膠質母細胞瘤耐藥性基因篩選及治療藥物預測

摘要：目的" 運用生物信息學技術篩選膠質母細胞替莫唑胺（GBM TMZ）耐藥差異表達基因（DEGs），探尋關鍵耐藥基因及發病機制，并預測相關作用中藥。方法" 在GBM、GEO2R和GPEIA等多種數據庫基礎上進行生物學功能及通路富集分析，構建蛋白互作網絡篩選關鍵基因，檢索關鍵基因在正常人、膠質瘤患者組織中mRNA表達及生存率的影響。利用COREMINE平臺對關鍵耐藥基因構建藥物-活性成分-作用靶點網絡，篩選相關中藥活性成分。結果" 共篩選出293個DEGs，涉及FN1、CD44、CTGF、FOS等關鍵靶點，其表達顯著高于正常人，影響患者總生存率，是GBM有害預后因素，但不會影響無復發生存率。影響細胞粘附、神經系統發育、轉化生長因子β受體信號傳導和基因正向調節等生物學功能。經COREMINE預測發現，與FN1關系密切的干預藥物多歸屬肝經，性味多以清熱類和補虛類為主。結論" 篩選出12個與GBM TMZ耐藥相關的關鍵基因，FN1在TMZ耐藥發生發展中起重要作用，木香、青葉膽及蓖麻子的活性成分可能作為TMZ耐藥治療藥物來源。

關鍵詞：膠質母細胞瘤;替莫唑胺;耐藥基因;生物信息學;中藥預測

中圖分類號：R969" " " " " " " " " " " " " " " " " " " "文獻標識碼：A" " " " " " " " " " " " " " "DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2024.19.002

文章編號：1006-1959（2024）19-0010-09

Drug Resistance Gene Screening and Therapeutic Drug Prediction of Glioblastoma

CHU Xiaoling1，WU Bo1，LAN Xiaohong1，YI Jianfeng2，LI Xuemei1，CHEN Xuqing1

（1.Department of Pharmacy，Eastern Theater Command General Hospital，Nanjing 210002，Jiangsu，China;

2.Research Center for Differentiation and Development of Basic Theories of TCM，Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine，Nanchang 330004，Jiangxi，China）

Abstract：Objective" To screen differentially expressed genes （DEGs） of temozolomide （TMZ） resistance in glioblastoma cells （GBM） by bioinformatics technology， explore the key drug resistance genes and pathogenesis， and predict the related traditional Chinese medicine.Methods" Based on GBM， GEO2R， GPEIA and other databases， biological function and pathway enrichment analysis were carried out， and protein interaction network was constructed to screen key genes. The effects of key genes on mRNA expression and survival rate in normal human and glioma patients were searched. The COREMINE platform was further used to construct a drug-active ingredient-target network for key drug resistance genes， and the active ingredients of related Chinese medicines were screened.Results" A total of 293 DEGs were screened， involving key targets such as FN1， CD44， CTGF， and FOS. The expression was significantly higher than that of normal people， affecting the overall survival rate of patients， and was a harmful prognostic factor for GBM， but it did not affect the recurrence-free survival rate. While it affected biological functions such as cell adhesion， nervous system development， transforming growth factor β receptor signal transduction and gene positive regulation. It was predicted by COREMINE that the intervention drugs closely related to FN1 were mostly attributed to the liver meridian， and the nature and flavor were mainly heat-clearing and deficiency-tonifying.Conclusion" Twelve key genes related to TMZ resistance in GBM were screened out. FN1 plays an important role in the occurrence and development of TMZ resistance. The active components of Muxiang， Qingyedan and Bimazi may be used as the source of TMZ resistance drugs.

Key words：Glioblastoma;Temozolomide;Drug resistance genes;Bioinformatics;Traditional Chinese medicine prediction

膠質母細胞瘤（glioblastoma， GBM）是常見的原發性顱內惡性腫瘤（WHO IV級），其發病率占所有原發性中樞系統惡性腫瘤48%，盡管進行了十多年大量的研究，但GBM的預后仍然很差[1-3]。現階段，GBM標準治療以手術為主，輔以術后同步放化療。替莫唑胺（temozolomide， TMZ）因其口服吸收完全、生物利用度近乎100%、良好的血腦屏障通透性，以及突出的治療效果，已成為治療GBM首選藥物[4，5]。長期使用TMZ易產生耐受性，造成患者腫瘤復發率升高、中位生存期下降。因此，降低GBM TMZ耐藥是GBM臨床治療亟需解決問題。研究顯示[6]，GBM TMZ耐藥機制與DNA損傷修復、細胞自噬及膠質瘤干細胞等多途徑相關，而耐藥性發生發展中參與調控的主要基因及干預藥物尚不完全清楚。生物信息學是由分子生物學和信息技術結合而成一門新興交叉學科，基因表達譜或其他高通量數據的生物信息學分析在研究人類疾病發病機制中發揮了關鍵作用。本研究應用生物信息學技術篩選GBM TMZ耐藥關鍵基因，并對其進行中藥預測，旨在為研究GBM TMZ耐藥發生發展的分子機制和實驗研究提供理論依據。

1資料與方法

1.1數據來源" 基因數據庫：基因表達綜合數據庫（GEO）（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）、STRING數據庫（https：//cn.string-db.org/）、DAVID生物信息資源數據庫（https：//david.ncifcrf.gov/）、UniProtKB蛋白質數據庫（https：//www.uniprot.org/help/uniprotkb）、TCMSP中藥系統藥理學分析平臺（https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）、基因表達譜數據動態分析（http：//gepia.cancer-pku.cn/）和Coremine Medical數據庫（https：//www.coremine.com/）[7]。軟件工具包括：SangerBox生物醫學分析盒子（http：//vip.sangerbox.com/login.html）和Cytoscape3.9.1（Network Analysis和cytoHubba插件）。基因表達譜芯片來源于GEO數據中GBM數據集，編號：GSE68029，平臺信息GPL570[HG-U133_Plus_2] Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array由美國加州大學提供。

1.2 GBM/GBM-500 μM TMZ差異表達基因（DEGs）獲取及可視化處理" 利用GEO2R對GSE68029進行分析（實驗組為GBM-500 μM TMZ，對照組為GBM組），結果導出Excel文件，設置篩選參數（|log2FC|gt;0.5，Plt;0.05），得到DEGs[8]。利用Sanger Box中的工具模塊繪制DEGs火山圖及熱圖。

1.3 PPI網絡構建及關鍵基因篩選" 將DEGs上傳至STRING數據庫中，選擇“Multiple proteins”模塊，物種選擇“Homo sapiens”，combined scoregt;0.7，排除孤立點，導出CSV文件。將CSV文件導入Cytoscape3.9.1軟件行可視化處理，并用“Network Analysis”插件計算該網絡度值，設置篩選條件（關鍵基因度值gt;2倍平均度值），得到DEGs中的關鍵基因[9]。

1.4 DEGs功能富集分析" 將DEGs上傳到DAVID數據庫[10]，選擇“OFFICEL GENE SYMBOL”模塊，物種選擇“Homo sapiens”提交，得到基因本體論（GO）功能注釋和京都基因百科全書（KEGG）信號通路。GO功能注釋包含生物過程（biological process， BP）、分子功能（molecular function， MF）和細胞成分（cell component， CC），篩選條件為Plt;0.05。

1.5關鍵基因在膠質瘤中的表達及生存率影響" 在GPEIA數據庫中輸入關鍵基因，選擇“Single Gene Analysis”模塊，分析關鍵基因在正常人組織和膠質瘤組織的差異性表達;利用“Survival Analysis”模塊進行總生存率分析。

1.6預測潛在中藥并構建“中藥-活性成分-靶點”網絡" 依次在Coremine Medical數據平臺上輸入關鍵基因，檢索“Traditional Chinese medicine”模塊，設置篩選條件（Plt;0.05），得到潛在中藥并對其進行性味歸經分析。在TCMSP數據庫檢索中藥相關成分（設置篩選條件OB≥30%，DL≥0.18）及其對應靶點，用Cytoscape3.9.1行可視化處理。

2結果

2.1 GBM/GBM-500 μM TMZ差異表達基因獲取結果" 在GEO數據中檢索“glioblastoma”“temozolomide”“drug resistance”，獲得GSE68029芯片數據集（包括6例GBM和6例GBM-500 μM TMZ）。利用GEO2R在線分析軟件對其分組，用limma包分析該芯片基因表達，并用SangBox軟件繪制火山圖和熱圖，見圖1。共獲得差異基因293個，其中上調基因199個，下調基因94個。

2.2耐藥關鍵基因獲取" 借助STRING數據庫構建DEGs蛋白互作PPI網絡圖，下載分析結果，并用Cytoscape軟件可視化。排除孤立節點后，該網絡中有156個節點、273條邊，在DEGs蛋白互作（PPI）網絡圖中，形狀越大則連接度越大，見圖2A。隨后用“NetworkAnalyzer”插件分析該網絡，其中FN1、CD44、CTGF、FOS、EGR1、ZEB1、AURKB、KITGL、ARF6、ITGA3、CHD4和NCAM1的度值高于平均值（見圖2B），該網絡中關鍵基因連接度排序，連接度越大，表示該基因在網絡中起主要橋梁作用。在網絡中起著中藥重要橋梁作用，可能為介導膠質母細胞替莫唑胺耐藥關鍵靶點。

2.3基因本體論（GO）及KEGG信號通路富集分析結果" 將DEGs上傳至DAVID數據庫，進行生物學功能及通路富集分析。GO分析共獲76個條目，其中生物過程主要涉及細胞粘附、神經系統發育、細胞-基質粘附、轉化生長因子β受體信號傳導途徑的調節和基因正向調節等;細胞組成成分涉及絲狀體膜、染色質、膜和細胞表面等;分子功能涉及膠原蛋白結合、轉錄輔助因子結合和DNA結合等，見表1。KEGG信號通路主要富集在癌癥、細胞外基質受體相互作用、造血細胞系和磷脂酰肌醇3激酶信號通路等，見圖3。

2.4關鍵基因在正常組織和膠質瘤中的表達差異及總生存率（overall survival， OS）影響" 為探明關鍵基因參與調控GBM，借助GEPIA數據庫分析其在正常人、GBM患者組織mRNA表達及OS影響。GBM患者FN1、CD44、CTGF、FOS、EGR1和ZEB1表達明顯高于正常人（Plt;0.05），見圖4A～4F;GPEIA數據庫中FN1、CD44、CTGF、FOS、EGR1和ZEB1在正常組織與腫瘤組織中mRNA表達，左側方塊示腫瘤組織，右側方塊示正常組織。圖4G、圖4H顯示了高、低表達FN1對患者總生存率、無復發生率的影響：高表達的FN1顯著影響其總生存率，是GBM有害預后因素，但不會影響無復發生存率（Plt;0.05）。

2.5相關中藥及主要作用靶點預測分析" 在COREMINE平臺上檢索關鍵基因，得到密切關聯中藥（Plt;0.05）見表2。與FN1相關的中藥有木香（P=0.001 11）、蘄蛇（P=0.005 43）、蓖麻子（P=0.0188）和青葉膽（P=0.0195）;與CD44相關中藥有蔓荊子（P=0.001 06）、挖耳草（P=0.007 52）;與CTGF相關中藥是蘆莖（P=0.000 499）、關木通（P=0.000 511）和鵝不食草（P=0.003 07）;與FOS相關中藥有甜石榴（P=0.004）、梔子花（P=0.009 91）;與EGR1相關中藥有黃絲郁金（P=0.0111）、姜黃（P=0.0112）、新疆雪蓮（P=0.016）和黃連（P=0.0172）;與ZEB1相關中藥有挖耳草（P=0.001 68）、旋覆金沸草（P=0.006 24）、旋覆花（P=0.006 24）;與AURKB相關中藥有夏天無（P=0.001 26）、川貝母（P=0.003 01）;與KITLG相關中藥有羊腎（P=0.006 38）;與ARF6相關中藥是朝鮮淫羊藿（P=0.002 82）;與ITGA3相關中藥有金錢草（P=0.000 12）;與NCAM1相關中藥是沙苑子（P=0.009 37）。為探明中藥作用于FN1潛在活性化合物及主要靶點，在TCMSP數據庫檢索中藥成分及作用靶點，并構建“中藥-活性成分-作用靶點”網絡，符合篩選條件的化合物有21個，作用于70個靶點，見圖5A。該網絡主要靶點分別是MAOB、MAOA、HTR3A、DRD2、SLC6A4、HTR2A、ESR1和HSP90AA1。將預測中藥進行性味及歸經分析，結果顯示作用于關鍵基因中藥主要歸屬肝經，性味則偏苦、溫，以清熱類和補虛類為主，見圖5B和圖5C;主要靶點見圖5D。

3討論

近年來GBM TMZ耐藥相關報道呈逐漸上升趨勢，TMZ耐藥性受多基因、多通路介導[11-13]，尋找影響TMZ耐藥的關鍵基因、功能及干預藥物對于分子水平上揭示耐藥發生發展機制具有重要意義，也可為GBM的早期診斷及新治療策略的制定提供依據。本研究通過GEO數據庫篩選合適的基因芯片，對GBM和500 μM TMZ處理后GBM組織樣本進行DEGs分析，篩選出293個DEGs，包括上調基因199個和下調基因94個。DEGs的GO富集主要生物學過程集中在細胞粘附、神經系統發育、細胞-基質粘附、轉化生長因子β受體信號傳導途徑的調節和基因正向調節等。既往研究發現[14]，腫瘤細胞周圍微環境對化療藥物的反應有重大影響，細胞外基質蛋白賦予細胞粘附介導耐藥性產生，側面驗證了生物信息分析的可靠性。TGF-β1過表達導致MGMT啟動子低甲基化膠質母細胞瘤細胞在體外和體內中出現替莫唑胺耐藥性[11]。KEGG通路主要富集在癌癥、細胞外基質受體相互作用、造血細胞系和磷脂酰肌醇3激酶信號通路。多種生長因子、激素及細胞外基質等物質構成了腫瘤微環境，環境穩態改變影響腫瘤細胞活力、增殖、侵襲及對藥物敏感性[15]。因此，研究上述信號通路有助于探明GBM進展及其對TMZ的敏感性。

通過蛋白網絡互作得到關鍵基因，分別是FN1、CD44、CTGF、FOS、EGR1、ZEB1、AURKB、KITGL、ARF6、ITGA3、CHD4和NCAM1。表達上調的有FN1、CD44、CTGF、FOS、EGR1、ZEB1、AURKB、ARF6、ITGA3、CHD4和NCAM1，表達下調的是KITGL。GPEIA數據庫分析得出，FN1、CD44、CTGF、FOS、EGR1和ZEB1表達顯著高于正常人，可能參與調控GBM發生發展，直接或間接影響TMZ耐藥性。FN1顯著影響患者總生存率，是GBM有害預后因素，但不會影響無復發生率;其他基因對患者總生存率無明顯影響，但目前尚不能排除毫無作用。 FN1存在于細胞外膜蛋白，是細胞外基質和基底膜中的主要非膠原性糖蛋白，在細胞黏附中起著重要作用，可調節腫瘤細胞生長、繁殖和浸潤。近年來，研究報道[16，17]，FN1可誘導PTPRM甲基化通過STAT3信號促進GBM發生發展，且過表達FN1是GBM患者獨立的不良預后因素。黏附分子CD44（cd44 molecular， CD44）分布細胞表面跨膜糖蛋白，主要參與異質性粘附，即腫瘤細胞與宿主細胞和宿主基質的粘附，異質性粘附在腫瘤細胞侵襲轉移中起促進作用。結締組織生長因子（connective tissue growth factor， CTGF）是一種可刺激成纖維細胞增殖和膠原沉積生長因子，是高度保守CCN多肽家族中成員，高表達GTGF可誘導GBM細胞增殖、遷移和侵襲[18]。細胞致癌基因（cellular oncogene fos， FOS）作為一類核蛋白轉錄因子，在調控細胞生長、分裂、增殖、分化及程序死亡等方面具有重要作用。早期生長反應蛋白1（early growth response protein 1， EGR1）為早期反應基因家族最為重要一員，在組織損傷修復及腫瘤發生發展中扮演重要角色。Knudsen AM等[19]對207個GBM進行了EGR1/EGR3免疫染色和定量，EGR1表達隨著WHO等級增加而增加，EGR1沒有預后價值，但可能參與MGMT甲基化。Chen L等[20]采用呋喃二烯酮（FUR）體外抑制TMZ耐藥的GBM細胞，免疫熒光和雙熒光素酶結果示，抑制EGR1介導轉錄可能有助于FUR依懶性阻斷硫酸軟骨素蛋白多糖4（CSPG4）信號和GBM細胞存活。鋅指E盒結合蛋白1（zinc finger e-box-binding homeobox 1， ZEB1）是鋅指結構轉錄因子家族中的重要一員，可通過直接或間接抑制E粘附蛋白或極性蛋白表達，促使相互連接的上皮細胞轉化為可在細胞基質間移動的間質細胞，增加腫瘤侵襲和轉移能力。研究發現，ZEB1優先在侵襲性GBM細胞中表達，其中ZEB1-miR-200反饋回路通過下游效應子ROBO1、c-MYB和MGMT將這些過程相互連接。此外，膠質母細胞瘤患者中的ZEB1表達預示著較短的生存期和較差的替莫唑胺反應[21]。由此可見，通過生物信息學分析出的關鍵基因，對于研究GBM TMZ耐藥機制意義重大，并有可能成為新的潛在治療靶點。

為了挖掘潛在治療GBM TMZ耐藥中藥及其活性成分，從而達到精準治療目的。本研究將核心基因映射到Coremine Medical數據庫，篩選相關中藥并對其歸經和功效分析，發現藥物多歸屬肝經，多以清熱類和補虛類為主，與中醫對腦膠質瘤用藥基本一致。FN1在PPI網絡中起著主要橋梁作用，可能作為介導TMZ耐藥關鍵靶點。進而構建“中藥-活性成分-作用靶點”網絡，木香、青葉膽及蓖麻子的活性成分參與調控MAOB、MAOA、HTR3A、DRD2、SLC6A4、HTR2A、ESR1及HSP90AA1等基因，可能成為治療TMZ耐藥潛在中藥及候選靶點。

本研究利用生物信息學方法對于GBM TMZ耐藥機制進行分析，并預測耐藥關鍵基因所涉及的中藥，對于GBM TMZ機制研究及臨床用藥具有參考意義。本研究局限之處在于數據分析依賴于GEO數據庫，其中所納入樣本數量有限，對于結果分析可能造成偏倚，需要進一步實驗驗證。

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收稿日期：2023-10-18;修回日期：2023-10-25

編輯/肖婷婷

基金項目：國家自然科學基金項目（編號：82060739）

作者簡介：初曉玲（1981.11-），女，山東萊州人，本科，主管藥師，主要從事醫院藥學、中藥藥理研究

通訊作者：陳旭青（1981.6-），女，江蘇南京人，本科，主管藥師，主要從事醫院藥學、中藥藥理研究