WGCNA聯合機器學習法探究缺氧與慢性髓系白血病潛在靶點與作用機制研究

摘要：目的" 通過WGCNA聯合機器學習法鑒定缺氧與慢性髓系白血病（CML）潛在關鍵基因，并探討關鍵基因與CML中22種免疫細胞的組成和成分分布。方法" 將高通量基因表達數據庫（GEO）中的兩個CML數據集（GSE5550和GSE24739）進行整合，消除批次效應。采用微陣列數據線性模型（LIMMA）在25例CML和16例對照中對200個缺氧基因進行差異分析。采用加權基因共表達網絡分析（WGCNA）篩選出相關模塊，聯合SVM-RFE分析和LASSO回歸模型篩選關鍵基因。三種算法做Venn分析。免疫浸潤中的CIBERSORT算法評估CML中22種免疫細胞組分的組成模式以及關鍵基因與22種免疫細胞相關性。結果" 共鑒定出34個與CML相關缺氧基因，其中14個基因上調，20個基因下調。GO富集顯示，與長鏈脂肪酸轉運途徑、血管傷口愈合、B細胞穩態、負調節淋巴細胞凋亡以及蛋白酶結合途徑相關。KEGG分析顯示，缺氧誘導因子1（HIF-1）信號通路、剪切應力和動脈粥樣硬化信號通路明顯富集。ANXA2被鑒定為CML進展中的關鍵基因，表達水平較正常血液標本明顯上調（Plt;0.01），ANXA2在CML診斷模型中表現出較強的預測能力（AUC=0.820，95%CI=0.692～0.935）。免疫細胞浸潤分析顯示，ANXA2與漿細胞、細胞毒性T細胞、巨噬細胞M0型和肥大細胞活化等相關。結論" 缺氧基因ANXA2可作為CML的免疫檢查點，可能在CML的進展中起到生物學標志物的作用。

關鍵詞：慢性髓系白血病;缺氧;WGCNA;膜聯蛋白A2

中圖分類號：R733.72" " " " " " " " " " " " " " " " " " "文獻標識碼：A" " " " " " " " " " " " " "DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2024.19.001

文章編號：1006-1959（2024）19-0001-10

Study on the Potential Targets and Mechanism of Hypoxia and Chronic Myeloid Leukemia

by WGCNA Combined with Machine Learning Method

FENG Xiaoyun1，QIN Yufeng2，LUO Qingyuan1，MO Jun1，HUANG Xiaobin1，ZHANG Peng1

（1.Center of Tissue Engineering and Stem Cell，Guizhou Medical University，Guiyang 550004，Guizhou，China;

2.Department of Prosthetic Implantology，Affiliated Stomatological Hospital of Guizhou Medical University，Guiyang 550004，Guizhou，China）

Abstract：Objective" To identify the potential key genes of hypoxia and chronic myeloid leukemia （CML） by WGCNA combined with machine learning method， and to explore the composition and distribution of key genes and 22 immune cells in CML.Methods" Two CML datasets （GSE5550 and GSE24739） in the high-throughput gene expression database （GEO） were integrated to eliminate batch effects. The microarray data linear model （LIMMA） was used to analyze the differences of 200 hypoxia genes in 25 CML patients and 16 controls. The related modules were screened by weighted gene co-expression network analysis （WGCNA）， and the key genes were screened by SVM-RFE analysis and LASSO regression model. Three algorithms do Venn analysis. The CIBERSORT algorithm in immune infiltration was used to evaluate the composition pattern of 22 immune cell components in CML and the correlation between key genes and 22 immune cells.Results" A total of 34 CML-related hypoxia genes were identified， of which 14 genes were up-regulated and 20 genes were down-regulated. GO enrichment showed that it was related to long-chain fatty acid transport pathway， vascular wound healing， B cell homeostasis， negative regulation of lymphocyte apoptosis and protease binding pathway. KEGG analysis showed that hypoxia-inducible factor 1 （HIF-1） signaling pathway， shear stress and atherosclerosis signaling pathway were significantly enriched. ANXA2 was identified as a key gene in the progression of CML， and its expression level was significantly higher than that of normal blood samples （Plt;0.01）. ANXA2 showed strong predictive ability in CML diagnostic model （AUC=0.820， 95%CI=0.692-0.935）. Immune cell infiltration analysis showed that ANXA2 was associated with plasma cells， cytotoxic T cells， macrophage M0 type and mast cell activation.Conclusion" Hypoxia gene ANXA2 can be used as an immune checkpoint of CML， which may play a role as a biological marker in the progression of CML.

Key words：Chronic myeloid leukemia;Hypoxia;WGCNA;Annexin A2

慢性髓系白血病（chronic myeloid leukemia， CML）是骨髓中髓細胞惡變產生大量異常粒細胞所導致的一種疾病。生理學上，骨髓顯示平均氧分壓在5%～7%[1]。在CML進展過程中，由于腫瘤細胞的快速增殖減少了O2的擴散，以及腫瘤內異常血管的灌流受損，導致了低氧條件的形成[2]。研究表明[3]，腫瘤組織中的氧分壓低于1.3%，遠低于生理性氧分壓。骨髓組織結構至少由兩個不同的龕結構組成，其中骨髓內膜龕是骨髓中最缺氧的區域，靠近骨骼。而血管龕氧合較高，靠近血管[4]。在骨髓造血干細胞（hemopoietic stem cell， HSC）微環境中，氧分壓是重要環境因素，缺氧導致了骨髓HSC不能獲得充分氧或者不能利用氧時的增殖抑制現象[4]。缺氧誘導因子1亞基α（hypoxia inducible factor 1 subunit alpha， HIF1α）是缺氧相關的關鍵分子，在內膜邊緣高表達，而在血管龕中低表達。HSC主要定位于具有骨髓內膜龕的骨髓，表明缺氧信號傳導在干細胞代謝和調節干細胞生物學方面發揮著重要作用，有助于維持白血病中干細胞的存活和正常造血功能[5]。CML缺氧特征與腫瘤免疫抑制和免疫逃逸之間存在關聯，缺氧會降低NK細胞的自然殺傷能力，免疫系統的改變會影響CML患者的預后[6]。CML患者免疫細胞亞群存在顯著異質性，與正常血液相比，CML患者血液的免疫特征是CD3+T細胞、輔助性T細胞和CD45+記憶T細胞增加。但CML骨髓微環境中免疫細胞浸潤景觀特點尚不清楚[7]。ANXA2是一種鈣依賴性磷脂結合蛋白，在各種真核細胞中普遍表達。研究表明[8]，缺氧誘導因子-1（hypoxia inducible factor， HIF-1）可誘導ANXA2的表達，促進細胞的信號轉導和新生血管生成，但ANXA2在CML中缺氧環境下的作用并不清楚。本研究旨在通過生物信息學篩選CML患者骨髓的缺氧關鍵基因ANXA2，并進一步分析關鍵基因在CML患者骨髓的免疫細胞浸潤特點，以期為CML的免疫治療提供潛在的可能靶點。

1資料與方法

1.1 CML微陣列數據" 在GEO（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）下載關于CML的GSE5550和GSE24739 mRNA表達譜數據。200個缺氧基因來源于分子特征數據庫v7.0（MSigDB7.0，www.gsea-msigdb.org）。GSE5550包含9例CML患者和8例正常對照的血液標本，GSE24739包含16例CML患者和8例正常對照組的血液標本。

1.2 CML缺氧差異表達基因的數據處理與鑒定" 利用R對兩個原始數據集進行預處理，包括背景校正、歸一化和log2轉換。當多個探針對應一個共同基因時，取其平均值作為表達值。此外，Bioconductor的代理變量分析“SVA”包用于去除兩個數據集之間的批次效應和其他不必要的變異。最后，利用“LIMMA”包篩選缺氧與CML差異基因（differentially expressed genes， GEGs）。其中Plt;0.05，|log2 Fold change （FC）|gt;0.5作為篩選DEGs的條件。

1.3 CML中缺氧DEGs功能富集分析" 根據基因本體論（gene ontology， GO）和京都基因與基因組百科全書通路（Kyoto encyclopedia of genes and genomes， KEGG）分析CML中缺氧DEGs的功能富集情況，通過R包中的“clusterProfiler”和“DOSE”包完成。Plt;0.05作為顯著性的富集通路。

1.4潛在生物學標志物的篩選" LASSO是一種利用正則化方法提高預測精度的回歸分析算法，以確定候選基因集。通過R中的“glmnet”包完成LASSO回歸算法，確定與CML與骨髓健康樣本鑒別能力顯著相關的基因集。支持向量機（support vector machine， SVM）是一種監督式的機器學習技術，廣泛用于分類和回歸分析，為了避免過擬合，利用RFE算法從數據隊列中篩選最優基因。采用特征選擇之支持向量機遞歸特征消除（SVM recursive feature elimination， SVM-RFE）算法篩選合適的特征基因。根據基因之間的相互作用，應用加權基因共表達網絡分析（weighted gene co-expression network analysis， WGCNA）構建基因共表達網絡，以確定潛在的候選基因。樣本中超過25%變異基因將集成的數據集導入R語言中的“WGCNA”模塊。為了保證網絡構建結果的可靠性，對離群樣本進行剔除。采用選取-軟閾值函數，由共表達式相似度得到的軟閾值冪β計算鄰接度，然后將鄰接變換為拓撲重疊矩陣（topological overlap matrix， TOM），并計算相應的不相似度（1-TOM）。通過層次聚類和動態樹切函數進行模塊檢測。為了將表達譜相似的基因分類到基因模塊中，根據基于TOM的相異度度量進行平均連鎖層次聚類，基因樹狀圖的最小大小基因組為50。對與臨床屬性相關的模塊，計算模塊隸屬度（module membership， MM）和基因顯著性（gene significance， GS）。將特征基因網絡可視化，模塊中的基因信息用于進一步分析。本研究的篩選方式在于將LASSO分析、SVM-RFE算法和WGCNA分析做進一步Venn分析，得到CML缺氧相關基因ANXA2。

1.5 ANXA2的表達及診斷意義" 通過R中的“ggplot2”和“ggpubr”可視化ANXA2差異表達。為了進一步了解ANXA2對CML的臨床診斷意義，通過“pROC”包計算受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve， ROC）曲線下面積（area under curve， AUC）。當AUCgt;0.7時，表示臨床診斷準確性較高。

1.6免疫細胞浸潤分析" CIBERSORT分析的計算方法是一種建立在遺傳表達式基礎上的反卷積算法，用于評估一個基因組相對于樣本中其他基因的變化。借助CIBERSORT算法分析22個免疫細胞的免疫反應，并評估正常樣本和CML樣本中這些免疫細胞與ANXA2的相關性。為了量化CML中浸潤免疫細胞的相對比例，采用組織中不同免疫細胞類型的CIBERSORT方法分析合并表達數據和計算免疫細胞浸潤。以Plt;0.05為標準對樣品進行過濾。并計算每種免疫細胞在樣本中的百分比，并用柱狀圖顯示。22個免疫細胞的熱圖使用“pheatmap”包制作。“vioplot”包用于比較和可視化CML和對照樣本之間的22個免疫細胞的水平。使用“corrplot”軟件包進行了相關熱圖，揭示ANXA2與22種浸潤免疫細胞的相關性。

1.7統計學方法" 本研究采用R語言4.2.0進行分析，相關語言包直接從Bioconductor（http：//www.bioconductor.org/）獲取，包括“SVA”“LIMMA”clusterProfiler”“DOSE”“glmnet”“WGCNA”“ggplot2”“ggpubr”“pROC”“pheatmap”“vioplot”和“corrplot”包。當Plt;0.05表明差異有統計學意義。

2結果

2.1 CML中缺氧DEGs的鑒定" 數據集GSE55235和GSE55457包含25個CML數據和16個對照數據。去除批處理效應后，通過Limma包共鑒定出34個缺氧DEGs，其中14個基因顯著向上調（CHST2、LXN、TGM2、ANXA2、PFKP、ADORA2B、PLIN2、VEGFA、SLC37A4、CASP6、HK1、MIF、SDC4、SLC2A1），20個基因顯著下調（NDST2、COL5A1、TGFBI、RS2、BTG1、FOS、ZFP36、ISG20、PNRC1、NAGK、CXCR4、DUSP1、AKAP12、KLF7、EFNA1、BCL2、TNFAIP3、CCNG2、NR3C1、RRAGD）。缺氧DEGs的熱圖和火山圖見圖1。

2.2 CML功能富集分析" 通過R軟件包“ClusterProfil”對CML中34個缺氧DEGs的GO和KEGG進行分析，結果顯示34種缺氧DEGs主要參與化學引誘活性、趨化因子結合、纖連蛋白結合、14-3-3結合蛋白、C-C趨化因子結合、糖胺聚糖結合、蛋白酶結合、碳水化合物激酶活性、單糖代謝過程、白細胞增殖的調節、細胞對細胞外刺激的反應、B細胞增殖的正向調節、脂肪酸轉運、淋巴細胞凋亡過程的負調節、血管生成參與傷口愈合、B細胞穩態、血管傷口愈合以及長鏈脂肪酸轉運途徑。同時，KEGG表明HIF-1信號通路、剪切應力和動脈粥樣硬化通路明顯富集，見圖2。

2.3關鍵特征基因的篩選" 首先，針對可能的診斷因素，采用3種機器學習算法來預測CML診斷標志物。通過LASSO回歸算法對缺氧DEGs進行篩選鑒定，確定了10個變量作為CML的診斷標志（圖3A、3B）。進一步通過SVM-RFE算法（圖3C）在GEGs中識別出16個特征的子集。使用WGCNA算法識別基因共表達網絡模塊。首先，將基因從大到小進行排序，選擇方差前25%的基因進行分析。其次，應“flashClust”R軟件包進行聚類分析，將閾值設置為80個，然后檢測并剔除離群值樣本。第三，利用WGCNA軟件包中的“選擇軟閾值”功能，篩選出1～20之間的功率參數。本研究中選擇β=8（無尺度R2=0.85）的功率作為軟閾值，以確保一個尺度網絡（圖3D）。將閾值設置為0.25，以合并集群樹中的類似模塊，共獲得13個模塊，其中基因具有相似的共表達特征。隨機選擇所有模塊的顏色來區分不同的模塊。與其他模塊相比，特征基因（ME）表現出最高的正相關（R=0.64，P=7E-06，圖3E）。因此，包含357個基因的MEbrown模塊被確定為CML的關鍵模塊，并保留以供進一步分析。此外，對MEbrown模塊中基因模塊成員關系特定基因（module memberships， MMs）和模塊特征基因（gene significances， GSs）進行顯著性計算，結果顯示MM和GS之間的相關系數較高（Cor=0.5，P=4.8E-24，圖3F）。從集成數據集中篩選出的缺氧DEGs與MEbrown模塊中的基因交集為共同基因（圖3G），且MEbrown模塊的基因與CML相關。最終對WGCNA、LASSO和RFE三種算法進行取交集，獲得重疊特征基因為ANXA2（圖3H）。

2.4 ANXA2差異表達分析和ROC檢測" 根據ANXA2差異表達結果分析發現，與健康樣本相比，CML樣本中ANXA2的表達水平明顯上調，同時也表明ANXA2參與了CML的發生。ROC進一步分析發現，ANXA2在CML診斷模型中表現出較強的能力（AUC=0.820，95%CI=0.692～0.935），見圖4。

2.5免疫細胞浸潤分析" R語言中的CIBERSORT算法分析了CML每個樣本中22種免疫細胞的百分比，其中B祖細胞和B記憶細胞占比最高，中性粒細胞和嗜酸性粒細胞占比最低（圖5）。CML每個樣本中22種免疫細胞的免疫細胞浸潤熱圖顯示，GSM129066、GSM609348、GSM609359、GSM609361、GSM609364、GSM609366和GSM609367樣本中肥大細胞靜息比例顯著上調，GSM609348樣本中漿細胞與GSM609362中嗜酸性粒細胞也顯著上調，而其他樣本中免疫細胞則多數顯示下調或者沒有發揮作用（圖6）。免疫細胞浸潤差異的小提琴圖表明，與對照組相比，CML患者的濾泡輔助性T細胞水、初始CD4T細胞和初始B細胞顯著上調，而巨噬細胞M2顯著下調（圖7）。ANXA2與22種免疫細胞的相關性分析顯示，ANXA2與巨噬細胞M2型、泡輔助性T細胞呈負相關（R=-0.38，Plt;0.05，圖8）。且ANXA2與漿細胞、CD4記憶T細胞靜息、自然殺傷細胞靜息、巨噬細胞、樹突狀細胞靜息、樹突狀細胞活化、肥大細胞靜息和肥大細胞活化相關（圖9）。

3討論

盡管CML患者的十年生存有效期顯著提高，但仍然有部分患者表現出免疫抑制、耐藥性、骨髓抑制和胃腸道反應[9-11]。在CML患者中，腫瘤細胞的生長優勢導致產生比正常造血更成熟的細胞群，并且臨床進化更長。迄今為止，盡管大多數CML和小兒急性淋巴白血病（acute lymphoblastic leukemia， ALL）病例在治療下已治愈或得到良好控制，但仍有很高的復發風險[12-14]。缺氧誘導腫瘤微環境中多種促血管生成因子的表達能夠影響類似于HSC的白血病干細胞（leukemic stem cells， LSCs）的循環、靜止、分化、代謝和治療耐藥性。LSCs能夠與骨髓微環境相互作用，影響周圍細胞的表型，從而獲得更強的增殖潛力，使腫瘤繼續進展[15]。缺氧與LSCs之間的相關性提示，缺氧可能在調節腫瘤內異質性和免疫逃逸中發揮核心作用，信號通路可能和HIF1α相關[16]。缺氧還可以下調大多數NK細胞受體的表達和功能，這些受體直接負責對腫瘤細胞發揮細胞溶解活性[17]。

本研究通過WGCNA聯合機器學習法發現，ANXA2為缺氧與CML的共同關鍵基因。ANXA2是一種鈣離子依賴性的磷脂結合蛋白，在內皮細胞、巨噬細胞、單核細胞和各種類型的癌細胞表面表達。在C-末端結構域包含陰離子磷脂和鈣離子結合特性，而N-末端是翻譯后修飾和與其他蛋白質相互作用的部位，其功能涉及肌動蛋白重組、細胞信號轉導、胞吞、胞吐、轉錄、細胞膜構成、新生血管生成以及DNA復制與修復[18，19]。據研究報道[20，21]，ANXA2被認為是膀胱癌、透明細胞腎細胞癌、肝細胞癌和前列腺癌的生物標志物。在細胞表面，ANXA2異四聚體為纖溶酶原和組織型纖溶酶原激活物提供結合部位，將纖溶酶原轉化為纖溶酶，在腫瘤的增殖、侵襲和轉移中發揮重要作用[22]。本研究通過生物信息學分析發現，ANXA2在CML中表達上調;進一步通過ROC驗證發現，ANXA2有較高的臨床診斷價值，表明ANXA2參與了CML的發生和發展。目前，臨床關于ANXA2在CML免疫浸潤中的作用研究有限。通過CIBERSORT算法分析發現，ANXA2與漿細胞、CD4記憶T細胞靜息、自然殺傷細胞靜息、巨噬細胞、樹突狀細胞靜息、樹突狀細胞活化、肥大細胞靜息和肥大細胞活化相關，表明ANXA2的上調可能引發CML產生免疫反應，揭示ANXA2作為HIF1α下游效應分子具有潛在免疫靶向作用。

綜上所述，通過構建CML與缺氧相關的預后特征基因及免疫相關性，預測了ANXA2在CML中的潛在免疫作用，提示ANXA2可能是CML診斷的生物學標志物。但本研究仍存在一定的局限性，這項研究是通過計算機生物學回顧性研究的，仍需要更多的臨床樣本驗證和分子生物學實驗驗證。

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收稿日期：2023-09-25;修回日期：2023-10-11

編輯/杜帆

基金項目：1.國家自然科學基金地區科學基金項目（編號：81960036）;2.貴州省科技計劃項目（編號：黔科合基礎-ZK[2021]重點005）

作者簡介：馮小云（1998.11-），男，貴州貴陽人，碩士研究生，主要從事干細胞表觀遺傳學研究

通訊作者：張鵬（1987.4-），男，甘肅張掖人，博士，教授，博士生導師，主要從事干細胞表觀遺傳學研究