼠若能滿足2項或3項量化指標較假手術組顯著降低，同時宏觀指標有至少1項氣虛證表現，即可認為建立了氣虛證動物模型。

2.7" 腎陽虛損型

老年人肝腎不足，中風后易出現腎陽虛證，表現為神疲乏力、形寒肢冷、小便清長等臨床癥狀。孫詩杰［46］通過連續21 d向大鼠腿部肌肉注射氫化可的松琥珀酸鈉注射液建立腎陽虛證大鼠模型。評價標準為出現體質量下降、皮毛色澤暗淡、精神萎靡、行動緩慢等陽虛癥狀，客觀評價指標包括環磷酸腺苷（cAMP）含量降低、鳥嘌呤核糖苷（cGMP）含量升高，或cAMP/cGMP的比值降低，認為腎陽虛證大鼠模型造模成功。在腎陽虛證動物模型的基礎上，參照改良的Longa線栓法，建立大鼠永久性右側大腦中動脈栓塞模型，形成基于病證結合的缺血性腦卒中腎陽虛證大鼠模型。通過溫陽逐瘀湯干預后，大鼠腎陽虛癥狀較前減輕，可證實腎陽虛證模型的成功建立。

2.8" 陰虛風動型

肝腎虧虛于下，陰不制陽，引起陽氣偏亢，發為中風，其本質在于陰氣虧虛，制作動物模型時一般采用傷陰的方式。

為模擬急躁易怒、多汗、烘熱等陰虛證候的臨床表現，有實驗應用甲狀腺素聯合利血平，以及用四氯化碳（CCl4）花生油液、甲狀腺素結合夾尾情志刺激法等方法進行造模［47］。孫曉霞等［48］根據“熱盛傷陰”理論，對小鼠連續4周灌服傷陰藥物來制作陰虛證模型。證型評價指標包括曠場實驗、提問、飲水量、唾液流率、皮膚含水量、糞便含水量、24 h尿量、體重、食量、拉力。

3" 小" 結

隨著科技的不斷發展，缺血性腦卒中動物模型的實驗制備已逐漸完善。在實驗動物的選擇方面，大鼠因其飼養成本低、血管生理解剖結構與人類相似等特點，得到廣泛應用，但大鼠腦梗死后只會出現暫時性偏癱，康復過程與人類差異較大［49］，導致實驗結果難以向臨床轉化。臨床缺血性腦卒中病人多為中老年，且常存在高血壓、高血脂、動脈粥樣硬化等高危因素，但實驗動物多為健康成年大鼠，飼養條件穩定，不能準確模擬人體狀態。

中醫方面，多數實驗采用注射藥物或多因素模擬進行證候模型的制備，在此基礎上采用線栓法造成大腦中動脈閉塞，以此制備缺血性腦卒中疾病模型，評價標準除神經功能缺損評分外，多以出現對應證候的癥狀作為證型判斷標準，少數實驗采用客觀指標。若經對應方藥的治療后，實驗動物較前明顯好轉，也可證實證型的成功建立，這也是中醫學“以方測證”思想的體現。在病證結合模型評價方面，尚無統一標準，需建立缺血性腦卒中病證結合動物模型的評價體系，以滿足研究需要。

因此，缺血性腦卒中動物模型的制備除了不斷改良操作手段外，還要考慮實驗動物的選擇、評價指標的規范，以及臨床病人多有共病的現實問題。同時應積極構建規范化的缺血性腦卒中病證結合動物模型，并與代謝組學、蛋白組學等生物學技術結合［50］，為病證結合動物模型的建立及中醫藥的合理運用提供依據。

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（收稿日期：2023-03-22）

（本文編輯王麗）